מערכת תרבית איברים להערכת הרעילות של חומרי עזר לטיפול תוך עיני ותרופות

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך שינויים בפעילות המטבולית ובתפקוד השבירה של העדשה בתגובה לטיפול ניסיוני.

כגורם המוביל לעיוורון, קטרקט מהווה נטל משמעותי עבור עשרות מיליוני אנשים ברחבי העולם המושפעים ממצב זה. חשיפה לכימיקלים, בין שאר הגורמים הסביבתיים, היא גורם מבוסס לקטרקט. בדיקת רעילות עיניים יכולה להעריך אם תרופות ומרכיביהן עלולים לתרום לנזק לעדשות שעלול להוביל לקטרקט או לסייע בטיפול בקטרקט.

ניתן להשתמש במחקרי מבחנה וניסויים בבעלי חיים in vivo להערכת הבטיחות של כימיקלים לפני מחקרים קליניים. מבחן Draize - התקן הנוכחי in vivo לבדיקת רעילות וגירוי בעיניים - זכה לביקורת על חוסר רגישות ומדידות אובייקטיביות לקביעת רעילות עיניים. בדיקות מבוססות תאים במבחנה מוגבלות מכיוון שתרביות תאים אינן יכולות לדגמן כראוי עדשה פונקציונלית שלמה.

השיטה המתוארת כאן היא חלופה רגישה במבחנה לניסויים בבעלי חיים, שנועדה להעריך את תגובת עדשת הבקר השלמה לטיפול הן ברמת הפעילות התאית והן לביצועי השבירה הכוללים. המגיב הלא רעיל רזזורין עובר חילוף חומרים ביחס לרמת פעילות התא. בדיקת סורק הלייזר של העדשה מודדת את יכולתה של העדשה לשבור קרני אור לנקודה אחת עם שגיאה מינימלית, הרלוונטית ישירות לתפקודה הטבעי. השיטה עשויה לשמש לקביעת שינויים חריפים ומאוחרים בעדשה, כמו גם התאוששות העדשה מחשיפות כימיות או סביבתיות.

קטרקט, המשפיע על למעלה מ-20 מיליון אנשים, הוא הגורם השכיח ביותר לעיוורון ברחבי העולם ^1,2. קטרקט נובע לרוב משינויים הקשורים לגיל בעדשה אך נגרם גם מטראומה, מצבים גנטיים, מחלות או חשיפות רעילות². כיום הטיפול כולל התערבות כירורגית להחלפת העדשה, הליך יקר ופולשני הנגיש בעיקר למדינות המפותחות. הנטל הנרחב של קטרקט הפנה עשרות שנים של מחקר למניעת קטרקט ופיתוח טיפול לא ניתוחי. בשני המקרים, החשיבות של בדיקות פרה-קליניות לרעילות, יעילות ופרמקוקינטיקה של תרופות עיניים היא בעלת חשיבות עליונה. תהליך זה של פיתוח תרופות מסתמך במידה רבה על המידע המסופק על ידי מחקרים שבוצעו בבעלי חיים.

התקן הנוכחי לבדיקת רעילות עיניים in vivo הוא מבחן Draize, הכולל מסירת תרכובת בדיקה לשק הלחמית של בעל חיים חי. המבחן זכה לביקורת משמעותית, במיוחד בכל הנוגע לאתיקה של בעלי חיים, סובייקטיביות, חזרתיות גרועה ושונות³. בנוסף, אין מרכיב בבדיקת Draize המנטר ישירות את השפעות חומרי הבדיקה על העדשה. מאמץ ניכר הושקע בפיתוח מודלים חלופיים במבחנה ⁴. עם זאת, אף אחד מהם לא אומת מספיק כדי להחליף את מבחן דרייז⁵. באופן דומה, רבים מהמודלים הללו מתמודדים עם מגבלות ביחס ליישום ישיר על קטרקט ופתולוגיות מורכבות אחרות⁶. לדוגמה, שיטות המדרגות שקיפות עדשה כאשר הן מונחות על רשת הן סובייקטיביות מטבען⁷. מחקרי תרביות תאים אמינים ומנוצלים מאוד, אם כי מאפייני תאים חד-שכבתיים עשויים לסטות מתרבית רקמה ראשונית⁸.

