نظام زراعة الأعضاء لتقييم سمية السواغات والمستحضرات الصيدلانية للعلاج داخل العين

الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم التغيرات في نشاط التمثيل الغذائي والوظيفة الانكسارية للعدسة استجابة للعلاج التجريبي.

باعتباره السبب الرئيسي للعمى ، فإن إعتام عدسة العين يمثل عبئا كبيرا على عشرات الملايين من الأشخاص المصابين بهذه الحالة على مستوى العالم. يعد التعرض للمواد الكيميائية ، من بين العوامل البيئية الأخرى ، سببا ثابتا لإعتام عدسة العين. يمكن لاختبار سمية العين تقييم ما إذا كانت المستحضرات الصيدلانية ومكوناتها قد تساهم في تلف العدسة التي قد تؤدي إلى إعتام عدسة العين أو تساعد في علاج إعتام عدسة العين.

يمكن استخدام الدراسات في المختبر والتجارب على في الجسم الحي لتقييم سلامة المواد الكيميائية قبل الدراسات السريرية. تم انتقاد اختبار Draize - المعيار الحالي في الجسم الحي لاختبار سمية العين والتهيج - لافتقاره إلى الحساسية والقياسات الموضوعية لتحديد سمية العين. المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر محدودة لأن مزارع الخلايا لا يمكنها نمذجة عدسة وظيفية سليمة بشكل مناسب.

الطريقة الموضحة هنا هي بديل حساس في المختبر للتجارب على ، وهي مصممة لتقييم استجابة عدسة البقر السليمة للعلاج على مستوى النشاط الخلوي والأداء الانكساري العام. يتم استقلاب الكاشف غير السام ريزازورين بما يتناسب مع مستوى نشاط الخلية. يقيس اختبار الماسح الضوئي بالليزر قدرة العدسة على انكسار أشعة الضوء الساقطة إلى نقطة واحدة بأقل قدر من الخطأ ، ذات صلة مباشرة بوظيفتها الطبيعية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد كل من التغييرات الحادة والمتأخرة في العدسة ، وكذلك استعادة العدسة من التعرض الكيميائي أو البيئي.

يؤثر إعتام عدسة العين على أكثر من 20 مليون شخص ، وهو السبب الأكثر انتشارا للعمى في جميع أنحاء^{العالم 1،2}. يكون إعتام عدسة العين ناتجا بشكل شائع عن التغيرات المرتبطة بالعمر في العدسة ولكنه ناتج أيضا عن الصدمات أو الحالات الوراثية أو المرض أو التعرض للسموم². في الوقت الحالي ، يتضمن العلاج تدخلا جراحيا لاستبدال العدسة ، وهو إجراء مكلف وجراحي يمكن الوصول إليه بشكل أساسي لأولئك الموجودين في البلدان المتقدمة. وجه العبء الكبير لإعتام عدسة العين عقودا من البحث نحو الوقاية من إعتام عدسة العين وتطوير العلاج غير الجراحي. في كلتا الحالتين ، تعتبر أهمية الاختبار قبل السريري للسمية والفعالية والحركية الدوائية لأدوية العيون أمرا بالغ الأهمية. تعتمد عملية تطوير الأدوية هذه بشكل كبير على المعلومات التي توفرها الدراسات التي أجريت على.

المعيار الحالي لاختبار سمية العين في الجسم الحي هو اختبار Draize ، الذي يتضمن توصيل مركب اختبار إلى كيس الملتحمة لحيوان حي. تم انتقاد الاختبار بشكل كبير ، لا سيما فيما يتعلق بأخلاقيات ، والذاتية ، وضعف التكرار ، والتباين³. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوجد مكون في اختبار Draize يراقب بشكل مباشر تأثيرات مواد الاختبار على العدسة. تم استثمار جهد كبير في تطوير نماذج بديلة في المختبر ⁴. ومع ذلك ، لم يتم التحقق من صحة أي منها بشكل كاف ليحل محل اختبار Draize⁵. وبالمثل ، تواجه العديد من هذه النماذج قيودا فيما يتعلق بالتطبيق المباشر على إعتام عدسة العين والأمراض المعقدة^{الأخرى 6}. على سبيل المثال ، الطرق التي تصنف شفافية العدسة عند وضعها على شبكة هي ذاتية^{بطبيعتها 7}. دراسات زراعة الخلايا موثوقة ومستخدمة بشكل كبير ، على الرغم من أن خصائص الخلية أحادية الطبقة قد تختلف عن زراعة الأنسجة الأولية⁸.

