Sistema di coltura d'organo per la valutazione della tossicità del trattamento intraoculare Eccipienti e prodotti farmaceutici

L'obiettivo di questo protocollo è valutare i cambiamenti nell'attività metabolica e nella funzione refrattiva del cristallino in risposta al trattamento sperimentale.

Essendo la principale causa di cecità, la cataratta è un onere significativo per le decine di milioni di persone colpite da questa condizione in tutto il mondo. L'esposizione chimica, tra gli altri fattori ambientali, è una causa accertata di cataratta. I test di tossicità oculare possono valutare se i prodotti farmaceutici e i loro componenti possono contribuire al danno al cristallino che può portare alla cataratta o aiutare il trattamento della cataratta.

Gli studi in vitro e i test in vivo sugli animali possono essere utilizzati per valutare la sicurezza delle sostanze chimiche prima degli studi clinici. Il test di Draize, l'attuale standard in vivo per i test di tossicità e irritazione oculare, è stato criticato per la mancanza di sensibilità e di misurazioni oggettive per determinare la tossicità oculare. I saggi in vitro basati su cellule sono limitati in quanto le colture cellulari non possono modellare in modo appropriato una lente funzionale intatta.

Il metodo qui descritto è un'alternativa in vitro sensibile ai test sugli animali, progettata per valutare la risposta del cristallino bovino intatto al trattamento sia a livello di attività cellulare che per le prestazioni refrattive complessive. Il reagente non tossico resazurina viene metabolizzato in proporzione al livello di attività cellulare. Il test laser scanner a lente misura la capacità della lente di rifrangere i fasci di luce incidenti in un singolo punto con un errore minimo, direttamente rilevante per la sua funzione naturale. Il metodo può essere utilizzato per determinare sia i cambiamenti acuti che quelli ritardati della lente, nonché il recupero della lente da esposizioni chimiche o ambientali.

La cataratta, che colpisce oltre 20 milioni di persone, è la causa più diffusa di cecità in tutto il mondo ^1,2. La cataratta è più comunemente dovuta a cambiamenti legati all'età del cristallino, ma è anche indotta da traumi, condizioni genetiche, malattie o esposizioni tossiche². Attualmente, il trattamento prevede l'intervento chirurgico per sostituire la lente, una procedura costosa e invasiva accessibile principalmente a chi vive nei paesi sviluppati. L'ampio carico di cataratta ha indirizzato decenni di ricerca verso la prevenzione della cataratta e lo sviluppo di trattamenti non chirurgici. In entrambi i casi, l'importanza dei test preclinici per la tossicità, l'efficacia e la farmacocinetica dei farmaci oftalmici è fondamentale. Questo processo di sviluppo dei farmaci si basa in larga misura sulle informazioni fornite dagli studi condotti sugli animali.

L'attuale standard per i test di tossicità oculare in vivo è il test di Draize, che prevede la somministrazione di un composto di prova nel sacco congiuntivale di un animale vivo. Il test è stato criticato in modo significativo, in particolare per quanto riguarda l'etica animale, la soggettività, la scarsa ripetibilità e la variabilità³. Inoltre, non esiste alcun componente del test di Draize che monitori direttamente gli effetti delle sostanze in esame sulla lente. Sono stati investiti notevoli sforzi nello sviluppo di modelli alternativi in vitro ⁴. Tuttavia, nessuno è stato sufficientemente convalidato per sostituire il test di Draize⁵. Allo stesso modo, molti di questi modelli incontrano limitazioni rispetto all'applicazione diretta alla cataratta e ad altre patologie complesse⁶. Ad esempio, i metodi che classificano la trasparenza dell'obiettivo quando viene posizionato su una griglia sono intrinsecamente soggettivi⁷. Gli studi sulle colture cellulari sono affidabili e altamente utilizzati, sebbene le caratteristiche del monostrato cellulare possano divergere dalla coltura tissutale primaria⁸.

