Sistema de cultura de órgãos para avaliação da toxicidade de excipientes e produtos farmacêuticos para tratamento intraocular

O objetivo deste protocolo é avaliar as alterações na atividade metabólica e na função refrativa do cristalino em resposta ao tratamento experimental.

Como a principal causa de cegueira, a catarata é um fardo significativo para as dezenas de milhões de pessoas afetadas globalmente por essa condição. A exposição a produtos químicos, entre outros fatores ambientais, é uma causa estabelecida de catarata. Os testes de toxicidade ocular podem avaliar se os produtos farmacêuticos e seus componentes podem contribuir para danos ao cristalino que podem levar à catarata ou auxiliar no tratamento da catarata.

Estudos in vitro e testes in vivo em animais podem ser usados para avaliar a segurança de produtos químicos antes de estudos clínicos. O teste de Draize - o padrão atual in vivo para testes de toxicidade ocular e irritação - foi criticado por falta de sensibilidade e medições objetivas para determinar a toxicidade ocular. Os ensaios in vitro baseados em células são limitados, pois as culturas de células não podem modelar adequadamente uma lente funcional intacta.

O método aqui descrito é uma alternativa in vitro sensível aos ensaios em animais, concebida para avaliar a resposta do cristalino bovino intacto ao tratamento, tanto ao nível da actividade celular como ao desempenho refractivo global. O reagente não tóxico resazurina é metabolizado proporcionalmente ao nível de atividade celular. O ensaio de scanner a laser de lente mede a capacidade da lente de refratar feixes de luz incidentes em um único ponto com erro mínimo, diretamente relevante para sua função natural. O método pode ser usado para determinar alterações agudas e tardias na lente, bem como a recuperação da lente de exposições químicas ou ambientais.

Afetando mais de 20 milhões de pessoas, a catarata é a causa mais prevalente de cegueira em todo o mundo ^1,2. A catarata é mais comumente causada por alterações relacionadas à idade no cristalino, mas também é induzida por trauma, condições genéticas, doenças ou exposições tóxicas². Atualmente, o tratamento envolve intervenção cirúrgica para substituição do cristalino, um procedimento caro e invasivo acessível principalmente para quem está em países desenvolvidos. A extensa carga da catarata direcionou décadas de pesquisa para a prevenção da catarata e o desenvolvimento de tratamentos não cirúrgicos. Em ambos os casos, a importância dos testes pré-clínicos para toxicidade, eficácia e farmacocinética de medicamentos oftálmicos é fundamental. Esse processo de desenvolvimento de medicamentos depende muito das informações fornecidas por estudos realizados em animais.

O padrão atual para testes de toxicidade ocular in vivo é o teste de Draize, envolvendo a entrega de um composto de teste ao saco conjuntival de um animal vivo. O teste tem sido significativamente criticado, principalmente no que diz respeito à ética animal, subjetividade, baixa repetibilidade e variabilidade³. Além disso, não há nenhum componente do teste de Draize que monitore diretamente os efeitos das substâncias de teste na lente. Esforços consideráveis têm sido investidos no desenvolvimento de modelos alternativos in vitro ⁴. No entanto, nenhum foi suficientemente validado para substituir o teste de Draize⁵. Da mesma forma, muitos desses modelos enfrentam limitações no que diz respeito à aplicação direta à catarata e outras patologias complexas⁶. Por exemplo, os métodos que classificam a transparência da lente quando colocados sobre uma grade são inerentemente subjetivos⁷. Os estudos de cultura celular são confiáveis e altamente utilizados, embora as características da monocamada celular possam divergir da cultura primária de tecidos⁸.

