Système de culture d’organes pour l’évaluation de la toxicité d’excipients et de produits pharmaceutiques de traitement intraoculaire

L’objectif de ce protocole est d’évaluer les changements dans l’activité métabolique et la fonction réfractive du cristallin en réponse à un traitement expérimental.

En tant que principale cause de cécité, la cataracte représente un fardeau important pour les dizaines de millions de personnes touchées par cette maladie dans le monde. L’exposition aux produits chimiques, parmi d’autres facteurs environnementaux, est une cause établie de cataractes. Les tests de toxicité oculaire peuvent évaluer si les produits pharmaceutiques et leurs composants peuvent contribuer à des lésions du cristallin pouvant entraîner des cataractes ou faciliter le traitement de la cataracte.

Les études in vitro et les essais in vivo sur les animaux peuvent être utilisés pour évaluer l’innocuité des produits chimiques avant les études cliniques. Le test de Draize, la norme actuelle in vivo pour les tests de toxicité oculaire et d’irritance, a été critiqué pour son manque de sensibilité et de mesures objectives permettant de déterminer la toxicité oculaire. Les essais cellulaires in vitro sont limités, car les cultures cellulaires ne peuvent pas modéliser correctement un cristallin fonctionnel intact.

La méthode décrite ici est une alternative in vitro sensible à l’expérimentation animale, conçue pour évaluer la réponse du cristallin bovin intact au traitement à la fois au niveau de l’activité cellulaire et de la performance de réfraction globale. La résazurine, un réactif non toxique, est métabolisée proportionnellement au niveau d’activité cellulaire. Le test du scanner laser à lentille mesure la capacité de la lentille à réfracter les faisceaux de lumière incidents en un seul point avec une erreur minimale, directement liée à sa fonction naturelle. La méthode peut être utilisée pour déterminer les changements aigus et retardés du cristallin, ainsi que la récupération du cristallin à la suite d’expositions chimiques ou environnementales.

Touchant plus de 20 millions de personnes, la cataracte est la cause la plus répandue de cécité dans le monde ^1,2. Les cataractes sont le plus souvent dues à des changements du cristallin liés à l’âge, mais sont également induites par un traumatisme, des conditions génétiques, une maladie ou une exposition toxique². Actuellement, le traitement implique une intervention chirurgicale pour remplacer le cristallin, une procédure coûteuse et invasive accessible principalement aux personnes des pays développés. Le lourd fardeau de la cataracte a orienté des décennies de recherche vers la prévention de la cataracte et le développement de traitements non chirurgicaux. Dans les deux cas, l’importance des tests précliniques pour la toxicité, l’efficacité et la pharmacocinétique des médicaments ophtalmiques est primordiale. Ce processus de développement de médicaments repose en grande partie sur les informations fournies par des études réalisées sur des animaux.

La norme actuelle pour les essais de toxicité oculaire in vivo est l’essai de Draize, qui consiste à administrer un composé d’essai dans le sac conjonctival d’un animal vivant. Le test a été considérablement critiqué, en particulier en ce qui concerne l’éthique animale, la subjectivité, la faible répétabilité et la variabilité³. De plus, aucun élément du test de Draize ne surveille directement les effets des substances d’essai sur le cristallin. Des efforts considérables ont été investis dans le développement de modèles alternatifs in vitro ⁴. Cependant, aucun n’a été suffisamment validé pour remplacer le test^de Draize 5. De même, beaucoup de ces modèles sont confrontés à des limites en ce qui concerne l’application directe à la cataracte et à d’autres pathologies complexes⁶. Par exemple, les méthodes d’étalonnage de la transparence de l’objectif lorsqu’elles sont placées sur une grille sont intrinsèquement subjectives⁷. Les études de culture cellulaire sont fiables et très utilisées, bien que les caractéristiques des monocouches cellulaires puissent diverger de celles de la culture tissulaire primaire⁸.

