用于评估眼内治疗辅料和药物毒性的器官培养系统

该方案的目标是评估晶状体代谢活性和屈光功能的变化对实验性治疗的反应。

作为导致失明的主要原因，白内障对全球数千万受这种疾病影响的人来说是一个沉重的负担。除其他环境因素外，化学品暴露是白内障的既定原因。眼部毒性测试可以评估药物及其成分是否可能导致晶状体损伤，从而导致白内障或有助于白内障的治疗。

体外 研究和 体内 动物试验可用于在临床研究之前评估化学品的安全性。Draize 测试——目前眼毒性和刺激性测试的 体内 标准——因缺乏确定眼毒性的敏感性和客观测量而受到批评。基于 细胞的 体外检测受到限制，因为细胞培养物无法适当地模拟完整的功能性晶状体。

此处描述的方法是动物试验 的灵敏 体外替代方案，旨在评估完整牛晶状体在细胞活性水平和整体屈光性能下对治疗的反应。无毒试剂刃天青的代谢与细胞活性水平成比例。镜头激光扫描仪分析测量镜头以最小误差将入射光束折射到单个点的能力，这与其自然功能直接相关。该方法可用于确定晶状体的急性和迟发性变化，以及晶状体从化学或环境暴露中恢复的情况。

白内障影响着超过 2000 万人，是全世界最常见的失明原因 ^1,2。白内障最常见的原因是晶状体与年龄相关的变化，但也是由创伤、遗传条件、疾病或毒性暴露引起的²。目前，治疗包括手术干预以更换晶状体，这是一种主要为发达国家的人提供的昂贵且侵入性的手术。白内障的广泛负担使数十年的研究转向了白内障预防和非手术治疗的发展。在这两种情况下，眼科药物的毒性、疗效和药代动力学的临床前测试的重要性都至关重要。这个药物开发过程在很大程度上依赖于在动物身上进行的研究提供的信息。

目前体内眼 毒性测试的标准 是 Draize 测试，涉及将测试化合物递送到活体动物的结膜囊。该测试受到了严厉的批评，特别是在动物伦理、主观性、可重复性差和可变性^{方面 3}。此外，Draize 测试中没有直接监测测试物质对镜头影响的组件。在开发替代 体外 模型方面投入了大量精力⁴。但是，没有一个经过充分验证来取代 Draize 测试⁵。同样，其中许多模型在直接应用于白内障和其他复杂病理方面面临限制⁶。例如，将镜头透明度放在网格上时对镜头透明度进行分级的方法本质上是主观^{的 7} （subjective 7）。细胞培养研究可靠且利用率高，但细胞单层特征可能与原代组织培养不同⁸。

可以从动物的眼睛中解剖出整个晶状体并进行培养，以保持其原始结构和功能。一种可用于在维持器官状况的同时评估晶状体功能的检测是晶状体激光扫描仪检测，该检测涉及加拿大滑铁卢大学开发的扫描仪。该检测是一种扫描系统，它使用一系列激光投影来测量晶状体的光学质量或屈光性能。在其定制的两段培养室中扫描透镜，允许光束从下方穿过透镜（图 1A）。固定在扫描仪内部的摄像头可在多个点捕获激光穿过镜头的图像。扫描仪软件计算镜头后面与中心轴相交的距离（后顶点距离，BVD），生成一系列测量值，表明镜头将光线聚焦到单个点的一致性（图 1）。

晶状体的细胞特性，例如其细胞的紧密有序排列，有助于保持透明度并最大限度地减少散射，从而使晶状体能够在功能上聚焦光线⁹。该测量可用于解释化学物质对晶状体基本结构（例如梯度折射率）的破坏程度，以及由于诱导的混浊而损害了多少功能。其他跟踪培养晶状体和晶状体囊泡反应的研究表明，与代谢变化相比，光散射是结构变化的产物，晶状体脂质和蛋白质的破坏可能会影响折射率，从而增加散射^10,11。

透镜激光扫描仪可与代谢试剂在检测中结合使用，以确定细胞毒性的生化测量。刃天青是一种无毒的化学试剂，由活性细胞代谢，产生具有可测量荧光的还原产物（试卤灵^）12。晶状体基本上没有细胞器，除了集中在前上皮和浅表皮质纤维细胞内的代谢活跃的线粒体，满足晶状体能量需求^13,14。晶状体在细胞水平上的损伤可能会破坏新陈代谢，并且通常在致病性结构变化和白内障发生之前¹⁵。