Lentes inteiras podem ser dissecadas dos olhos dos animais e cultivadas para manter sua estrutura e função originais. Um ensaio que é útil para avaliar a função do cristalino, mantendo a condição do órgão, é o ensaio de scanner a laser de lente envolvendo um scanner desenvolvido na Universidade de Waterloo, no Canadá. O ensaio é um sistema de varredura que usa uma série de projeções a laser para medir a qualidade óptica ou o desempenho de refração da lente. As lentes são digitalizadas em suas câmaras de cultura personalizadas de dois segmentos, permitindo que os feixes passem de baixo para cima através da lente (Figura 1A). Uma câmera fixada dentro do scanner captura a imagem do laser passando pela lente em vários pontos. O software do scanner calcula a distância atrás da lente na qual ela se cruza com um eixo central (distância do vértice traseiro, BVD), produzindo uma série de medições que indicam a consistência com que a lente focaliza a luz em um único ponto (Figura 1).

As propriedades celulares da lente, como o arranjo apertado e ordenado de suas células, ajudam a manter a transparência e minimizar a dispersão para que a lente possa focalizar funcionalmente a luz⁹. Essa medida pode ser usada para interpretar o quão significativamente um produto químico interrompe a estrutura essencial da lente, como o índice de refração gradiente, e quanta função é comprometida devido às opacidades induzidas. Outros estudos que acompanharam a resposta de lentes cultivadas e vesículas do cristalino sugerem que a dispersão da luz é um produto de mudanças estruturais, em comparação com as alterações metabólicas, e que as interrupções nos lipídios e proteínas do cristalino podem afetar o índice de refração e, consequentemente, aumentar a dispersão^10,11.

O scanner a laser de lente pode ser usado em conjunto com reagentes metabólicos em ensaios para determinar medidas bioquímicas de toxicidade celular. A resazurina é um reagente químico não tóxico metabolizado por células ativas, produzindo um produto reduzido (resorufina) com fluorescência mensurável¹². O cristalino é amplamente desprovido de organelas, exceto as mitocôndrias metabolicamente ativas concentradas no epitélio anterior e nas células das fibras corticais superficiais, preenchendo os requisitos energéticos do cristalino^13,14. Danos ao cristalino no nível celular podem interromper o metabolismo e muitas vezes precedem o início de alterações estruturais patogênicas e catarata¹⁵.

O objetivo deste método é avaliar o efeito das exposições xenobióticas e ambientais no cristalino, o que pode contribuir para o desenvolvimento da catarata. O protocolo envolve dois ensaios para avaliar o efeito de um tratamento usando o cristalino bovino cultivado. A vantagem dessa abordagem é que ela fornece uma avaliação celular e funcional de como o cristalino, como tecido primário, responde ao tratamento. É uma avaliação sensível e objetiva do cristalino em comparação com outros métodos comuns 16,17,18.

O modelo tem sido usado com sucesso para avaliar os efeitos de várias exposições, incluindo surfactantes, produtos de consumo, álcoois e radiação ultravioleta 17,19,20. Mudanças na qualidade óptica estão consistentemente presentes em lentes cultivadas como resposta à exposição tóxica²¹. A capacidade desse método de manter a cultura do cristalino a longo prazo é adequada para monitorar o efeito potencialmente retardado de um composto e a recuperação do cristalino de danos induzidos ou catarata^22,23. Os resultados produzidos a partir da aplicação deste protocolo podem ser usados para reduzir a dependência de testes em animais no desenvolvimento de produtos oftálmicos.

Todos os protocolos experimentais foram realizados em conformidade com as políticas de ética da Universidade de Waterloo para pesquisa usando tecido animal. Os olhos bovinos para o presente estudo foram fornecidos em abatedouro, obtidos de vacas não leiteiras poucas horas após a morte, e foram dissecados imediatamente, um processo que leva até 8 h para obter os olhos. Os olhos devem ser dissecados imediatamente para preservar a esterilidade e a qualidade da dissecção. O meio de cultura é preparado para um pH de 7,4 e filtrado estéril antes da suplementação com FBS²¹. Todos os procedimentos são realizados em condições estéreis, com fontes de materiais e equipamentos listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura de lentes bovinas