يمكن تشريح العدسات الكاملة من عيون وتربيتها للحفاظ على هيكلها ووظيفتها الأصلية. أحد المقايسات المفيدة لتقييم وظيفة العدسة مع الحفاظ على حالة العضو هو فحص الماسح الضوئي بالليزر للعدسة الذي يتضمن ماسحا ضوئيا تم تطويره في جامعة واترلو في كندا. الاختبار هو نظام مسح يستخدم سلسلة من إسقاطات الليزر لقياس الجودة البصرية أو الأداء الانكساري للعدسة. يتم مسح العدسات ضوئيا في غرف الاستزراع المخصصة المكونة من جزأين ، مما يسمح للحزم بالمرور من الأسفل عبر العدسة (الشكل 1 أ). تلتقط الكاميرا المثبتة داخل الماسح الضوئي صورة الليزر الذي يمر عبر العدسة في نقاط عديدة. يحسب برنامج الماسح الضوئي المسافة خلف العدسة التي تتقاطع عندها مع محور مركزي (مسافة الرأس الخلفي ، BVD) ، مما ينتج عنه سلسلة من القياسات التي تشير إلى مدى ثبات تركيز العدسة للضوء على نقطة واحدة (الشكل 1).

تساعد الخصائص الخلوية للعدسة ، مثل الترتيب المحكم والمنظم لخلاياها ، في الحفاظ على الشفافية وتقليل التشتت حتى تتمكن العدسة من التركيز الوظيفي على الضوء⁹. يمكن استخدام هذا المقياس لتفسير مدى أهمية تعطيل المادة الكيميائية للبنية الأساسية للعدسة ، مثل معامل الانكسار المتدرج ، ومقدار الوظيفة التي تتعرض للخطر بسبب العتامة المستحثة. تشير الدراسات الأخرى التي اتبعت استجابة العدسات المزروعة وحويصلات العدسات إلى أن تشتت الضوء هو نتاج التغيرات الهيكلية ، مقارنة بالتغيرات الأيضية ، وأن الاضطرابات في دهون العدسة والبروتينات قد تؤثر على معامل الانكسار وبالتالي زيادة التشتت^10،11.

يمكن استخدام الماسح الضوئي بالليزر للعدسة جنبا إلى جنب مع الكواشف الأيضية في المقايسات لتحديد المقاييس الكيميائية الحيوية لسمية الخلية. Resazurin هو كاشف كيميائي غير سام يتم استقلابه بواسطة الخلايا النشطة ، مما ينتج عنه منتج مخفض (ريسوروفين) مع مضان قابل^{للقياس 12}. العدسة خالية إلى حد كبير من العضيات ، باستثناء الميتوكوندريا النشطة الأيضية المركزة داخل الظهارة الأمامية وخلايا الألياف القشرية السطحية ، مما يفي بمتطلبات طاقة^{العدسة 13،14}. قد يؤدي تلف العدسة على المستوى الخلوي إلى تعطيل عملية التمثيل الغذائي وغالبا ما يسبق ظهور التغيرات الهيكلية المسببة للأمراض وإعتام عدسة العين¹⁵.

الغرض من هذه الطريقة هو تقييم تأثير التعرض الحيوي والبيئي على العدسة ، مما قد يساهم في تطور إعتام عدسة العين. يتضمن البروتوكول مقياسين لتقييم تأثير العلاج باستخدام عدسة الأبقار المستنبتة. تتمثل ميزة هذا النهج في أنه يوفر تقييما خلويا ووظيفيا لكيفية استجابة العدسة كنسيج أولي للعلاج. إنه تقييم حساس وموضوعي للعدسة مقارنة بالطرق الشائعة^{الأخرى 16،17،18}.