Le lenti intere possono essere sezionate dagli occhi degli animali e coltivate per mantenere la loro struttura e funzione originali. Un test utile per valutare la funzione della lente mantenendo le condizioni dell'organo è il test dello scanner laser a lente che coinvolge uno scanner sviluppato presso l'Università di Waterloo in Canada. Il test è un sistema di scansione che utilizza una serie di proiezioni laser per misurare la qualità ottica o le prestazioni di rifrazione della lente. Le lenti vengono scansionate nelle loro camere di coltura personalizzate a due segmenti, consentendo ai raggi di passare dal basso attraverso la lente (Figura 1A). Una telecamera fissata all'interno dello scanner cattura l'immagine del laser che passa attraverso l'obiettivo in numerosi punti. Il software dello scanner calcola la distanza dietro la lente alla quale si interseca con un asse centrale (distanza del vertice posteriore, BVD), producendo una serie di misurazioni che indicano la coerenza con cui la lente focalizza la luce su un singolo punto (Figura 1).

Le proprietà cellulari della lente, come la disposizione stretta e ordinata delle sue celle, aiutano a mantenere la trasparenza e a ridurre al minimo la dispersione in modo che la lente possa focalizzare funzionalmente la luce⁹. Questa misura può essere utilizzata per interpretare in che misura una sostanza chimica interrompe la struttura essenziale della lente, come l'indice di rifrazione del gradiente, e quanta funzione è compromessa a causa delle opacità indotte. Altri studi che hanno seguito la risposta delle lenti coltivate e delle vescicole del cristallino suggeriscono che la diffusione della luce è un prodotto di cambiamenti strutturali, rispetto ai cambiamenti metabolici, e che le interruzioni dei lipidi e delle proteine del cristallino possono influenzare l'indice di rifrazione e di conseguenza aumentare la dispersione^10,11.

Lo scanner laser a lente può essere utilizzato in combinazione con i reagenti metabolici nei saggi per determinare le misure biochimiche della tossicità cellulare. La resazurina è un reagente chimico non tossico metabolizzato dalle cellule attive, che produce un prodotto ridotto (resorufina) con una fluorescenza misurabile¹². Il cristallino è in gran parte privo di organelli, ad eccezione dei mitocondri metabolicamente attivi concentrati all'interno dell'epitelio anteriore e delle cellule delle fibre corticali superficiali, che soddisfano i requisiti energetici del cristallino^13,14. Il danno al cristallino a livello cellulare può interrompere il metabolismo e spesso precede l'insorgenza di cambiamenti strutturali patogeni e cataratta¹⁵.

Lo scopo di questo metodo è valutare l'effetto delle esposizioni xenobiotiche e ambientali sul cristallino, che possono contribuire allo sviluppo della cataratta. Il protocollo prevede due saggi per valutare l'effetto di un trattamento con il cristallino bovino in coltura. Il vantaggio di questo approccio è che fornisce una valutazione sia cellulare che funzionale di come il cristallino come tessuto primario risponde al trattamento. Si tratta di una valutazione sensibile e obiettiva della lente rispetto ad altri metodi comuni 16,17,18.

Il modello è stato utilizzato con successo per valutare gli effetti di varie esposizioni, tra cui tensioattivi, prodotti di consumo, alcoli e radiazioni ultraviolette 17,19,20. I cambiamenti nella qualità ottica sono costantemente presenti nelle lenti coltivate in risposta all'esposizione tossica²¹. La capacità di questo metodo di mantenere la coltura del cristallino a lungo termine è adatta per monitorare l'effetto potenzialmente ritardato di un composto e il recupero del cristallino dal danno indotto o dalla cataratta^22,23. I risultati ottenuti dall'applicazione di questo protocollo possono essere utilizzati per ridurre la dipendenza dalla sperimentazione animale nello sviluppo di prodotti oftalmici.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati eseguiti in conformità con le politiche etiche dell'Università di Waterloo per la ricerca che utilizza tessuti animali. Gli occhi bovini per il presente studio sono stati forniti al macello, ottenuti da vacche non da latte entro poche ore dalla morte, e sono stati sezionati immediatamente, un processo che richiede fino a 8 ore dall'ottenimento degli occhi. Gli occhi devono essere sezionati immediatamente per preservare la sterilità e la qualità della dissezione. Il terreno di coltura viene preparato a un pH di 7,4 e filtrato sterile prima dell'integrazione con FBS²¹. Tutte le procedure vengono eseguite in condizioni sterili, con le fonti di materiali e attrezzature elencate nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di cristallino bovino