该方法的目的是评估外源性和环境暴露对晶状体的影响，这可能导致白内障的发展。该方案涉及两次测定，以评估使用培养牛晶状体的治疗效果。这种方法的优点是它提供了晶状体作为原代组织对治疗的反应的细胞和功能评估。与其他常用方法相比，这是对晶状体的敏感和客观评估 16,17,18。

该模型已成功用于评估各种暴露的影响，包括表面活性剂、消费品、酒精和紫外线辐射 17,19,20。光学质量的变化始终存在于人工晶状体中，作为对毒性暴露的反应²¹。这种方法维持长期晶状体培养的能力非常适合监测化合物的潜在延迟效应，以及晶状体从诱导损伤或白内障中恢复的情况^22,23。应用该方案产生的结果可用于减少眼科产品开发中对动物试验的依赖。

所有实验方案均按照滑铁卢大学使用动物组织进行研究的伦理政策进行。当前研究的牛眼是屠宰场提供的，在死亡后几个小时内从非奶牛那里获得，并立即解剖，这个过程从获得眼睛到需要长达 8 小时。应立即解剖眼睛，以保持无菌和解剖质量。将培养基制备至 pH 值为 7.4 并在补充 FBS²¹ 之前进行无菌过滤。所有程序均在无菌条件下进行，材料和设备来源列于 材料表中。

1. 牛晶状体培养

1. 通过从巩膜中去除眼外肌和组织，去除眼球和玻璃体的后半部分，去除虹膜和睫状体以及晶状体，然后切掉带状体附件，最终切割的位置使晶状体落入充满培养基的培养室中。
2. 在定制室中培养解剖的镜片，其底座适合激光扫描系统，使用 21 mL 无菌过滤培养基，在 37 °C 和 5% CO₂ 下。使用补充 3% 胎牛血清 （FBS） 的培养基，其中含有 1% 青霉素-链霉素、9.4 g/L M-199、0.1 g/L L-谷氨酰胺、5.96 g/L HEPES、2.2 g/L 碳酸氢钠和 7 mL/L NaOH。将未使用的培养基存放在冰箱中长达 7 天。
3. 每 1-2 天更换一次培养基。使用前将培养基在 37 °C 下加热一小时。使用吸接的无菌巴斯德移液器从单个培养室中吸出培养基，并立即补充补充培养基。
4. 解剖后将镜片培养 48 小时，以便有时间显现物理损伤。在纳入实验之前，根据第 4 节检查和扫描镜头的光学质量。
   注意：镜片面朝下，为激光扫描仪分析做准备。

2. 控制程序

1. 使用与化合物和培养基相容的所需浓度的增溶剂制备溶液。
2. 通过将增溶剂添加到补充培养基中来制备载体对照溶液。实验前，将对照溶液在 37 °C 下加热一小时。
3. 使用连接到吸力的巴斯德移液器从控制透镜室中吸出培养基。用对照溶液补充腔室。如果需要，请对一式三份的样品执行此步骤。
   注：在正面朝上位置完全覆盖镜片，至少需要 7 mL 的体积。当前研究中对照的条件是 21 mL 未处理的培养基对照、21 mL 载体对照培养基和 7 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
4. 将镜片在对照培养基中培养 2 天，然后根据第 1 部分更换新的对照培养基。对于短期暴露，从腔室中吸出对照溶液，并在恢复晶状体培养方案之前用未补充的培养基至少冲洗 3 次，如第 1.0 节所述。
5. 在评估光学质量之前，让镜片在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中适应至少 3.5 小时。