تم استخدام النموذج بنجاح لتقييم تأثيرات التعرض المختلفة ، بما في ذلك المواد الخافضة للتوتر السطحي والمنتجات الاستهلاكية والكحول والأشعة فوق البنفسجية^17،19،20. التغييرات في الجودة البصرية موجودة باستمرار في العدسات المستنبتة استجابة للتعرض للمواد السامة²¹. إن قدرة هذه الطريقة على الحفاظ على ثقافة العدسة على المدى الطويل مناسبة تماما لمراقبة التأثير المتأخر المحتمل للمركب ، واستعادة العدسة من التلف المستحث أو إعتام عدسة العين^22،23. يمكن استخدام النتائج الناتجة عن تطبيق هذا البروتوكول لتقليل الاعتماد على التجارب على في تطوير منتجات طب العيون.

تم تنفيذ جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لسياسات أخلاقيات جامعة واترلو للبحث باستخدام الأنسجة الحيوانية. تم توفير عيون الأبقار للدراسة الحالية من المسلخ ، وتم الحصول عليها من أبقار غير حلوب في غضون ساعات قليلة من الموت ، وتم تشريحها على الفور ، وهي عملية تستغرق ما يصل إلى 8 ساعات من الحصول على العينين. يجب تشريح العيون على الفور للحفاظ على جودة العقم والتشريح. يتم تحضير وسط الاستزراع إلى درجة حموضة 7.4 ويتم ترشيحه معقم قبل المكملات مع FBS²¹. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة ، مع إدراج مصادر المواد والمعدات في جدول المواد.

1. ثقافة العدسات البقرية

1. قم بتشريح العدسات عن طريق إزالة العضلات والأنسجة خارج العين من الصلبة ، وإزالة النصف الخلفي من الكرة الأرضية والجسم الزجاجي ، وإزالة القزحية والجسم الهدبي مع العدسة ، ثم قطع المرفقات النطاقية ، مع وضع القطع النهائي بحيث تسقط العدسة في غرفة الثقافة المملوءة بالمتوسط.
2. استزراع العدسات التي تم تشريحها في غرف مخصصة بقاعدة مكيفة لتناسب نظام المسح الضوئي بالليزر، مع 21 مل من الوسط المصفى المعقم، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. استخدم 3٪ وسط استزراع مكملات مصل الأبقار الجنينية (FBS) مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين، 9.4 جم/لتر M-199، 0.1 جم/لتر ل-جلوتامين، 5.96 جم/لتر هيبلس هيبسول، 2.2 جم/لتر بيكربونات الصوديوم، 7 مل/لتر هيدروكسيد الصوديوم. قم بتخزين وسط الاستزراع غير المستخدم في الثلاجة لمدة تصل إلى 7 أيام.
3. استبدل وسط الثقافة كل 1-2 أيام. قم بتسخين وسط المزرعة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. استخدم ماصة باستور معقمة متصلة بالشفط لشفط الوسط من غرفة الاستزراع الفردية وتجديدها على الفور بالوسط الإضافي.
4. قم بزراعة العدسات لمدة 48 ساعة بعد التشريح لإتاحة الوقت لظهور الضرر المادي. فحص العدسات ومسحها ضوئيا للتأكد من جودتها البصرية وفقا للقسم 4 قبل إدراجها في التجربة.
   ملاحظة: يتم توجيه العدسات ووجهها لأسفل استعدادا لمقايسة الماسح الضوئي بالليزر.

2. إجراء التحكم

1. قم بإعداد محلول بالتركيز المطلوب لعامل الذوبان المتوافق مع المركب الكيميائي ووسط الاستزراع.
2. قم بإعداد محلول التحكم في السيارة عن طريق إضافة عامل الذوبان إلى الوسط التكميلي. قم بتسخين محلول التحكم لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التجريب.
3. استخدم ماصة باستور متصلة بالشفط لشفط وسط المزرعة من غرف عدسة التحكم. تجديد الغرف بمحلول التحكم. إذا لزم الأمر ، قم بتنفيذ هذه الخطوة مع عينات في ثلاث نسخ.
   ملاحظة: مطلوب حجم لا يقل عن 7 مل لتغطية العدسة بالكامل في وضع الوجه الأمامي لأعلى. كانت شروط الضوابط في الدراسة الحالية 21 مل من وسيط التحكم غير المعالج ، و 21 مل من وسط التحكم في السيارة ، و 7 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
4. استزراع العدسات في وسط التحكم لمدة يومين ، ثم استبدلها بوسيط تحكم جديد وفقا للقسم 1. بالنسبة للتعرضات قصيرة المدى، قم بشفط محلول التحكم من الغرف وقم بشطف ثلاث مرات على الأقل باستخدام وسط مزرعة غير مكمل قبل استئناف بروتوكول زراعة العدسة كما هو موضح في القسم 1.0.
5. اسمح للعدسات بالتأقلم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 3.5 ساعة على الأقل قبل تقييم الجودة البصرية.