ניתן לנתח עדשות שלמות מעיניהם של בעלי חיים ולתרבת אותן כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהן. בדיקה אחת שימושית להערכת תפקוד העדשה תוך שמירה על מצב האיבר היא בדיקת סורק הלייזר של העדשה הכוללת סורק שפותח באוניברסיטת ווטרלו בקנדה. הבדיקה היא מערכת סריקה המשתמשת בסדרה של הקרנות לייזר כדי למדוד את האיכות האופטית או ביצועי השבירה של העדשה. העדשות נסרקות בתאי התרבית הדו-מקטעים המותאמים אישית שלהן, מה שמאפשר לאלומות לעבור מלמטה דרך העדשה (איור 1A). מצלמה קבועה בתוך הסורק מצלמת את תמונת הלייזר העובר דרך העדשה בנקודות רבות. תוכנת הסורק מחשבת את המרחק מאחורי העדשה שבו היא מצטלבת עם ציר מרכזי (מרחק קודקוד אחורי, BVD), ומייצרת סדרה של מדידות המצביעות על מידת העקביות שבה העדשה ממקדת אור לנקודה אחת (איור 1).

המאפיינים התאיים של העדשה, כגון הסידור ההדוק והמסודר של התאים שלה, עוזרים לשמור על שקיפות ולמזער את הפיזור כך שהעדשה תוכל למקד את האור באופן פונקציונלי⁹. ניתן להשתמש במדד זה כדי לפרש עד כמה כימיקל משבש באופן משמעותי את המבנה החיוני של העדשה, כגון מקדם השבירה של השיפוע, וכמה תפקוד נפגע בגלל האטימות המושרת. מחקרים אחרים שעקבו אחר התגובה של עדשות מתורבתות ושלפוחיות עדשות מצביעים על כך שפיזור האור הוא תוצר של שינויים מבניים, בהשוואה לשינויים מטבוליים, וכי שיבושים בשומנים ובחלבונים של העדשות עלולים להשפיע על מקדם השבירה וכתוצאה מכך להגביר את הפיזור^10,11.

ניתן להשתמש בסורק הלייזר של העדשה בשילוב עם ריאגנטים מטבוליים בבדיקות כדי לקבוע מדדים ביוכימיים של רעילות התאים. רזזורין הוא ריאגנט כימי לא רעיל העובר חילוף חומרים על ידי תאים פעילים, ומייצר תוצר מופחת (רסורופין) עם פלואורסצנטיות מדידה¹². העדשה נטולת אברונים ברובה, למעט המיטוכונדריה הפעילה מטבולית המרוכזת בתוך האפיתל הקדמי ותאי סיבים קליפת המוח השטחיים, הממלאים את דרישות האנרגיה של העדשה^13,14. נזק לעדשה ברמה התאית עלול לשבש את חילוף החומרים ולעתים קרובות מקדים את הופעתם של שינויים מבניים פתוגניים וקטרקט¹⁵.

מטרת שיטה זו היא להעריך את ההשפעה של חשיפות קסנוביוטיות וסביבתיות על העדשה, מה שעשוי לתרום להתפתחות קטרקט. הפרוטוקול כולל שתי בדיקות להערכת השפעת הטיפול באמצעות עדשת בקר מתורבתת. היתרון בגישה זו הוא שהיא מספקת הערכה תאית ותפקודית של האופן שבו העדשה כרקמה ראשונית מגיבה לטיפול. זוהי הערכה רגישה ואובייקטיבית של העדשה בהשוואה לשיטות נפוצות אחרות 16,17,18.

המודל שימש בהצלחה להערכת ההשפעות של חשיפות שונות, כולל פעילי שטח, מוצרי צריכה, אלכוהול וקרינה אולטרה סגולה 17,19,20. שינויים באיכות האופטית קיימים באופן עקבי בעדשות מתורבתות כתגובה לחשיפה רעילה²¹. היכולת של שיטה זו לשמור על תרבית עדשות לטווח ארוך מתאימה היטב לניטור ההשפעה הפוטנציאלית המושהית של תרכובת, והתאוששות העדשה מנזק שנגרם או קטרקט^22,23. ניתן להשתמש בתוצאות המופקות מיישום פרוטוקול זה כדי להפחית את התלות בניסויים בבעלי חיים בפיתוח מוצרי עיניים.