1. Sezionare le lenti rimuovendo i muscoli extraoculari e il tessuto dalla sclera, rimuovendo la metà posteriore del globo e il vitreo, rimuovendo l'iride e il corpo ciliare insieme alla lente, quindi tagliando via gli attacchi zonulari, con il taglio finale posizionato in modo tale che la lente cada nella camera di coltura a riempimento medio.
2. Coltura delle lenti sezionate in camere personalizzate con una base adattata al sistema di scansione laser, con 21 mL di terreno filtrato sterile, a 37 °C e 5% di CO₂. Utilizzare un terreno di coltura integrato con siero fetale bovino (FBS) al 3% con penicillina-streptomicina all'1%, 9,4 g/L di M-199, 0,1 g/L di L-glutammina, 5,96 g/L di HEPES, 2,2 g/L di bicarbonato di sodio e 7 mL/L di NaOH. Conservare il terreno di coltura inutilizzato in frigorifero per un massimo di 7 giorni.
3. Sostituire il terreno di coltura ogni 1-2 giorni. Riscaldare il terreno di coltura per un'ora a 37 °C prima dell'uso. Utilizzare una pipetta sterile Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno da una camera di coltura individuale e rabboccare immediatamente con il terreno integrato.
4. Coltivare le lenti per 48 ore dopo la dissezione per consentire la manifestazione del danno fisico. Ispezionare e scansionare le lenti per verificarne la qualità ottica secondo la sezione 4 prima di includerle in un esperimento.
   NOTA: Le lenti sono orientate a faccia in giù in preparazione per il test con scanner laser.

2. Procedura di controllo

1. Preparare una soluzione con la concentrazione desiderata di un agente solubilizzante compatibile con il composto chimico e il terreno di coltura.
2. Preparare una soluzione di controllo del veicolo aggiungendo l'agente solubilizzante al mezzo integrato. Riscaldare la soluzione di controllo per un'ora a 37 °C prima della sperimentazione.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno di coltura dalle camere delle lenti di controllo. Riempire le camere con la soluzione di controllo. Se necessario, eseguire questo passaggio con campioni in triplice copia.
   NOTA: È necessario un volume minimo di 7 ml per coprire completamente la lente nella posizione anteriore rivolta verso l'alto. Le condizioni per i controlli nel presente studio erano 21 mL di mezzo di controllo non trattato, 21 mL di un mezzo di controllo del veicolo e 7 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
4. Coltivare le lenti nel mezzo di controllo per 2 giorni, quindi sostituirle con un nuovo mezzo di controllo secondo la sezione 1. Per esposizioni a breve termine, aspirare la soluzione di controllo dalle camere ed eseguire un risciacquo almeno tre volte con terreno di coltura non integrato prima di riprendere il protocollo di coltura della lente come descritto nella sezione 1.0.
5. Lasciare acclimatare le lenti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 3,5 ore prima della valutazione della qualità ottica.

3. Procedura di esposizione

1. Preparare una soluzione con la concentrazione desiderata di un agente solubilizzante compatibile con il composto chimico e il terreno di coltura. Combinare la sostanza chimica con l'agente solubilizzante, lasciando il tempo appropriato per l'interazione, se necessario.
   NOTA: La 2-idrossipropil-β-ciclodestrina è stata utilizzata nel presente studio per migliorare la solubilità del lanosterolo (0,033 g/L) nel terreno. La soluzione di cloruro di benzalconio (BAK 0,0075%) è stata preparata utilizzando PBS.
2. Incorporare la sostanza chimica solubilizzata nel terreno di coltura. Preparare un volume totale sufficiente a fornire 21 mL di terreno a tutti i campioni di lenti. Riscaldare il terreno sperimentale per un'ora a 37 °C prima della sperimentazione.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno di coltura dalle camere delle lenti. Riempire immediatamente le camere con la soluzione di prova. Dopo l'intervallo di esposizione, sostituire con terreno di coltura integrato, eseguendo prima un risciacquo se necessario. Se necessario, eseguire questo passaggio con campioni in triplice copia.
   NOTA: Nel presente studio, le condizioni di test erano 21 mL di terreno integrato con lanosterolo e 7 mL di una soluzione BAK 0,0075%. È necessario un volume minimo di 7 ml per coprire completamente la lente. In questo caso, le lenti devono essere prima orientate anteriormente rivolte verso l'alto. Una pipetta Pasteur può essere utilizzata per creare una corrente nella camera di coltura con parte del terreno di coltura circostante per riposizionare la lente.
4. Rimettere le lenti nell'incubatrice per almeno 3,5 ore per acclimatarle prima della valutazione della qualità ottica.
   NOTA: Le lenti sono orientate a faccia in giù in preparazione per il test con scanner laser.