3. إجراء التعرض

1. قم بإعداد محلول بالتركيز المطلوب لعامل الذوبان المتوافق مع المركب الكيميائي ووسط الاستزراع. امزج المادة الكيميائية مع عامل الذوبان ، مما يتيح الوقت المناسب للتفاعل إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: تم استخدام 2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين في الدراسة الحالية لتعزيز قابلية ذوبان اللانوستيرول (0.033 جم / لتر) في المتوسط. تم تحضير محلول كلوريد البنزالكونيوم (BAK 0.0075٪) باستخدام PBS.
2. ادمج المادة الكيميائية القابلة للذوبان في وسط الاستزراع. قم بإعداد حجم إجمالي كاف لتوفير 21 مل من عينات العدسة المتوسطة لجميع العينات. قم بتسخين الوسط التجريبي لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التجريب.
3. استخدم ماصة باستور متصلة بالشفط لشفط وسط المزرعة من غرف العدسة. قم بتجديد الغرف على الفور بمحلول الاختبار. بعد فترة التعرض ، استبدلها بوسط مزرعة مكمل ، وقم بشطف أولا إذا لزم الأمر. إذا لزم الأمر ، قم بتنفيذ هذه الخطوة مع عينات في ثلاث نسخ.
   ملاحظة: في الدراسة الحالية ، كانت ظروف الاختبار 21 مل من الوسط المكمل باللانوستيرول و 7 مل من محلول BAK 0.0075٪. مطلوب حجم لا يقل عن 7 مل لتغطية العدسة بالكامل. في هذه الحالة ، يجب أولا توجيه العدسات الأمامية لأعلى. يمكن استخدام ماصة باستور لإنشاء تيار في غرفة الاستزراع مع بعض وسط الاستزراع المحيط لإعادة وضع العدسة.
4. أعد العدسات إلى الحاضنة لمدة 3.5 ساعة على الأقل للتأقلم قبل تقييم الجودة البصرية.
   ملاحظة: يتم توجيه العدسات ووجهها لأسفل استعدادا لمقايسة الماسح الضوئي بالليزر.

4. فحص الجودة البصرية (عدسة الماسح الضوئي بالليزر)

1. تأكد من توجيه العدسات بحيث يكون وجهها الأمامي لأسفل ومستويا بصريا في غرفة المزرعة، باستخدام التقنية من الخطوة 3.3 لضبط موضع العدسة إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: يضمن هذا الموضع أن ينعكس الشعاع الساقط لأعلى عبر قاع الغرفة ويمر عبر العدسة من السطح الأمامي إلى السطح الخلفي.
2. ضع حجرة ثقافة العدسة في الماسح الضوئي بالليزر بحيث يتناسب دبوس حامل الغرفة مع الفتحة الموجودة في قاعدة الغرفة.
3. حدد العدسة ونقطة المسح التي تريد إجراء المسح لها، وانقر بزر الماوس الأيمن على عدسة المسح الضوئي، وانتظر حتى يطالب الماسح الضوئي بالعثور على الشعاع ومحاذاته. حدد البداية ونقاط النهاية البعيدة جيدا للحزمة الموجودة خلف العدسة. تأكد من محاذاة الشعاع المركزي باستخدام أزرار الضبط الإجمالية والدقيقة في برنامج الماسحة الضوئية ومقبض الضبط على الماسحة الضوئية. عند محاذاة الشعاع ، انقر فوق معايرة وأدخل مجموعة مناسبة من الخطوات الشعاعية وفصل الحزمة.
   ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة باستخدام عدسة البقر ، تم ضبط إعدادات الخطوات الشعاعية وفصل الحزمة على 10 خطوات و 0.5 مم على التوالي. يعمل الفحص الأول الذي يقوم به الماسح الضوئي على معايرة الماسح الضوئي بالليزر. هذا مطلوب مرة واحدة ، ويمكن إجراء جميع عمليات مسح العدسة الإضافية مباشرة بعد المحاذاة.
4. بمجرد معايرة الماسح الضوئي، انقر فوق مسح ضوئي. انتظر حتى يتم إنشاء قيم لمتوسط BVD والانحراف المعياري والخطأ على طول محور واحد بعد الانتهاء من مسح العدسة ، وتم تعيين نطاق الحزمة. اضبط النطاق من حيث تخرج الحزم من العدسة إلى نقطة النهاية المطلوبة، وحدد المسافة القصوى خلف العدسة مع استبعاد أي تداخل واضح.
5. استخدم المخطط الذي تم إنشاؤه لعرض مسافات الرأس الخلفي الفردية لكل حزمة.
   ملاحظة: استبعاد الحزم التي تمر عبر خيوط العدسة. لاستبعاد شعاع، استخدم وسيلة الإيضاح التي تظهر على الشاشة للنقر بزر الماوس الأيمن على شعاع فردي وتحديد استبعاد.
6. قم بتدوير موضع قاعدة غرفة الاستزراع يدويا داخل الماسحة الضوئية بمقدار 90 درجة، بحيث يكون المسح الثاني على طول سطح العدسة الأمامي عموديا على الفحص السابق. تأكد من محاذاة الحزمة المركزية كما هو مفصل في الخطوة 4.3، ثم امسح العدسة ضوئيا.