3. 曝光程序

1. 使用与化合物和培养基相容的所需浓度的增溶剂制备溶液。将化学品与增溶剂混合，如果需要，留出适当的时间进行相互作用。
   注：本研究中使用 2-羟丙基-β-环糊精来提高羊毛甾醇 （0.033 g/L） 在培养基中的溶解度。使用 PBS 制备苯扎氯铵 （BAK 0.0075%） 溶液。
2. 将溶解的化学物质掺入培养基中。准备足以为所有镜头样品提供 21 mL 培养基的总体积。实验前将实验培养基在 37 °C 下加热一小时。
3. 使用连接到吸力的巴斯德移液器从晶状体腔室中吸出培养基。立即用测试溶液补充腔室。暴露间隔后，更换补充培养基，如果需要，先进行冲洗。如果需要，请对一式三份的样品执行此步骤。
   注：在目前的研究中，测试条件为 21 mL 补充羊毛甾醇的培养基和 7 mL BAK 0.0075% 溶液。完全覆盖镜头所需的最小体积为 7 mL。在这种情况下，镜片必须首先正面朝上。巴斯德移液器可用于在培养室中与周围的一些培养基一起产生电流，以重新定位晶状体。
4. 在评估光学质量之前，将镜片放回培养箱中至少 3.5 小时以适应。
   注意：镜片面朝下，为激光扫描仪分析做准备。

4. 光学质量测定（镜头激光扫描仪）

1. 确保镜片在培养室中朝下且视觉水平，如果需要，使用步骤 3.3 中的技术调整镜片的位置。
   注意：此位置可确保入射光束通过腔室底部向上反射，并从前表面穿过透镜到后表面。
2. 将透镜培养室放入激光扫描仪中，使腔室托架销适合腔室底座的插槽。
3. 选择要执行扫描的 镜头 和 扫描点 ，右键单击 扫描镜头，然后等待扫描仪提示找到并对齐光束。为镜头后面的光束选择距离较远的起点和终点。使用扫描仪软件中的 粗 略和 微调 按钮以及扫描仪上的调节旋钮，确保对准中心光束。光束对齐后，单击 calibrate（校准） 并输入适当的 径向步长 和 光束分离选择。
   注：对于使用牛透镜的这项研究， 径向步长 和 光束分离 的设置分别设置为 10 步 和 0.5 毫米。扫描仪执行的第一次扫描用于校准激光扫描仪。这需要一次，并且所有额外的镜头扫描都可以在对准后直接进行。
4. 校准扫描仪后，单击 scan（扫描）。镜头扫描完成后，等待沿一个轴生成 BVD 平均值、标准差和误差的值，并设置光束的范围。将光束从镜头射出的位置设置到所需端点的瞄准镜，选择镜头后方的最大距离，同时排除任何明显的干扰。
5. 使用生成的图表可查看每个梁的单个后顶点距离。
   注意：排除穿过晶状体缝合线的光束。要排除梁，请使用屏幕上的图例右键单击单个梁，然后选择 exclude。
6. 手动将扫描仪内培养室底座的位置旋转 90°，以便沿晶状体前表面的第二次扫描将垂直于前一次扫描。确保按照步骤 4.3 中的详细说明对准中心光束，然后扫描镜头。

5. 代谢活性测定（刃天青）

1. 制备不含 FBS 的培养基。将培养基在 37 °C 下加热一小时。 在未添加的培养基中制备 50 mL 8% 刃天青试剂。
   注：制备 50 mL 即可填充 12 孔板中的所有孔。溶液应在昏暗的条件下在不透明容器中无菌制备，因为刃天青对光敏感。
2. 向透明底部无菌 12 孔板中的每个孔中加入 3.8 mL 8% 刃天青溶液以覆盖晶状体。
3. 使用无菌金属勺小心地从后表面下方提起镜片，并使用巴斯德移液器冲洗，用少量未补充的培养基清洗镜片。将镜片单独放入每个孔中。
4. 将孔板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 5 小时。孵育后，用金属勺从孔中取出镜片，并将其放入动物粪便处理容器中。将每个孔中的 100 μL 样品转移到无菌、透明底的 96 孔板中。
   注：可以使用代谢活性测定法对镜片进行多次评估。在这种情况下，将晶状体放回装有新鲜培养基的培养室进行孵育。代谢活性测定最好在完成所有扫描后进行，因为染料可能会影响 BVD 测量。
5. 使用荧光读板器测量 100 μL 样品的终点荧光，激发波长和发射波长分别设置为 560 nm 和 590 nm。