4. Saggio della qualità ottica (laser-scanner a lenti)

1. Assicurarsi che le lenti siano orientate con la parte anteriore rivolta verso il basso e visivamente livellate nella camera di coltura, utilizzando la tecnica del passaggio 3.3 per regolare la posizione della lente, se necessario.
   NOTA: Questa posizione garantisce che il raggio incidente venga riflesso attraverso il fondo della camera e passi attraverso la lente dalla superficie anteriore a quella posteriore.
2. Posizionare una camera di coltura delle lenti nello scanner laser in modo che il perno del carrello della camera si inserisca nella fessura della base della camera.
3. Selezionare la lente e il punto di scansione per i quali eseguire una scansione, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla lente di scansione e attendere che lo scanner richieda di trovare e allineare il raggio. Selezionare l'inizio e i punti finali ben distanti per il raggio dietro la lente. Assicurarsi che il raggio centrale sia allineato utilizzando i pulsanti di regolazione grossolana e fine nel software dello scanner e la manopola di regolazione sullo scanner. Quando il raggio è allineato, fare clic su calibra e inserire una selezione appropriata di passi radiali e separazione del raggio.
   NOTA: Per questo studio con la lente bovina, le impostazioni per i gradini radiali e la separazione del fascio sono state impostate rispettivamente su 10 passi e 0,5 mm. La prima scansione eseguita dallo scanner serve a calibrare lo scanner laser. Questa operazione è necessaria una sola volta e tutte le scansioni aggiuntive dell'obiettivo possono essere eseguite direttamente dopo l'allineamento.
4. Una volta calibrato lo scanner, fare clic su Scansione. Attendere che vengano generati i valori per la media BVD, la deviazione standard e l'errore lungo un asse dopo il completamento della scansione dell'obiettivo e che l'ambito del raggio sia stato impostato. Impostare il cannocchiale da cui i raggi escono dall'obiettivo al punto finale desiderato, selezionando la distanza massima dietro l'obiettivo escludendo qualsiasi interferenza apparente.
5. Utilizzare il grafico generato per visualizzare le distanze dei singoli vertici posteriori per ciascun raggio.
   NOTA: Escludere i raggi che passano attraverso le suture delle lenti. Per escludere una trave, utilizzare la legenda sullo schermo per fare clic con il pulsante destro del mouse su una singola trave e selezionare Escludi.
6. Ruotare manualmente la posizione della base della camera di coltura all'interno dello scanner di 90°, in modo che la seconda scansione lungo la superficie anteriore della lente sia perpendicolare alla scansione precedente. Assicurarsi che il raggio centrale sia allineato come descritto al punto 4.3, quindi eseguire la scansione dell'obiettivo.

5. Saggio dell'attività metabolica (resazurina)

1. Preparare il terreno senza FBS. Scaldare il fluido per un'ora a 37 °C. Preparare 50 mL di reagente di resazurina all'8% in terreno non integrato.
   NOTA: È sufficiente preparare 50 ml per riempire tutti i pozzetti in una piastra a 12 pozzetti. La soluzione deve essere preparata sterile in condizioni di scarsa illuminazione in un contenitore opaco, poiché la resazurina è sensibile alla luce.
2. Aggiungere 3,8 mL di soluzione di resazurina all'8% in ciascun pozzetto all'interno di una piastra sterile a 12 pozzetti a fondo trasparente per coprire la lente.
3. Utilizzare misurini metallici sterili per sollevare con cautela le lenti da sotto la superficie posteriore ed eseguire un risciacquo con una pipetta Pasteur per lavare la lente con un piccolo volume di terreno di coltura non integrato. Posiziona le lenti singolarmente in ogni pozzetto.
4. Incubare la piastra a pozzetti a 37 °C e 5% di CO₂ per 5 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere le lenti con palette metalliche dai pozzetti e metterle in un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti animali. Trasferire un campione da 100 μl da ciascun pozzetto in una piastra sterile a fondo trasparente da 96 pozzetti.
   NOTA: Le lenti possono essere valutate più volte con il test dell'attività metabolica. In questo caso, rimettere le lenti nelle camere di coltura con un terreno fresco per l'incubazione. Il test dell'attività metabolica viene eseguito al meglio una volta completate tutte le scansioni, poiché il colorante può influenzare le misurazioni della BVD.
5. Misurare la fluorescenza finale dei campioni da 100 μl utilizzando un lettore di piastre fluorescenti, con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione impostate rispettivamente a 560 nm e 590 nm.