1. Disseque as lentes removendo os músculos e tecidos extraoculares da esclera, removendo a metade posterior do globo e o vítreo, removendo a íris e o corpo ciliar junto com a lente e, em seguida, cortando as inserções zonulares, com o corte final posicionado de forma que a lente caia na câmara de cultura cheia de meio.
2. Cultura das lentes dissecadas em câmaras personalizadas com base adaptada ao sistema de varredura a laser, com 21 mL de meio filtrado estéril, a 37 °C e 5% de CO₂. Use meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 3% com penicilina-estreptomicina a 1%, 9,4 g/L M-199, 0,1 g/L de L-glutamina, 5,96 g/L de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio e 7 mL/L de NaOH. Armazene o meio de cultura não utilizado na geladeira por até 7 dias.
3. Substitua o meio de cultura a cada 1-2 dias. Aquecer o meio de cultura durante uma hora a 37 °C antes da utilização. Use uma pipeta Pasteur estéril conectada por sucção para aspirar o meio de uma câmara de cultura individual e reabastecer imediatamente com o meio suplementado.
4. Cultive as lentes por 48 h após a dissecção para dar tempo para que os danos físicos se manifestem. Inspecionar e analisar a qualidade óptica das lentes de acordo com a seção 4 antes da inclusão em um experimento.
   NOTA: As lentes são orientadas voltadas para baixo em preparação para o ensaio de scanner a laser.

2. Procedimento de controlo

1. Preparar uma solução com a concentração desejada de um agente solubilizante compatível com o composto químico e o meio de cultura.
2. Prepare uma solução de controle do veículo adicionando o agente solubilizante ao meio suplementado. Aquecer a solução de controlo durante uma hora a 37 °C antes da experimentação.
3. Use uma pipeta Pasteur conectada à sucção para aspirar o meio de cultura das câmaras das lentes de controle. Reabasteça as câmaras com a solução de controle. Se necessário, execute esta etapa com amostras em triplicado.
   NOTA: É necessário um volume mínimo de 7 mL para cobrir completamente a lente na posição anterior voltada para cima. As condições para controles no estudo atual foram 21 mL de controle de meio não tratado, 21 mL de um meio de controle de veículo e 7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
4. Cultive as lentes em meio de controle por 2 dias e, em seguida, substitua por um novo meio de controle de acordo com a seção 1. Para exposições de curta duração, aspirar a solução de controlo das câmaras e enxaguar pelo menos três vezes com meio de cultura não suplementado antes de retomar o protocolo de cultura do cristalino conforme descrito no ponto 1.0.
5. Deixe as lentes se aclimatarem na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por pelo menos 3.5 h antes da avaliação da qualidade óptica.

3. Procedimento de exposição

1. Preparar uma solução com a concentração desejada de um agente solubilizante compatível com o composto químico e o meio de cultura. Combine o produto químico com o agente solubilizante, permitindo o tempo adequado para interação, se necessário.
   NOTA: A 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina foi usada no presente estudo para aumentar a solubilidade do lanosterol (0,033 g / L) em meio. A solução de cloreto de benzalcônio (BAK 0,0075%) foi preparada usando PBS.
2. Incorpore o produto químico solubilizado no meio de cultura. Prepare um volume total suficiente para fornecer 21 mL de meio para todas as amostras de lentes. Aquecer o meio experimental durante uma hora a 37 °C antes da experimentação.
3. Use uma pipeta Pasteur conectada à sucção para aspirar o meio de cultura das câmaras do cristalino. Reabasteça imediatamente as câmaras com a solução de teste. Após o intervalo de exposição, substitua por meio de cultura suplementado, realizando um enxágue primeiro, se necessário. Se necessário, execute esta etapa com amostras em triplicado.
   NOTA: No presente estudo, as condições de teste foram 21 mL de meio suplementado com lanosterol e 7 mL de uma solução BAK 0,0075%. É necessário um volume mínimo de 7 mL para cobrir completamente a lente. Nesse caso, as lentes devem primeiro ser orientadas anteriormente voltadas para cima. Uma pipeta Pasteur pode ser usada para criar uma corrente na câmara de cultura com parte do meio de cultura circundante para reposicionar a lente.
4. Devolva as lentes à incubadora por pelo menos 3.5 h para aclimatação antes da avaliação da qualidade óptica.
   NOTA: As lentes são orientadas voltadas para baixo em preparação para o ensaio de scanner a laser.