6. 数据分析

1. 对于光学质量测定，计算在每个时间点进行的两次扫描中软件计算的 BVD 误差²⁴ 值的平均值。对所有镜头和所有扫描点执行此计算。
2. 对于代谢活性测定，收集酶标仪生成的终点相对荧光值。通过将扫描点上所有控制值的平均值设置为 100% 来规范化数据。计算每个镜头的活动占该扫描点的平均控制值的百分比。
3. 对所有实验组执行正态性检验。假设数据正常，使用双向方差分析分析对照镜头和实验镜头之间的 BVD 误差差异。此外，执行 Tukey 的事后多重比较测试。对代谢活动数据执行单因素方差分析和 Dunnett 事后检验。

图 2 和 图 3 （n = 6） 展示了测试化学处理（羊毛甾醇）对牛晶状体影响的研究结果。羊毛甾醇是晶状体中天然存在的甾醇，曾经作为白内障的潜在药物干预显示出有希望的结果²⁵，尽管这尚未得到证实²⁶。研究设计包括该化合物的培养基和载体对照。载体 （2-羟丙基-β-环糊精） 和培养基对照 （p > 0.05） 之间没有显着差异，表明实验组中的任何潜在影响都不太可能是由于载体引起的。治疗组和对照组之间的 BVD 变异性没有显着差异 （p > 0.05）。这些结果与代谢活性测定一致（图 3）。因此，该治疗没有对细胞产生显着毒性或显着影响晶状体的屈光性能 （p > 0.05）。

图 4 和 图 5 （n = 3） 显示了在晶状体上使用 BAK 治疗的结果。BAK 是一种表面活性剂，也是眼科制剂中最常用的防腐剂²⁷。与对照组相比，暴露 10 分钟导致暴露后 4 天处理镜片的 BVD 变异性显着增加 （p < 0.05）。治疗还产生了晶状体代谢活性的显着差异 （p < 0.05）。

图 1：使用激光扫描仪测定后顶点距离作为光学质量的量度。 （A） 当透镜位于培养室中时，一系列光束沿一个轴线穿过透镜。（B） 光束以指定的间隔穿过镜头。确定每个光束的后顶点距离，并生成 BVD 平均值（以 mm 为单位）和 BVD 误差值作为晶状体折射功能的定量测量。此信息以图形方式显示，BVD 显示在 x 轴上，光束位置显示在 y 轴上。光束聚焦到镜头后面的一致点 （C） 越清晰，与光学质量较差的镜头 （D） 相比，计算出的 BVD 误差值就越小。缩写： BVD = 后顶点距离。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：羊毛甾醇悬浮液对牛晶状体光学质量的影响。 后顶点距离可变性反映了镜头将光线折射到单个点的能力。羊毛甾醇处理的镜片的光学质量与未处理的中性镜片和载体对照镜片相似 （p > 0.05） （n = 6）。数据表示为平均值±标准差。缩写： BVD = 后顶点距离。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：羊毛甾醇混悬液对牛晶状体代谢活性的影响。 牛晶状体的平均代谢活性，通过暴露于载体悬浮羊毛甾醇治疗后代谢指示剂的相对荧光量化 （n = 6）。数据表示为平均值±标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：苯扎氯铵对牛晶状体光学质量的影响。 暴露于 0.0075% 的 BAK 10 分钟后，治疗镜片内的后顶点距离变化逐渐增加 （n = 3）。暴露后 4 天处理过的镜头和中对照镜头之间以及处理过的镜头在曝光前和曝光后扫描点之间的差异很大 （p < 0.05）。数据表示为平均值±标准差。缩写： BVD = 后顶点距离;BAK = 苯扎氯铵。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：苯扎氯铵对牛晶状体代谢活性的影响。 暴露于 0.0075% BAK 10 后 4 天测量代谢活性终点 （n = 3）。代谢活性的变化与对照组显著不同 （p > 0.05）。数据表示为平均值±标准差。缩写：BAK = 苯扎氯铵。 请单击此处查看此图的较大版本。

该方案的目的是直接评估原代组织培养中化学物质或环境暴露对晶状体的影响。首先，对镜头进行解剖和扫描以确保光学质量。防止污染和确保解剖质量至关重要。定期扫描镜片，以持续监测屈光功能相对于对照组或曝光前条件的变化。代谢活性测定代表了确定暴露是否影响了细胞代谢的终点。这些是确定外源性物质或环境条件是否会导致严重毒性、可能导致白内障以及晶状体是否可以从这种治疗中恢复的关键步骤。