6. Analisi dei dati

1. Per il test della qualità ottica, calcolare la media dei valori calcolati dal software per l'errore BVD²⁴ dalle due scansioni eseguite in ciascun momento. Eseguire questo calcolo per tutti gli obiettivi e tutti i punti di scansione.
2. Per il test dell'attività metabolica, raccogliere i valori di fluorescenza relativi all'endpoint generati dal lettore di piastre. Normalizzare i dati impostando la media di tutti i valori di controllo in un punto di scansione su 100%. Calcolare l'attività di ciascuna lente come percentuale del valore medio di controllo per quel punto di scansione.
3. Eseguire un test di normalità per tutti i gruppi di esperimenti. Supponendo che i dati siano normali, analizzare le differenze di errore BVD tra le lenti di controllo e sperimentali utilizzando l'ANOVA a due vie. Inoltre, esegui il test di confronto multiplo post-hoc di Tukey. Eseguire un'ANOVA unidirezionale e il test post-hoc di Dunnett per i dati dell'attività metabolica.

La Figura 2 e la Figura 3 (n = 6) illustrano i risultati di uno studio che ha testato l'effetto del trattamento chimico (lanosterolo) sul cristallino bovino. Il lanosterolo è uno sterolo presente in natura nel cristallino che una volta ha mostrato risultati promettenti come potenziale intervento farmaceutico per la cataratta²⁵, anche se questo deve ancora essere dimostrato²⁶. Il disegno dello studio includeva un mezzo e il controllo del veicolo per il composto. Non c'è stata alcuna differenza significativa tra il veicolo (2-idrossipropil-β-ciclodestrina) e il controllo del mezzo (p > 0,05), indicando che qualsiasi effetto potenziale nel gruppo sperimentale non è probabilmente dovuto al veicolo. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella variabilità della BVD tra il gruppo di trattamento e quello di controllo (p > 0,05). Questi risultati erano coerenti con il test dell'attività metabolica (Figura 3). Pertanto, il trattamento non ha introdotto una tossicità significativa per le cellule né ha influenzato in modo significativo le prestazioni di rifrazione del cristallino (p > 0,05).

La Figura 4 e la Figura 5 (n = 3) mostrano i risultati del trattamento con BAK sulla lente. BAK è un tensioattivo e il conservante più comunemente usato nelle formulazioni oftalmiche²⁷. Un'esposizione di 10 minuti ha determinato una variabilità BVD significativamente maggiore nelle lenti trattate rispetto al controllo a 4 giorni dopo l'esposizione (p < 0,05). Il trattamento ha anche prodotto una differenza significativa nell'attività metabolica del cristallino (p < 0,05).