4. Ensaio de qualidade óptica (lente laser-scanner)

1. Certifique-se de que as lentes estejam orientadas com a face anterior voltada para baixo e visualmente niveladas na câmara de cultura, usando a técnica da etapa 3.3 para ajustar a posição da lente, se necessário.
   NOTA: Esta posição garante que o feixe incidente seja refletido para cima através do fundo da câmara e passe pela lente da superfície anterior para a posterior.
2. Posicione uma câmara de cultura de lentes no scanner a laser de forma que o pino do carro da câmara se encaixe na ranhura na base da câmara.
3. Selecione a lente e o ponto de varredura para os quais deseja executar uma varredura, clique com o botão direito do mouse na lente de varredura e aguarde até que o scanner solicite que o feixe seja encontrado e alinhado. Selecione o início e os pontos finais bem distanciados para o feixe atrás da lente. Certifique-se de que o feixe central esteja alinhado usando os botões de ajuste bruto e fino no software do scanner e o botão de ajuste no scanner. Quando o feixe estiver alinhado, clique em calibrar e insira uma seleção apropriada de etapas radiais e separação de feixe.
   NOTA: Para este estudo usando a lente bovina, as configurações para degraus radiais e separação de feixe foram definidas para 10 degraus e 0,5 mm, respectivamente. A primeira varredura que o scanner executa serve para calibrar o scanner a laser. Isso é necessário uma vez, e todas as varreduras adicionais da lente podem ser realizadas diretamente após o alinhamento.
4. Depois que o scanner for calibrado, clique em digitalizar. Aguarde até que os valores sejam gerados para a média BVD, desvio padrão e erro ao longo de um eixo após a conclusão da varredura da lente e o escopo do feixe foi definido. Defina o osciloscópio de onde os feixes saem da lente até o ponto final desejado, selecionando a distância máxima atrás da lente e excluindo qualquer interferência aparente.
5. Use o gráfico gerado para visualizar as distâncias individuais dos vértices posteriores para cada viga.
   NOTA: Exclua feixes que passam pelas suturas da lente. Para excluir uma viga, use a legenda na tela para clicar com o botão direito do mouse em uma viga individual e selecione excluir.
6. Gire manualmente a posição da base da câmara de cultura dentro do scanner em 90°, de modo que a segunda varredura ao longo da superfície anterior da lente seja perpendicular à varredura anterior. Certifique-se de que o feixe central esteja alinhado conforme detalhado na etapa 4.3 e, em seguida, digitalize a lente.

5. Ensaio de atividade metabólica (resazurina)

1. Prepare o meio sem FBS. Aquecer o meio durante uma hora a 37 °C. Prepare 50 mL de reagente de resazurina a 8% em meio não suplementado.
   NOTA: Basta preparar 50 mL para encher todos os poços em uma placa de 12 poços. A solução deve ser preparada estéril em condições de penumbra em um recipiente opaco, pois a resazurina é sensível à luz.
2. Adicione 3,8 mL de solução de resazurina a 8% a cada poço dentro de uma placa estéril de 12 poços de fundo transparente para cobrir a lente.
3. Use colheres de metal estéreis para levantar cuidadosamente as lentes sob a superfície posterior e faça um enxágue usando uma pipeta Pasteur para lavar a lente com um pequeno volume de meio de cultura não suplementado. Coloque as lentes individualmente em cada poço.
4. Incubar a placa do poço a 37 °C e 5% de CO₂ durante 5 h. Após a incubação, remova as lentes com conchas de metal dos poços e coloque-as em um recipiente para descarte de dejetos animais. Transfira uma amostra de 100 μL de cada poço para uma placa estéril, de fundo transparente, de 96 poços.
   NOTA: As lentes podem ser avaliadas várias vezes com o ensaio de atividade metabólica. Neste caso, devolva as lentes às câmaras de cultura com meio fresco para incubação. O ensaio de atividade metabólica é melhor realizado quando todos os exames são concluídos, pois o corante pode afetar as medições de BVD.
5. Meça a fluorescência final das amostras de 100 μL usando um leitor de placa fluorescente, com os comprimentos de onda de excitação e emissão definidos em 560 nm e 590 nm, respectivamente.