在各自的培养室内扫描透镜的光学质量。尽管镜片也可以暴露于其腔室内的测试物质中，但该方案的局限性之一是镜片对渗透压的变化很敏感，必须不断用血清滋养并保持在适当的介质中。这为暴露间隔长或在培养基中溶解度差的处理带来了挑战²⁸。由于该分析使用视频成像，因此含有大量不溶性颗粒的悬浮液可能会引入散射，这并不表示镜头性能。使用羊毛甾醇悬浮液产生代表性数据的条件表明，该方案可以耐受某些低浓度悬浮液。虽然之前已经提出培养的牛晶状体可以与人类晶状体中的反应相关²¹，但关键差异，包括但不限于紫外线过滤、与年龄相关的压实和磷脂含量，限制了该方案在临床前测试中适当使用的物质范围^29,30。

眼部毒性测试必然涉及大量测试，以确定化合物的安全性和耐受性的广泛情况，从体外和动物测试开始，然后进行临床试验。牛晶状体分析对晶状体的扫描次数具有高通量，因为该方法是非破坏性的，可以在几分钟内轻松完成。然而，测试大量晶状体的通量可能很低，因为从眼睛解剖晶状体可能很耗时。激光扫描仪的使用已更广泛地用于研究豚鼠、鱼、猪、大鼠和小鸡的晶状体 31,32,33,34,35。理想情况下，临床前测试的结果可以深入了解人类的安全性和潜在风险。虽然人体镜片在这方面最有用，因为在某些情况下人类和动物的镜片不可避免地会有所不同³⁶，但屠宰场提供的镜片有助于平衡可用资源和道德规范。该方案代表了一种敏感、可重复、无毒且客观的体外方法，用于测试晶状体对治疗的反应的细胞和功能状况。

与目前用于眼部毒性测试的 体内 标准相比，晶状体激光扫描仪可直接评估潜在毒性暴露对晶状体的影响。由于晶状体和角膜的共同胚胎组织来源，以及透明度和屈光等功能相似性，晶状体的原代培养代表了适合眼部刺激的模型。镜头激光扫描仪的初步验证研究表明，与 Draize 测试的结果相当，甚至被证明更敏感，而不会对活体动物造成任何不适¹⁸。这些结果是客观收集的，无需观察者的解释。

晶状体激光扫描仪分析测量与晶状体 在体内的自然功能直接相关。此外，与培养角膜或细胞系的检测不同，牛晶状体使用开发的长期细胞培养方法保持其屈光功能，并且可以在将晶状体保持在环境中的同时进行光学质量检测。结果是，与其他由于测试本身损坏晶状体而产生单一终点的分析不同，光学质量分析可以在成功培养晶状体长达 1000 小时²⁴ 的同时重复进行。

由于晶状体基本上没有细胞器，除了前上皮细胞和浅表皮质纤维细胞外，这些细胞为整个晶状体执行细胞器功能³⁷。因此，了解细胞变化与晶状体白内障诱导之间的联系就很简单了，正如在体外和体内观察到的那样 ^15,19。晶状体代谢活动基本上代表了前上皮单层的活动。虽然可以使用类似于刃天青的检测方法，例如包括 MTT、XTT、MTS 和 WST 在内的四唑盐，但刃天青提供了一种与原代晶状体培养高度兼容的无毒且灵敏的检测方法。与需要溶解沉淀晶体的 MTT 不同，刃天青方案不涉及可能诱导裂解的溶液。此外，细胞培养研究表明，刃天青终点比四唑盐测定更敏感³⁸。

该方法旨在模拟晶状体作为眼组织和光学设备对各种化学和环境暴露的响应。为这项调查选择的两种代表性化合物是苯扎氯铵（眼用溶液中的防腐剂）和羊毛甾醇（一种甾醇），以前作为寻找白内障药物干预措施的努力的一部分进行研究。结果表明，晶状体应激对防腐剂有反应，对羊毛甾醇没有显着反应。该方法可用于进一步研究白内障潜在药物治疗的毒性。

作者没有需要披露的利益冲突。

感谢自然科学与工程研究委员会 （NSERC） 和加拿大验光教育信托基金 （COETF） 为该项目提供资金。