5. فحص النشاط الأيضي (ريزازورين)

1. تحضير وسط بدون FBS. قم بتسخين الوسط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. تحضير 50 مل من كاشف ريزازورين 8٪ في وسط غير مكمل.
   ملاحظة: يكفي تحضير 50 مل لملء جميع الآبار في صفيحة من 12 بئرا. يجب تحضير المحلول معقما في ظل ظروف معتمة في حاوية معتمة ، لأن الريزازورين حساس للضوء.
2. أضف 3.8 مل من محلول ريزازورين بنسبة 8٪ إلى كل بئر داخل صفيحة شفافة القاع ومعقمة مكونة من 12 بئرا لتغطية العدسة.
3. استخدم مجارف معدنية معقمة لرفع العدسات بعناية من تحت السطح الخلفي وإجراء الشطف باستخدام ماصة باستور لغسل العدسة بحجم صغير من وسط المزرعة غير المكملة. ضع العدسات بشكل فردي في كل بئر.
4. احتضان لوحة البئر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة العدسات ذات المجارف المعدنية من الآبار وضعها في حاوية التخلص من فضلات. انقل عينة سعة 100 ميكرولتر من كل بئر إلى صفيحة معقمة ذات قاع شفاف وسعة 96 بئرا.
   ملاحظة: يمكن تقييم العدسات عدة مرات باستخدام مقايسة النشاط الأيضي. في هذه الحالة ، أعد العدسات إلى غرف الثقافة بوسط جديد للحضانة. من الأفضل إجراء فحص النشاط الأيضي بمجرد اكتمال جميع عمليات المسح ، حيث قد تؤثر الصبغة على قياسات BVD.
5. قم بقياس مضان نقطة النهاية للعينات سعة 100 ميكرولتر باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت ، مع ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث عند 560 نانومتر و 590 نانومتر ، على التوالي.

6. تحليل البيانات

1. بالنسبة لمقايسة الجودة البصرية ، احسب متوسط القيم المحسوبة بواسطة البرنامج لخطأ BVD²⁴ من فحصي الفحص اللذين تم إجراؤهما في كل نقطة زمنية. قم بإجراء هذا الحساب لجميع العدسات وجميع نقاط الفحص.
2. بالنسبة لمقايسة النشاط الأيضي ، اجمع قيم التألق النسبي لنقطة النهاية التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ اللوحة. تطبيع البيانات عن طريق تعيين متوسط جميع قيم التحكم عند نقطة المسح الضوئي إلى 100٪. احسب نشاط كل عدسة كنسبة مئوية من متوسط قيمة التحكم لنقطة المسح هذه.
3. قم بإجراء اختبار الوضع الطبيعي لجميع مجموعات التجارب. بافتراض أن البيانات طبيعية ، قم بتحليل اختلافات خطأ BVD بين عدسات التحكم والعدسات التجريبية باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإجراء اختبار المقارنات المتعددة اللاحق ل Tukey. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Dunnett اللاحق لبيانات نشاط التمثيل الغذائي.