6. Análise dos dados

1. Para o ensaio de qualidade óptica, calcule a média dos valores calculados pelo software para o erro BVD²⁴ das duas varreduras realizadas em cada ponto de tempo. Execute este cálculo para todas as lentes e todos os pontos de varredura.
2. Para o ensaio de atividade metabólica, colete os valores de fluorescência relativa do ponto final gerados pelo leitor de placas. Normalize os dados definindo a média de todos os valores de controle em um ponto de varredura como 100%. Calcule a atividade de cada lente como uma porcentagem do valor médio de controle para esse ponto de varredura.
3. Realize um teste de normalidade para todos os grupos experimentais. Supondo que os dados sejam normais, analise as diferenças de erro BVD entre lentes de controle e experimentais usando a ANOVA bidirecional. Além disso, execute o teste de comparações múltiplas post-hoc de Tukey. Realize uma ANOVA unidirecional e teste post-hoc de Dunnett para os dados de atividade metabólica.

A Figura 2 e a Figura 3 (n = 6) demonstram os resultados de um estudo que testou o efeito do tratamento químico (lanosterol) no cristalino bovino. O lanosterol é um esterol natural no cristalino que já mostrou resultados promissores como uma potencial intervenção farmacêutica para catarata²⁵, embora isso ainda não tenha sido comprovado²⁶. O desenho do estudo incluiu um controle de meio e veículo para o composto. Não houve diferença significativa entre o veículo (2-hidroxipropil-β-ciclodextrina) e o meio controle (p > 0,05), indicando que qualquer efeito potencial no grupo experimental provavelmente não será devido ao veículo. Não houve diferença significativa na variabilidade da BVD entre os grupos tratamento e controle (p > 0,05). Esses resultados foram consistentes com o ensaio de atividade metabólica (Figura 3). Portanto, o tratamento não introduziu toxicidade significativa para as células ou afetou significativamente o desempenho refrativo do cristalino (p > 0,05).

A Figura 4 e a Figura 5 (n = 3) mostram os resultados do tratamento com BAK no cristalino. BAK é um surfactante e o conservante mais comumente usado em formulações oftálmicas²⁷. Uma exposição de 10 minutos resultou em variabilidade BVD significativamente maior nas lentes tratadas em comparação com o controle em 4 dias após a exposição (p < 0,05). O tratamento também produziu uma diferença significativa na atividade metabólica do cristalino (p < 0,05).