Des lentilles entières peuvent être disséquées à partir des yeux d’animaux et cultivées pour conserver leur structure et leur fonction d’origine. Un test utile pour évaluer la fonction du cristallin tout en maintenant l’état de l’organe est le test au scanner laser à lentille impliquant un scanner développé à l’Université de Waterloo au Canada. Le test est un système de balayage qui utilise une série de projections laser pour mesurer la qualité optique ou les performances de réfraction de la lentille. Les lentilles sont balayées dans leurs chambres de culture personnalisées à deux segments, ce qui permet aux faisceaux de passer par le bas à travers la lentille (Figure 1A). Une caméra fixée à l’intérieur du scanner capture l’image du laser passant à travers l’objectif en de nombreux points. Le logiciel du scanner calcule la distance derrière l’objectif à laquelle elle intersecte un axe central (distance au sommet arrière, BVD), produisant une série de mesures qui indiquent la cohérence avec laquelle l’objectif focalise la lumière sur un seul point (Figure 1).

Les propriétés cellulaires de la lentille, telles que la disposition serrée et ordonnée de ses cellules, aident à maintenir la transparence et à minimiser la diffusion afin que la lentille puisse focaliser la lumière de manière fonctionnelle⁹. Cette mesure peut être utilisée pour interpréter l’importance de la perturbation de la structure essentielle du cristallin, comme l’indice de réfraction du gradient, et la quantité de fonction compromise en raison des opacités induites. D’autres études qui ont suivi la réponse des lentilles cultivées et des vésicules du cristallin suggèrent que la diffusion de la lumière est le produit de changements structurels, par rapport aux changements métaboliques, et que les perturbations des lipides et des protéines du cristallin peuvent affecter l’indice de réfraction et, par conséquent, augmenter la diffusion^10,11.

Le scanner laser à lentille peut être utilisé en conjonction avec des réactifs métaboliques dans des tests pour déterminer les mesures biochimiques de la toxicité cellulaire. La résazurine est un réactif chimique non toxique métabolisé par les cellules actives, produisant un produit réduit (résorufine) avec une fluorescence mesurable¹². Le cristallin est en grande partie dépourvu d’organites, à l’exception des mitochondries métaboliquement actives concentrées dans l’épithélium antérieur et les cellules corticales superficielles des fibres, répondant aux besoins énergétiques du cristallin^13,14. Les lésions du cristallin au niveau cellulaire peuvent perturber le métabolisme et précèdent souvent l’apparition de changements structurels pathogènes et de la cataracte¹⁵.

Le but de cette méthode est d’évaluer l’effet des expositions aux xénobiotiques et à l’environnement sur le cristallin, ce qui peut contribuer au développement de la cataracte. Le protocole comprend deux essais pour évaluer l’effet d’un traitement utilisant le cristallin bovin en culture. L’avantage de cette approche est qu’elle fournit une évaluation à la fois cellulaire et fonctionnelle de la façon dont le cristallin en tant que tissu primaire répond au traitement. Il s’agit d’une évaluation sensible et objective de l’objectif par rapport à d’autres méthodes courantes 16,17,18.

Le modèle a été utilisé avec succès pour évaluer les effets de diverses expositions, y compris les tensioactifs, les produits de consommation, les alcools et les rayons ultraviolets 17,19,20. Des changements dans la qualité optique sont constamment présents dans les lentilles de culture en réponse à une exposition toxique²¹. La capacité de cette méthode à maintenir la culture à long terme du cristallin est bien adaptée pour surveiller l’effet potentiellement retardé d’un composé et la récupération du cristallin après des dommages induits ou une cataracte^22,23. Les résultats obtenus grâce à l’application de ce protocole peuvent être utilisés pour réduire la dépendance à l’égard de l’expérimentation animale dans le développement de produits ophtalmiques.

Tous les protocoles expérimentaux ont été réalisés conformément aux politiques d’éthique de l’Université de Waterloo pour la recherche utilisant des tissus animaux. Les yeux de bovins de la présente étude ont été fournis par l’abattoir, obtenus à partir de vaches non laitières quelques heures après la mort, et ont été disséqués immédiatement, un processus qui prend jusqu’à 8 heures à partir de l’obtention des yeux. Les yeux doivent être disséqués immédiatement pour préserver la stérilité et la qualité de la dissection. Le milieu de culture est préparé à un pH de 7,4 et filtré stérilement avant d’être complété par FBS²¹. Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles, les sources de matériaux et d’équipements étant répertoriées dans la table des matériaux.