يوضح الشكل 2 والشكل 3 (ن = 6) نتائج دراسة تختبر تأثير العلاج الكيميائي (اللانوستيرول) على عدسة الأبقار. اللانوستيرول هو ستيرول طبيعي في العدسة أظهر ذات مرة نتائج واعدة كتدخل صيدلاني محتمل لإعتام عدسة العين²⁵ ، على الرغم من أن هذا لم يثبت^{بعد 26}. تضمن تصميم الدراسة وسيطا وتحكم في المركبة للمجمع. لم يكن هناك فرق كبير بين المركبة (2-هيدروكسي بروبيل-β-سيكلودكسترين) والتحكم المتوسط (ص > 0.05)، مما يشير إلى أن أي تأثير محتمل في المجموعة التجريبية من غير المحتمل أن يكون بسبب المركبة. لم يكن هناك فرق يعتد به في تباين مرض الولادة الفيدرالي بين المجموعات المضادة للعلاج والمجموعات المرجعية (p > 0.05). كانت هذه النتائج متوافقة مع مقايسة النشاط الأيضي (الشكل 3). لذلك ، لم يدخل العلاج سمية كبيرة للخلايا أو يؤثر بشكل كبير على الأداء الانكساري للعدسة (ص > 0.05).

يوضح الشكل 4 والشكل 5 (ن = 3) نتائج العلاج باستخدام BAK على العدسة. BAK هو مادة خافضة للتوتر السطحي والمادة الحافظة الأكثر استخداما في تركيبات طب العيون²⁷. أدى التعرض لمدة 10 دقائق إلى تباين أكبر بكثير في العدسات المعالجة مقارنة بالتحكم بعد 4 أيام من التعرض (ص < 0.05). أنتج العلاج أيضا فرقا كبيرا في نشاط التمثيل الغذائي للعدسة (ص < 0.05).

الشكل 1: تحديد مسافة الرأس الخلفي كمقياس للجودة البصرية باستخدام الماسح الضوئي بالليزر. (أ) يتم تمرير سلسلة من الحزم عبر العدسة أثناء جلوسها في غرفة الاستزراع الخاصة بها على طول محور واحد. (ب) تمر الحزم عبر العدسة على فترات زمنية محددة. يتم تحديد مسافة الرأس الخلفي لكل شعاع ، ويتم إنشاء متوسط BVD (بالمليمتر) وقيم خطأ BVD كمقاييس كمية لوظيفة انكسار العدسة. يتم عرض هذه المعلومات بيانيا ، مع عرض BVD على المحور x وموضع الشعاع على المحور y. كلما زادت حدة تركيز الحزم على نقطة ثابتة خلف العدسة (C) ، قلت قيمة خطأ BVD المحسوبة مقارنة بالعدسات ذات الجودة البصرية الرديئة (D). الاختصار: BVD = مسافة الرأس الخلفي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير تعليق اللانوستيرول على الجودة البصرية للعدسة البقرية. يعكس تقلب مسافة الرأس الخلفي قدرة العدسة على كسر الضوء إلى نقطة واحدة. كانت الجودة البصرية للعدسات المعالجة باللانوستيرول مماثلة لتلك الخاصة بالعدسات المتوسطة غير المعالجة وعدسات التحكم في السيارة (ص > 0.05) (ن = 6). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الاختصار: BVD = مسافة الرأس الخلفي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تأثير تعليق اللانوستيرول على النشاط الأيضي لعدسة الأبقار. متوسط النشاط الأيضي لعدسات الأبقار ، مقاسة كميا من خلال التألق النسبي لمؤشر استقلابي بعد التعرض لعلاج اللانوستيرول المعلق في السيارة (ن = 6). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأثير كلوريد البنزالكونيوم على الجودة البصرية للعدسات البقرية. أدى التعرض ل BAK 0.0075٪ لمدة 10 دقائق إلى زيادة تدريجية في تباين مسافة الرأس الخلفي داخل عدسات العلاج (ن = 3). كانت الاختلافات ذات دلالة إحصائية بين العدسات المعالجة والمتوسطة بعد 4 أيام من التعرض ، وكذلك بالنسبة للعدسات المعالجة بين نقاط المسح قبل التعرض وما بعد التعرض (ص < 0.05). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. الاختصارات: BVD = مسافة الرأس الخلفي. باك = كلوريد البنزالكونيوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تأثير كلوريد البنزالكونيوم على النشاط الأيضي لعدسة البقر. تم قياس نقطة نهاية النشاط الأيضي بعد 4 أيام من التعرض لمدة 10 دقائق ل BAK 0.0075٪ (ن = 3). كانت التغيرات في نشاط التمثيل الغذائي مختلفة بشكل كبير عن التحكم (ص > 0.05). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. اختصار: BAK = كلوريد البنزالكونيوم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الغرض من هذا البروتوكول هو التقييم المباشر لتأثيرات المواد الكيميائية أو التعرض البيئي على العدسة في زراعة الأنسجة الأولية. أولا ، يتم تشريح العدسات ومسحها ضوئيا للحصول على الجودة البصرية. الوقاية من التلوث وضمان جودة التشريح أمران بالغان الأهمية. يتم مسح العدسات ضوئيا على فترات دورية لمراقبة التغيرات في وظيفة الانكسار باستمرار فيما يتعلق بمجموعة التحكم أو حالة ما قبل التعرض. يمثل اختبار النشاط الأيضي نقطة نهاية لتحديد ما إذا كان التعرض قد أثر على التمثيل الغذائي الخلوي. هذه هي الخطوات الحاسمة لتحديد ما إذا كانت مادة الكاهبة للأجانب الحيوية أو الحالة البيئية تسبب سمية كبيرة ، مما قد يؤدي إلى إعتام عدسة العين وما إذا كانت العدسة قد تتعافى من هذا العلاج.