Figura 1: Determinação da distância do vértice traseiro como medida de qualidade óptica usando scanner a laser. (A) Uma série de feixes é passada através da lente enquanto ela está assentada em sua câmara de cultura ao longo de um eixo. (B) Os feixes passam pela lente em intervalos especificados. A distância do vértice posterior é determinada para cada feixe, e os valores médios de BVD (em mm) e de erro BVD são gerados como medidas quantitativas da função de refração da lente. Essas informações são exibidas graficamente, com o BVD mostrado no eixo x e a posição do feixe no eixo y. Quanto mais nitidamente os feixes forem focados em um ponto consistente atrás da lente (C), menor será o valor de erro BVD calculado em comparação com lentes de pior qualidade óptica (D). Abreviatura: BVD = distância do vértice posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Efeito da suspensão de lanosterol na qualidade óptica do cristalino bovino. A variabilidade da distância do vértice traseiro reflete a capacidade da lente de refratar a luz para um único ponto. A qualidade óptica das lentes tratadas com lanosterol foi semelhante à das lentes de controle de veículos e meios não tratados (p > 0,05) (n = 6). Os dados são representados como média ± desvio padrão. Abreviatura: BVD = distância do vértice posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Efeito da suspensão de lanosterol na atividade metabólica do cristalino bovino. Atividade metabólica média das lentes bovinas, quantificada pela fluorescência relativa de um indicador metabolizado após exposição a um tratamento com lanosterol suspenso por veículo (n = 6). Os dados são representados como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Efeito do cloreto de benzalcônio na qualidade óptica do cristalino bovino. Uma exposição a BAK 0,0075% por 10 min produziu um aumento gradual da variabilidade da distância do vértice posterior dentro das lentes de tratamento (n = 3). As diferenças foram significativas entre as lentes de controle tratadas e médias 4 dias após a exposição, bem como para as lentes tratadas entre seus pontos de varredura pré e pós-exposição (p < 0,05). Os dados são representados como média ± desvio padrão. Abreviaturas: BVD = distância do vértice posterior; BAK = cloreto de benzalcónio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Efeito do cloreto de benzalcônio na atividade metabólica do cristalino bovino. O desfecho da atividade metabólica foi medido 4 dias após uma exposição de 10 minutos a BAK 0,0075% (n = 3). As alterações na atividade metabólica foram significativamente diferentes do controle (p > 0,05). Os dados são representados como média ± desvio padrão. Abreviatura: BAK = cloreto de benzalcônio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste protocolo é avaliar diretamente os efeitos de produtos químicos ou exposições ambientais no cristalino em cultura de tecidos primários. Primeiro, as lentes são dissecadas e digitalizadas quanto à qualidade óptica. A prevenção da contaminação e a garantia da qualidade da dissecação são críticas. As lentes são escaneadas em intervalos periódicos para monitorar continuamente as mudanças na função de refração em relação ao grupo de controle ou condição de pré-exposição. O ensaio de atividade metabólica representa um ponto final para determinar se as exposições afetaram o metabolismo celular. Estas são as etapas críticas para determinar se uma substância xenobiótica ou condição ambiental causa toxicidade significativa, potencialmente levando à catarata e se o cristalino pode se recuperar desse tratamento.

As lentes são digitalizadas quanto à qualidade óptica dentro de suas respectivas câmaras de cultura. Embora as lentes também possam ser expostas a uma substância de teste dentro de suas câmaras, uma das limitações deste protocolo é que as lentes são sensíveis a mudanças na osmolaridade e devem ser continuamente nutridas com soro e mantidas em um meio apropriado. Isso representa um desafio para tratamentos com longos intervalos de exposição ou baixa solubilidade em meio de cultura²⁸. Como o ensaio usa imagens de vídeo, suspensões com grandes quantidades de partículas insolúveis podem introduzir dispersão, o que não é uma indicação do desempenho da lente. As condições que produziram os dados representativos usando uma suspensão de lanosterol indicam que o protocolo pode tolerar certas suspensões de concentração de baixo nível. Embora tenha sido sugerido anteriormente que o cristalino bovino cultivado pode se correlacionar com as respostas no cristalino humano²¹, as principais diferenças, incluindo, mas não se limitando à filtração UV, compactação relacionada à idade e conteúdo de fosfolipídios, limitam a gama de substâncias para as quais este protocolo é usado apropriadamente em testes pré-clínicos^29,30.