1. Culture du cristallin bovin

1. Disséquez les lentilles en enlevant les muscles et les tissus extraoculaires de la sclère, en enlevant la moitié postérieure du globe et du vitré, en enlevant l’iris et le corps ciliaire avec le cristallin, puis en coupant les attaches zonulaires, la coupe finale étant positionnée de telle sorte que le cristallin tombera dans la chambre de culture remplie de moyen.
2. Cultivez les lentilles disséquées dans des chambres personnalisées avec une base adaptée au système de balayage laser, avec 21 mL de milieu filtré stérile, à 37 °C et 5 % de CO₂. Utiliser un milieu de culture supplémenté en sérum de bovin fœtal à 3 % avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 9,4 g/L de M-199, 0,1 g/L de L-glutamine, 5,96 g/L de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonate de sodium et 7 mL/L de NaOH. Conservez le milieu de culture inutilisé au réfrigérateur jusqu’à 7 jours.
3. Remplacez le milieu de culture tous les 1 à 2 jours. Réchauffez le milieu de culture pendant une heure à 37 °C avant de l’utiliser. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile raccordée à l’aspiration, aspirez le milieu d’une chambre de culture individuelle et remplissez-le immédiatement avec le milieu supplémenté.
4. Cultivez le cristallin pendant 48 h après la dissection pour laisser le temps aux dommages physiques de se manifester. Inspectez et scannez les lentilles pour en vérifier la qualité optique conformément à la section 4 avant de les inclure dans une expérience.
   REMARQUE : Les lentilles sont orientées face vers le bas en préparation du test par scanner laser.

2. Procédure de contrôle

1. Préparez une solution avec la concentration souhaitée d’un agent solubilisant compatible avec le composé chimique et le milieu de culture.
2. Préparez une solution de contrôle du véhicule en ajoutant l’agent solubilisant au milieu supplémenté. Réchauffez la solution de contrôle pendant une heure à 37 °C avant l’expérimentation.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur reliée à l’aspiration, aspirer le milieu de culture à partir des chambres des lentilles de contrôle. Remplissez les chambres avec la solution de contrôle. Si nécessaire, effectuez cette étape avec des échantillons en trois exemplaires.
   REMARQUE : Un volume minimum de 7 ml est nécessaire pour couvrir complètement la lentille en position antérieure face vers le haut. Les conditions pour les témoins dans la présente étude étaient de 21 mL de milieu témoin non traité, de 21 mL d’un milieu témoin de véhicule et de 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Cultivez les lentilles dans le milieu témoin pendant 2 jours, puis remplacez-les par un nouveau milieu témoin conformément à la section 1. Pour les expositions à court terme, aspirer la solution de contrôle des chambres et effectuer un rinçage au moins trois fois avec un milieu de culture non supplémenté avant de reprendre le protocole de culture du cristallin tel que décrit à la section 1.0.
5. Laisser les lentilles s’acclimater dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 3,5 h avant l’évaluation de la qualité optique.

3. Procédure d’exposition

1. Préparez une solution avec la concentration souhaitée d’un agent solubilisant compatible avec le composé chimique et le milieu de culture. Combinez le produit chimique avec l’agent solubilisant, en laissant le temps approprié pour l’interaction si nécessaire.
   REMARQUE : La 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine a été utilisée dans l’étude actuelle pour améliorer la solubilité du lanostérol (0,033 g/L) dans le milieu. Une solution de chlorure de benzalkonium (BAK 0,0075 %) a été préparée à l’aide de PBS.
2. Incorporer le produit chimique solubilisé dans le milieu de culture. Préparez un volume total suffisant pour fournir 21 ml de support à tous les échantillons de lentilles. Réchauffez le milieu expérimental pendant une heure à 37 °C avant l’expérimentation.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur reliée à l’aspiration, aspirer le milieu de culture des chambres de la lentille. Remplissez immédiatement les chambres avec la solution d’essai. Après l’intervalle d’exposition, remplacer par un milieu de culture supplémenté, en effectuant d’abord un rinçage si nécessaire. Si nécessaire, effectuez cette étape avec des échantillons en trois exemplaires.
   REMARQUE : Dans la présente étude, les conditions d’essai étaient de 21 mL de milieu supplémenté en lanostérol et de 7 mL d’une solution de BAK à 0,0075 %. Un volume minimum de 7 ml est nécessaire pour couvrir complètement la lentille. Dans ce cas, les verres doivent d’abord être orientés vers l’avant, face vers le haut. Une pipette Pasteur peut être utilisée pour créer un courant dans la chambre de culture avec une partie du milieu de culture environnant pour repositionner la lentille.
4. Remettez les lentilles dans l’incubateur pendant au moins 3,5 h pour qu’elles s’acclimatent avant l’évaluation de la qualité optique.
   REMARQUE : Les lentilles sont orientées face vers le bas en préparation du test par scanner laser.