يتم فحص العدسات بحثا عن الجودة البصرية داخل غرف الاستزراع الخاصة بها. على الرغم من أن العدسات يمكن أن تتعرض أيضا لمادة اختبار داخل غرفها ، إلا أن أحد قيود هذا البروتوكول هو أن العدسات حساسة للتغيرات في الأسمولية ويجب تغذيتها باستمرار بالمصل والحفاظ عليها في وسط مناسب. يمثل هذا تحديا للعلاجات ذات فترات التعرض الطويلة أو ضعف الذوبان داخل وسط الثقافة²⁸. نظرا لأن الفحص يستخدم تصوير الفيديو ، فقد يؤدي نظام التعليق الذي يحتوي على كميات كبيرة من الجسيمات غير القابلة للذوبان إلى حدوث تشتت ، وهو ليس مؤشرا على أداء العدسة. تشير الظروف التي أنتجت البيانات التمثيلية باستخدام تعليق اللانوستيرول إلى أن البروتوكول يمكن أن يتحمل بعض معلقات التركيز منخفضة المستوى. في حين أنه تم اقتراح سابقا أن العدسة البقرية المستنبتة يمكن أن ترتبط بالاستجابات في العدسة البشرية²¹ ، فإن الاختلافات الرئيسية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ترشيح الأشعة فوق البنفسجية ، والضغط المرتبط بالعمر ، ومحتوى الدهون الفوسفورية ، تحد من نطاق المواد التي يستخدم هذا البروتوكول بشكل مناسب في الاختبارات قبل السريرية^29،30.

يتضمن اختبار سمية العين بالضرورة مجموعة كبيرة من الاختبارات لتحديد صورة واسعة لسلامة وتحمل المركب ، بدءا من الاختبارات المختبرية والتجارب على قبل الشروع في التجارب السريرية. يتميز اختبار العدسة البقرية بإنتاجية عالية لعدد المرات التي يمكن فيها مسح العدسة ضوئيا لأن الطريقة غير مدمرة ويمكن إجراؤها بسهولة في غضون بضع دقائق. ومع ذلك ، يمكن أن يكون اختبار أعداد كبيرة من العدسات إنتاجية منخفضة ، حيث أن تشريح العدسة من العين قد يستغرق وقتا طويلا. تم استخدام الماسح الضوئي بالليزر على نطاق أوسع لدراسة عدسات خنزير غينيا والأسماك والخنازير والجرذان والكتاكيت^{31،32،33،34،35}. من الناحية المثالية ، توفر نتائج الاختبارات قبل السريرية نظرة ثاقبة للسلامة والمخاطر المحتملة على البشر. في حين أن العدسات البشرية ستكون مفيدة للغاية في هذا الصدد ، حيث ستختلف العدسات البشرية والحيوانية حتما في بعض الحالات³⁶ ، فإن العدسات التي توفرها المسالخ مفيدة في تحقيق التوازن بين الموارد المتاحة والأخلاقيات. يمثل هذا البروتوكول طريقة حساسة وقابلة للتكرار وغير سامة وموضوعية في المختبر لاختبار كل من الظروف الخلوية والوظيفية للعدسة استجابة للعلاج.