Os testes de toxicidade ocular envolvem necessariamente uma grande bateria de testes para determinar um quadro geral da segurança e tolerância de um composto, começando com testes in vitro e em animais antes de prosseguir para os ensaios clínicos. O ensaio de lente bovina tem alto rendimento para o número de vezes que uma lente pode ser escaneada, pois o método não é destrutivo e pode ser executado facilmente em poucos minutos. No entanto, testar um grande número de lentes pode ter um baixo rendimento, pois dissecar uma lente de um olho pode ser demorado. O uso do scanner a laser tem sido mais amplamente utilizado para estudar lentes de cobaias, peixes, porcos, ratos e pintinhos 31,32,33,34,35. Idealmente, os resultados dos testes pré-clínicos fornecem informações sobre a segurança e o risco potencial em humanos. Embora as lentes humanas sejam mais úteis a esse respeito, já que as lentes humanas e animais inevitavelmente diferem em alguns casos³⁶, as lentes fornecidas pelo matadouro são úteis para equilibrar os recursos disponíveis e a ética. Este protocolo representa um método in vitro sensível, reprodutível, não tóxico e objetivo para testar as condições celulares e funcionais do cristalino em resposta ao tratamento.

Em comparação com o padrão in vivo atual para testes de toxicidade ocular, o scanner a laser de lentes fornece uma avaliação direta dos efeitos de exposições potencialmente tóxicas na lente. Devido à origem comum do tecido embriológico do cristalino e da córnea, bem como às semelhanças funcionais, como transparência e refração, a cultura primária do cristalino representa um modelo adequado para irritação ocular. Estudos preliminares de validação do scanner a laser de lentes mostraram resultados comparáveis em relação ao teste de Draize e até se mostraram mais sensíveis sem infligir nenhum desconforto a um animal vivo¹⁸. Esses resultados são coletados adicionalmente de forma objetiva, sem a interpretação de um observador.

As medições do ensaio do scanner a laser da lente são diretamente relevantes para a função natural da lente in vivo. Além disso, ao contrário dos ensaios que cultivam a córnea ou linhagens celulares, o cristalino bovino mantém sua função refrativa usando o método de cultura celular de longo prazo desenvolvido, e o ensaio de qualidade óptica pode ser realizado mantendo o cristalino em seu ambiente. O resultado é que, ao contrário de outros ensaios que produzem um único ponto final como resultado do próprio teste danificar a lente, o ensaio de qualidade óptica pode ser realizado repetidamente durante a cultura bem-sucedida da lente por até 1000 h²⁴.

Como o cristalino é amplamente desprovido de organelas, com exceção do epitélio anterior e das fibras corticais superficiais, essas células desempenham funções de organelas para todo o cristalino³⁷. É simples, então, entender a conexão entre as alterações celulares e a indução de catarata do cristalino, como observado in vitro e in vivo^15,19. A atividade metabólica do cristalino representa essencialmente a atividade da monocamada epitelial anterior. Embora ensaios semelhantes à resazurina estejam disponíveis, por exemplo, sais de tetrazólio, incluindo MTT, XTT, MTS e WST, a resazurina fornece um ensaio não tóxico e sensível altamente compatível com a cultura primária do cristalino. Ao contrário do MTT, que requer a solubilização de cristais precipitados, o protocolo de resazurina não envolve soluções que possam induzir lise. Além disso, estudos de cultura de células implicaram que o desfecho da resazurina é mais sensível do que os ensaios de sal de tetrazólio³⁸.

Este método é projetado para modelar a resposta da lente como um tecido ocular e dispositivo óptico a várias exposições químicas e ambientais. Os dois compostos representativos escolhidos para esta investigação são o cloreto de benzalcônio, um conservante em soluções oftálmicas, e o lanosterol, um esterol previamente estudado como parte de um esforço para encontrar intervenções farmacêuticas para catarata. Os resultados demonstram estresse do cristalino em resposta ao conservante e nenhuma resposta significativa ao lanosterol. Este método pode ser usado ainda mais para estudar a toxicidade de potenciais tratamentos farmacêuticos para catarata.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Obrigado ao Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) e ao Fundo Fiduciário de Educação Optométrica Canadense (COETF) pelos fundos para este projeto.