4. Dosage de la qualité optique (scanner laser à lentille)

1. Assurez-vous que les lentilles sont orientées avec l’avant vers le bas et visuellement au niveau dans la chambre de culture, en utilisant la technique de l’étape 3.3 pour ajuster la position de la lentille si nécessaire.
   REMARQUE : Cette position garantit que le faisceau incident sera réfléchi vers le haut à travers le fond de la chambre et passera à travers la lentille de la surface antérieure à la surface postérieure.
2. Positionnez une chambre de culture de lentille dans le scanner laser de manière à ce que la goupille du chariot de la chambre s’insère dans la fente de la base de la chambre.
3. Sélectionnez l’objectif et le point de balayage pour lesquels effectuer un balayage, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objectif de balayage et attendez que le scanner vous invite à trouver le faisceau et à l’aligner. Sélectionnez des points de départ et d’arrivée bien éloignés pour le faisceau derrière l’objectif. Assurez-vous que le faisceau central est aligné à l’aide des boutons de réglage brut et fin du logiciel du scanner et du bouton de réglage du scanner. Lorsque la poutre est alignée, cliquez sur calibrer et saisissez une sélection appropriée de pas radiaux et de séparation de poutre.
   REMARQUE : Pour cette étude utilisant la lentille bovine, les réglages des pas radiaux et de la séparation du faisceau ont été réglés à 10 pas et 0,5 mm, respectivement. Le premier balayage effectué par le scanner sert à calibrer le scanner laser. Ceci est nécessaire une seule fois, et tous les balayages supplémentaires de l’objectif peuvent être effectués directement après l’alignement.
4. Une fois le scanner calibré, cliquez sur scan. Attendez que des valeurs soient générées pour la moyenne BVD, l’écart-type et l’erreur le long d’un axe après la fin du balayage de l’objectif, et que la portée du faisceau ait été définie. Réglez la lunette à partir de laquelle les faisceaux sortent de la lentille jusqu’au point final souhaité, en sélectionnant la distance maximale derrière la lentille tout en excluant toute interférence apparente.
5. Utilisez le graphique généré pour afficher les distances individuelles des sommets arrière de chaque poutre.
   REMARQUE : Exclure les faisceaux passant à travers les sutures du cristallin. Pour exclure une ligature, utilisez la légende à l’écran pour cliquer avec le bouton droit de la souris sur une poutre individuelle et sélectionner Exclure.
6. Faites pivoter manuellement la position de la base de la chambre de culture à l’intérieur du scanner de 90°, de sorte que le deuxième balayage le long de la surface antérieure de la lentille soit perpendiculaire au balayage précédent. Assurez-vous que le faisceau central est aligné comme indiqué à l’étape 4.3, puis balayez l’objectif.