بالمقارنة مع المعيار الحالي في الجسم الحي لاختبار سمية العين ، يوفر الماسح الضوئي بالليزر للعدسة تقييما مباشرا لتأثيرات التعرض السامة المحتملة على العدسة. نظرا لأصل الأنسجة الجنينية الشائعة للعدسة والقرنية ، بالإضافة إلى أوجه التشابه الوظيفية مثل الشفافية والانكسار ، فإن الثقافة الأولية للعدسة تمثل نموذجا مناسبا لتهيج العين. أظهرت دراسات التحقق الأولية للماسح الضوئي بالليزر للعدسة نتائج مماثلة فيما يتعلق باختبار Draize ، بل وثبت أنها أكثر حساسية دون إلحاق أي إزعاج بحيوان حي¹⁸. بالإضافة إلى ذلك ، يتم جمع هذه النتائج بموضوعية ، دون تفسير مراقب.

ترتبط قياسات فحص الماسح الضوئي بالليزر للعدسة ارتباطا مباشرا بالوظيفة الطبيعية للعدسة في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، على عكس المقايسات التي تزرع القرنية أو خطوط الخلايا ، تحافظ العدسة البقرية على وظيفة الانكسار باستخدام طريقة زراعة الخلايا طويلة المدى التي تم تطويرها ، ويمكن إجراء فحص الجودة البصرية مع الحفاظ على العدسة في بيئتها. والنتيجة هي أنه على عكس المقايسات الأخرى التي تنتج نقطة نهاية واحدة نتيجة للاختبار نفسه الذي يضر بالعدسة ، يمكن إجراء فحص الجودة البصرية بشكل متكرر مع زراعة العدسة بنجاح لمدة تصل إلى 1000 ساعة²⁴.

نظرا لأن العدسة خالية إلى حد كبير من العضيات ، باستثناء الظهارة الأمامية وخلايا الألياف القشرية السطحية ، فإن هذه الخلايا تؤدي وظائف العضية للعدسة بأكملها³⁷. من السهل إذن فهم العلاقة بين التغيرات الخلوية وتحريض إعتام عدسة العين ، كما لوحظ في المختبر وفي الجسم الحي^15،19. يمثل نشاط التمثيل الغذائي للعدسة بشكل أساسي نشاط الطبقة الأحادية الظهارية الأمامية. في حين تتوفر فحوصات مشابهة للريزازورين ، على سبيل المثال ، أملاح التيترازوليوم بما في ذلك MTT و XTT و MTS و WST ، يوفر الريزازورين فحصا غير سام وحساسا متوافقا للغاية مع ثقافة العدسة الأولية. على عكس MTT ، الذي يتطلب إذابة البلورات المترسبة ، لا يتضمن بروتوكول الريزازورين محاليل من المحتمل أن تحفز التحلل. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت دراسات زراعة الخلايا إلى أن نقطة نهاية الريزازورين أكثر حساسية من فحوصات ملح التيترازوليوم³⁸.

تم تصميم هذه الطريقة لنمذجة استجابة العدسة كنسيج عيني وجهاز بصري لمختلف التعرضات الكيميائية والبيئية. المركبان التمثيليان المختاران لهذا التحقيق هما كلوريد البنزالكونيوم ، وهو مادة حافظة في محاليل العيون ، واللانوستيرول ، وهو ستيرول تمت دراسته سابقا كجزء من جهد لإيجاد تدخلات صيدلانية لإعتام عدسة العين. تظهر النتائج إجهاد العدسة استجابة للمادة الحافظة وعدم وجود استجابة كبيرة لللانوستيرول. يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أكبر لدراسة سمية العلاجات الصيدلانية المحتملة لإعتام عدسة العين.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكرا لمجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة (NSERC) والصندوق الاستئماني الكندي لتعليم البصريات (COETF) على الأموال المخصصة لهذا المشروع.