Figura 1: Determinazione della distanza del vertice posteriore come misura della qualità ottica utilizzando uno scanner laser. (A) Una serie di raggi viene fatta passare attraverso la lente mentre è posizionata nella sua camera di coltura lungo un asse. (B) I raggi passano attraverso la lente a intervalli specificati. La distanza del vertice posteriore è determinata per ciascun raggio e i valori di media BVD (in mm) e di errore BVD sono generati come misure quantitative della funzione di rifrazione della lente. Queste informazioni vengono visualizzate graficamente, con il BVD mostrato sull'asse x e la posizione del fascio sull'asse y. Più i raggi sono focalizzati in modo nitido in un punto coerente dietro la lente (C), minore è il valore di errore BVD calcolato rispetto alle lenti di qualità ottica inferiore (D). Abbreviazione: BVD = distanza del vertice posteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Effetto della sospensione di lanosterolo sulla qualità ottica del cristallino bovino. La variabilità della distanza del vertice posteriore riflette la capacità della lente di rifrangere la luce in un singolo punto. La qualità ottica delle lenti trattate con lanosterolo era simile a quella delle lenti a mezzo e di controllo del veicolo non trattate (p > 0,05) (n = 6). I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. Abbreviazione: BVD = distanza del vertice posteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Effetto della sospensione di lanosterolo sull'attività metabolica del cristallino bovino. Attività metabolica media delle lenti bovine, quantificata dalla fluorescenza relativa di un indicatore metabolizzato dopo esposizione a un trattamento con lanosterolo in sospensione su veicolo (n = 6). I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto del benzalconio cloruro sulla qualità ottica del cristallino bovino. Un'esposizione a BAK 0,0075% per 10 minuti ha prodotto un aumento graduale della variabilità della distanza del vertice posteriore all'interno delle lenti da trattare (n = 3). Le differenze erano significative tra le lenti trattate e quelle di controllo medie 4 giorni dopo l'esposizione, così come per le lenti trattate tra i punti di scansione pre-esposizione e post-esposizione (p < 0,05). I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. Abbreviazioni: BVD = distanza del vertice posteriore; BAK = cloruro di benzalconio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Effetto del benzalconio cloruro sull'attività metabolica del cristallino bovino. L'endpoint dell'attività metabolica è stato misurato 4 giorni dopo un'esposizione di 10 minuti a BAK 0,0075% (n = 3). I cambiamenti nell'attività metabolica erano significativamente diversi dal controllo (p > 0,05). I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard. Abbreviazione: BAK = benzalconio cloruro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare direttamente gli effetti delle sostanze chimiche o delle esposizioni ambientali sul cristallino nella coltura di tessuti primari. Innanzitutto, le lenti vengono sezionate e scansionate per verificarne la qualità ottica. La prevenzione della contaminazione e la garanzia della qualità della dissezione sono fondamentali. Le lenti vengono scansionate a intervalli periodici per monitorare continuamente i cambiamenti nella funzione di rifrazione rispetto al gruppo di controllo o alla condizione di preesposizione. Il test dell'attività metabolica rappresenta un endpoint per determinare se le esposizioni hanno influenzato il metabolismo cellulare. Questi sono i passaggi critici per determinare se una sostanza xenobiotica o una condizione ambientale causa una tossicità significativa, portando potenzialmente alla cataratta e se la lente può riprendersi da questo trattamento.

Le lenti vengono scansionate per verificarne la qualità ottica all'interno delle rispettive camere di coltura. Sebbene le lenti possano anche essere esposte a una sostanza di prova all'interno delle loro camere, uno dei limiti di questo protocollo è che le lenti sono sensibili alle variazioni di osmolarità e devono essere continuamente nutrite con siero e mantenute all'interno di un mezzo appropriato. Ciò rappresenta una sfida per i trattamenti con lunghi intervalli di esposizione o scarsa solubilità all'interno del terreno di coltura²⁸. Poiché il test utilizza l'imaging video, le sospensioni con grandi quantità di particelle insolubili possono introdurre dispersione, che non è indicativa delle prestazioni dell'obiettivo. Le condizioni che hanno prodotto i dati rappresentativi utilizzando una sospensione di lanosterolo indicano che il protocollo può tollerare alcune sospensioni a bassa concentrazione. Sebbene sia stato suggerito in precedenza che il cristallino bovino in coltura può correlare le risposte nel cristallino umano²¹, le differenze chiave, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la filtrazione UV, la compattazione legata all'età e il contenuto di fosfolipidi, limitano la gamma di sostanze per le quali questo protocollo viene utilizzato in modo appropriato nei test preclinici^29,30.