5. Dosage de l’activité métabolique (résazurine)

1. Préparez un milieu sans FBS. Réchauffez le milieu pendant une heure à 37 °C. Préparer 50 ml de réactif de résazurine à 8 % dans un milieu non supplémenté.
   REMARQUE : Il suffit de préparer 50 mL pour remplir tous les puits dans une plaque de 12 puits. La solution doit être préparée stérile dans des conditions sombres dans un récipient opaque, car la résazurine est sensible à la lumière.
2. Ajouter 3,8 ml de solution de résazurine à 8 % dans chaque puits à l’intérieur d’une plaque stérile à 12 puits à fond transparent pour couvrir le cristallin.
3. À l’aide de cuillères métalliques stériles, soulevez soigneusement les lentilles sous la surface postérieure et rincez-les à l’aide d’une pipette Pasteur pour laver la lentille avec un petit volume de milieu de culture non supplémenté. Placez les lentilles individuellement dans chaque puits.
4. Incuber la plaque du puits à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 5 h. Après l’incubation, retirez les lentilles avec des pelles métalliques des puits et placez-les dans un conteneur d’élimination des déchets animaux. Transvaser un échantillon de 100 μL de chaque puits dans une plaque stérile, à fond transparent et à 96 puits.
   REMARQUE : Les lentilles peuvent être évaluées plusieurs fois avec le test d’activité métabolique. Dans ce cas, retournez les lentilles dans les chambres de culture avec un milieu frais pour l’incubation. Il est préférable d’effectuer le test d’activité métabolique une fois que tous les examens sont terminés, car le colorant peut affecter les mesures de BVD.
5. Mesurez la fluorescence finale des échantillons de 100 μL à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes, avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission réglées à 560 nm et 590 nm, respectivement.

6. Analyse des données

1. Pour le test de qualité optique, calculez la moyenne des valeurs calculées par logiciel pour l’erreur^{BVD 24} à partir des deux balayages effectués à chaque point temporel. Effectuez ce calcul pour tous les objectifs et tous les points de balayage.
2. Pour le test d’activité métabolique, recueillir les valeurs de fluorescence relatives du point final générées par le lecteur de plaques. Normalisez les données en fixant la moyenne de toutes les valeurs de contrôle à un point de balayage sur 100 %. Calculez l’activité de chaque objectif en pourcentage de la valeur de contrôle moyenne pour ce point de balayage.
3. Effectuez un test de normalité pour tous les groupes de tests. En supposant que les données sont normales, analysez les différences d’erreur BVD entre les lentilles de contrôle et expérimentales à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs. De plus, effectuez le test de comparaisons multiples post-hoc de Tukey. Effectuez une ANOVA à sens unique et un test post-hoc de Dunnett pour les données d’activité métabolique.

Les figures 2 et 3 (n = 6) présentent les résultats d’une étude testant l’effet d’un traitement chimique (lanostérol) sur le cristallin bovin. Le lanostérol est un stérol naturellement présent dans le cristallin qui a déjà montré des résultats prometteurs en tant qu’intervention pharmaceutique potentielle pour la cataracte²⁵, bien que cela n’ait pas encore été prouvé²⁶. La conception de l’étude comprenait un moyen et un véhicule de contrôle pour le composé. Il n’y avait pas de différence significative entre le témoin véhiculaire (2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine) et le témoin moyen (p > 0,05), ce qui indique qu’il est peu probable qu’un effet potentiel dans le groupe expérimental soit dû au véhicule. Il n’y avait pas de différence significative dans la variabilité de la BVD entre le groupe de traitement et le groupe témoin (p > 0,05). Ces résultats étaient cohérents avec le test d’activité métabolique (figure 3). Par conséquent, le traitement n’a pas introduit de toxicité significative pour les cellules ni affecté de manière significative les performances de réfraction du cristallin (p > 0,05).

Les figures 4 et 5 (n = 3) montrent les résultats du traitement avec BAK sur le verre. BAK est un tensioactif et le conservateur le plus couramment utilisé dans les formulations ophtalmiques²⁷. Une exposition de 10 minutes a entraîné une variabilité significativement plus importante de la BVD dans les lentilles traitées par rapport au témoin à 4 jours après l’exposition (p < 0,05). Le traitement a également produit une différence significative dans l’activité métabolique du cristallin (p < 0,05).

Figure 1 : Détermination de la distance du sommet arrière comme mesure de la qualité optique à l’aide d’un scanner laser. (A) Une série de faisceaux traversent la lentille pendant qu’elle est assise dans sa chambre de culture le long d’un axe. (B) Les faisceaux traversent la lentille à des intervalles spécifiés. La distance du sommet arrière est déterminée pour chaque faisceau, et les valeurs moyennes de BVD (en mm) et d’erreur BVD sont générées comme mesures quantitatives de la fonction de réfraction de la lentille. Ces informations sont affichées graphiquement, avec BVD indiqué sur l’axe des x et la position du faisceau sur l’axe des y. Plus les faisceaux sont focalisés sur un point cohérent derrière la lentille (C), plus la valeur d’erreur BVD calculée est faible par rapport aux lentilles de moins bonne qualité optique (D). Abréviation : BVD = distance du sommet arrière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Effet de la suspension du lanostérol sur la qualité optique du cristallin bovin. La variabilité de la distance du sommet arrière reflète la capacité de la lentille à réfracter la lumière en un seul point. La qualité optique des lentilles traitées au lanostérol était similaire à celle des lentilles de contrôle moyennes et de véhicule non traitées (p > 0,05) (n = 6). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Abréviation : BVD = distance du sommet arrière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effet de la suspension de lanostérol sur l’activité métabolique du cristallin bovin. Activité métabolique moyenne du cristallin bovin, quantifiée par la fluorescence relative d’un indicateur métabolisé après exposition à un traitement au lanostérol en suspension dans un véhicule (n = 6). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet du chlorure de benzalkonium sur la qualité optique du cristallin bovin. Une exposition à BAK 0,0075 % pendant 10 min a produit une augmentation progressive de la variabilité de la distance du sommet arrière dans les verres de traitement (n = 3). Les différences étaient significatives entre les objectifs traités et les objectifs témoins moyens 4 jours après l’exposition, ainsi que pour les objectifs traités entre leurs points de balayage pré-exposition et post-exposition (p < 0,05). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Abréviations : BVD = distance du sommet arrière ; BAK = chlorure de benzalkonium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Effet du chlorure de benzalkonium sur l’activité métabolique du cristallin bovin. Le paramètre de l’activité métabolique a été mesuré 4 jours après une exposition de 10 minutes à BAK 0,0075 % (n = 3). Les changements dans l’activité métabolique étaient significativement différents de ceux du témoin (p > 0,05). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Abréviation : BAK = chlorure de benzalkonium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’objectif de ce protocole est d’évaluer directement les effets des expositions chimiques ou environnementales sur le cristallin dans la culture de tissus primaires. Tout d’abord, les objectifs sont disséqués et scannés pour en vérifier la qualité optique. La prévention de la contamination et la qualité de la dissection sont essentielles. Les lentilles sont balayées à intervalles réguliers pour surveiller en permanence les changements de la fonction de réfraction par rapport au groupe de contrôle ou aux conditions de préexposition. Le test d’activité métabolique représente un paramètre permettant de déterminer si les expositions ont eu un impact sur le métabolisme cellulaire. Il s’agit des étapes essentielles pour déterminer si une substance xénobiotique ou une condition environnementale provoque une toxicité importante, pouvant entraîner des cataractes, et si le cristallin peut se rétablir de ce traitement.

La qualité optique des lentilles est analysée dans leurs chambres de culture respectives. Bien que les lentilles puissent également être exposées à une substance d’essai dans leur chambre, l’une des limites de ce protocole est que les lentilles sont sensibles aux changements d’osmolarité et doivent être continuellement nourries avec du sérum et maintenues dans un milieu approprié. Cela représente un défi pour les traitements avec de longs intervalles d’exposition ou une faible solubilité dans le milieu de culture²⁸. Comme le test utilise l’imagerie vidéo, les suspensions contenant de grandes quantités de particules insolubles peuvent introduire une diffusion, ce qui n’est pas une indication de la performance de l’objectif. Les conditions qui ont produit les données représentatives lors de l’utilisation d’une suspension de lanostérol indiquent que le protocole peut tolérer certaines suspensions à faible concentration. Bien qu’il ait été suggéré précédemment que le cristallin bovin en culture peut être corrélé avec les réponses dans le cristallin humain²¹, des différences clés, y compris, mais sans s’y limiter, la filtration UV, le compactage lié à l’âge et la teneur en phospholipides, limitent la gamme de substances pour lesquelles ce protocole est utilisé de manière appropriée dans les essais précliniques^29,30.