I test di tossicità oculare comportano necessariamente un'ampia serie di test per determinare un quadro generale della sicurezza e della tolleranza di un composto, a partire dai test in vitro e sugli animali prima di procedere agli studi clinici. Il test della lente bovina ha un'elevata produttività per il numero di volte in cui una lente può essere scansionata, poiché il metodo non è distruttivo e può essere eseguito facilmente in pochi minuti. Tuttavia, il test di un gran numero di lenti può avere una bassa produttività, poiché sezionare una lente da un occhio può richiedere molto tempo. L'uso del laser-scanner è stato più ampiamente utilizzato per studiare le lenti di porcellino d'India, pesce, maiale, ratto e pulcino 31,32,33,34,35. Idealmente, i risultati dei test preclinici forniscono informazioni sulla sicurezza e sul potenziale rischio nell'uomo. Mentre le lenti umane sarebbero molto utili in questo senso, poiché le lenti umane e animali differiranno inevitabilmente in alcuni casi³⁶, le lenti fornite dai macelli sono utili per bilanciare le risorse disponibili e l'etica. Questo protocollo rappresenta un metodo in vitro sensibile, riproducibile, non tossico e oggettivo per testare sia le condizioni cellulari che funzionali della lente in risposta al trattamento.

Rispetto all'attuale standard in vivo per i test di tossicità oculare, lo scanner laser per lenti fornisce una valutazione diretta degli effetti delle esposizioni potenzialmente tossiche sulla lente. A causa della comune origine embriologica del tessuto del cristallino e della cornea, nonché di somiglianze funzionali come la trasparenza e la rifrazione, la coltura primaria del cristallino rappresenta un modello adatto per l'irritanza oculare. Gli studi preliminari di convalida dello scanner laser a lente hanno mostrato risultati comparabili rispetto al test di Draize e hanno persino dimostrato di essere più sensibili senza infliggere alcun disagio a un animale vivo¹⁸. Questi risultati sono inoltre raccolti in modo oggettivo, senza l'interpretazione di un osservatore.

Le misurazioni del test con scanner laser per lenti sono direttamente rilevanti per la funzione naturale della lente in vivo. Inoltre, a differenza dei saggi che coltivano la cornea o le linee cellulari, il cristallino bovino mantiene la sua funzione refrattiva utilizzando il metodo di coltura cellulare a lungo termine sviluppato e il test di qualità ottica può essere eseguito mantenendo il cristallino nel suo ambiente. Il risultato è che, a differenza di altri test che producono un singolo endpoint a causa del test stesso che danneggia la lente, il test di qualità ottica può essere eseguito ripetutamente mentre si coltiva con successo la lente per un massimo di 1000 ore²⁴.

Poiché il cristallino è in gran parte privo di organelli, ad eccezione dell'epitelio anteriore e delle cellule delle fibre corticali superficiali, queste cellule svolgono funzioni di organello per l'intero cristallino³⁷. È quindi semplice comprendere la connessione tra i cambiamenti cellulari e l'induzione della cataratta del cristallino, come osservato in vitro e in vivo^15,19. L'attività metabolica del cristallino rappresenta essenzialmente l'attività del monostrato epiteliale anteriore. Sebbene siano disponibili dosaggi simili alla resazurina, ad esempio i sali di tetrazolio tra cui MTT, XTT, MTS e WST, la resazurina fornisce un test non tossico e sensibile altamente compatibile con la coltura primaria del cristallino. A differenza dell'MTT, che richiede la solubilizzazione di cristalli precipitati, il protocollo della resazurina non prevede soluzioni che possano indurre la lisi. Inoltre, studi su colture cellulari hanno implicato che l'endpoint della resazurina è più sensibile dei saggi del sale di tetrazolio³⁸.

Questo metodo è progettato per modellare la risposta della lente come tessuto oculare e dispositivo ottico a varie esposizioni chimiche e ambientali. I due composti rappresentativi scelti per questa indagine sono il benzalconio cloruro, un conservante in soluzioni oftalmiche, e il lanosterolo, uno sterolo precedentemente studiato come parte di uno sforzo per trovare interventi farmaceutici per la cataratta. I risultati dimostrano lo stress del cristallino in risposta al conservante e nessuna risposta significativa al lanosterolo. Questo metodo potrebbe essere utilizzato ulteriormente per studiare la tossicità di potenziali trattamenti farmaceutici per la cataratta.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Grazie al Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) e al Canadian Optometric Education Trust Fund (COETF) per i fondi per questo progetto.