Les tests de toxicité oculaire impliquent nécessairement une grande batterie de tests pour déterminer une image générale de l’innocuité et de la tolérance d’un composé, en commençant par des essais in vitro et sur des animaux avant de passer aux essais cliniques. Le test du cristallin bovin a un débit élevé pour le nombre de fois qu’un objectif peut être scanné, car la méthode est non destructive et peut être réalisée facilement en quelques minutes. Cependant, le test d’un grand nombre de lentilles peut avoir un faible débit, car la dissection d’une lentille à partir d’un œil peut prendre beaucoup de temps. L’utilisation du scanner laser a été plus largement utilisée pour étudier les lentilles de cobaye, de poisson, de cochon, de rat et de poussin 31,32,33,34,35. Idéalement, les résultats des essais précliniques donnent un aperçu de l’innocuité et du risque potentiel chez l’homme. Bien que les lentilles humaines soient les plus utiles à cet égard, car les lentilles humaines et animales différeront inévitablement dans certains cas³⁶, les lentilles fournies par l’abattoir sont utiles pour équilibrer les ressources disponibles et l’éthique. Ce protocole représente une méthode in vitro sensible, reproductible, non toxique et objective pour tester les conditions cellulaires et fonctionnelles du cristallin en réponse au traitement.

Par rapport à la norme in vivo actuelle pour les tests de toxicité oculaire, le scanner laser à lentille fournit une évaluation directe des effets d’expositions potentiellement toxiques sur le verre. En raison de l’origine tissulaire embryologique commune du cristallin et de la cornée, ainsi que de similitudes fonctionnelles telles que la transparence et la réfraction, la culture primaire du cristallin représente un modèle approprié pour l’irritation oculaire. Des études préliminaires de validation du scanner laser à lentille ont montré des résultats comparables par rapport au test de Draize et se sont même révélées plus sensibles sans infliger d’inconfort à un animal vivant¹⁸. Ces résultats sont en outre collectés objectivement, sans l’interprétation d’un observateur.

Les mesures de dosage du scanner laser à lentille sont directement liées à la fonction naturelle de la lentille in vivo. De plus, contrairement aux tests qui cultivent la cornée ou les lignées cellulaires, le cristallin bovin maintient sa fonction de réfraction en utilisant la méthode de culture cellulaire à long terme développée, et le test de qualité optique peut être effectué tout en maintenant le cristallin dans son environnement. Le résultat est que, contrairement à d’autres tests qui produisent un seul point final à la suite de l’endommagement de l’objectif par le test lui-même, le test de qualité optique peut être effectué à plusieurs reprises tout en cultivant avec succès l’objectif jusqu’à 1000 h²⁴.

Comme le cristallin est largement dépourvu d’organites, à l’exception de l’épithélium antérieur et des cellules superficielles des fibres corticales, ces cellules remplissent des fonctions organitaires pour l’ensemble du cristallin³⁷. Il est alors simple de comprendre le lien entre les modifications cellulaires et l’induction de la cataracte du cristallin, comme observé in vitro et in vivo^15,19. L’activité métabolique du cristallin représente essentiellement l’activité de la monocouche épithéliale antérieure. Bien qu’il existe des dosages similaires à la résazurine, par exemple, des sels de tétrazolium, notamment MTT, XTT, MTS et WST, la résazurine fournit un test non toxique et sensible hautement compatible avec la culture primaire du cristallin. Contrairement au MTT qui nécessite la solubilisation de cristaux précipités, le protocole de la résazurine n’implique pas de solutions susceptibles d’induire une lyse. De plus, des études de culture cellulaire ont laissé entendre que le critère d’effet de la résazurine est plus sensible que les dosages au sel de tétrazolium³⁸.

Cette méthode est conçue pour modéliser la réponse du cristallin en tant que tissu oculaire et dispositif optique à diverses expositions chimiques et environnementales. Les deux composés représentatifs choisis pour cette étude sont le chlorure de benzalkonium, un conservateur dans les solutions ophtalmiques, et le lanostérol, un stérol précédemment étudié dans le cadre d’un effort visant à trouver des interventions pharmaceutiques pour la cataracte. Les résultats démontrent une contrainte du cristallin en réponse au conservateur et aucune réponse significative au lanostérol. Cette méthode pourrait être utilisée davantage pour étudier la toxicité de traitements pharmaceutiques potentiels pour la cataracte.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Merci au Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et au Fonds fiduciaire canadien pour l’enseignement de l’optométrie (FCEO) pour les fonds alloués à ce projet.