כל פרוטוקולי הניסוי בוצעו בהתאם למדיניות האתיקה של אוניברסיטת ווטרלו למחקר באמצעות רקמות בעלי חיים. עיני הבקר במחקר הנוכחי סופקו על ידי בית מטבחיים, התקבלו מפרות שאינן חולבות תוך מספר שעות מרגע המוות, ונותחו מיד, תהליך שלוקח עד 8 שעות מרגע קבלת העיניים. יש לנתח את העיניים מיד כדי לשמור על סטריליות ואיכות החיתוך. מדיום התרבית מוכן ל-pH של 7.4 ומסונן סטרילי לפני נטילת תוסף FBS²¹. כל ההליכים מתבצעים בתנאים סטריליים, כאשר מקורות החומר והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבות עדשות בקר

1. נתח עדשות על ידי הסרת שרירים ורקמות חוץ עיניות מהסקלרה, הסרת החצי האחורי של הגלובוס והזגוגית, הסרת הקשתית והגוף הריסי יחד עם העדשה, ולאחר מכן חיתוך החיבורים האזוריים, כאשר החיתוך הסופי ממוקם כך שהעדשה תיפול לתוך תא התרבית המלא במדיום.
2. תרבית את העדשות המנותחות בתאים מותאמים אישית עם בסיס המותאם למערכת סריקת הלייזר, עם 21 מ"ל של מדיום מסונן סטרילי, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. יש להשתמש בתרבית בתוספת 3% סרום בקר עוברי (FBS) עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 9.4 גרם/ליטר M-199, 0.1 גרם/ליטר L-גלוטמין, 5.96 גרם/ליטר HEPES, 2.2 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט ו-7 מ"ל/ליטר NaOH. אחסן מדיום תרבות שאינו בשימוש במקרר עד 7 ימים.
3. החלף את מדיום התרבות כל 1-2 יום. יש לחמם את מדיום התרבית למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. השתמש בפיפטה סטרילית של פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את המדיום מתא תרבית בודד ולחדש מיד במדיום הנוסף.
4. תרבית את העדשות במשך 48 שעות לאחר הדיסקציה כדי לאפשר זמן לנזק פיזי להתבטא. בדוק וסרוק את העדשות לאיכות אופטית לפי סעיף 4 לפני הכללתן בניסוי.
   הערה: העדשות מכוונות עם הפנים כלפי מטה כהכנה לבדיקת סורק הלייזר.

2. נוהל בקרה

1. הכן תמיסה עם הריכוז הרצוי של חומר מסיס התואם לתרכובת הכימית ולמדיום התרבית.
2. הכן פתרון בקרת רכב על ידי הוספת החומר המסיס למדיום משלים. מחממים את תמיסת הבקרה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.
3. השתמש בפיפטה פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את מדיום התרבית מתאי עדשות הבקרה. מלאו את התאים בתמיסת הבקרה. במידת הצורך, בצע שלב זה עם דגימות בשלוש עותקים.
   הערה: נדרש נפח מינימלי של 7 מ"ל כדי לכסות לחלוטין את העדשה במצב הקדמי עם הפנים כלפי מעלה. התנאים לבקרות במחקר הנוכחי היו 21 מ"ל של מדיום בקרה לא מטופל, 21 מ"ל של מדיום בקרה לרכב ו-7 מ"ל של מי מלח עם פוספט (PBS).
4. תרבית את העדשות במדיום בקרה למשך יומיים, ולאחר מכן החלף באמצעי בקרה חדש לפי סעיף 1. לחשיפות לטווח קצר, יש לשאוב את תמיסת הבקרה מהתאים ולבצע שטיפה לפחות שלוש פעמים עם תרבית ללא תוספת לפני חידוש פרוטוקול תרבית העדשות כמתואר בסעיף 1.0.
5. אפשר לעדשות להתאקלם בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 3.5 שעות לפחות לפני הערכת האיכות האופטית.

3. הליך חשיפה

1. הכן תמיסה עם הריכוז הרצוי של חומר מסיס התואם לתרכובת הכימית ולמדיום התרבית. שלב את הכימיקל עם החומר המסיס, מה שמאפשר את הזמן המתאים לאינטראקציה במידת הצורך.
   הערה: 2-הידרוקסיפרופיל-β-ציקלודקסטרין שימש במחקר הנוכחי כדי לשפר את המסיסות של לנוסטרול (0.033 גרם/ליטר) במדיום. תמיסת בנזלקוניום כלוריד (BAK 0.0075%) הוכנה באמצעות PBS.
2. שלבו את הכימיקל המסיס במדיום התרבית. הכן נפח כולל המספיק כדי לספק 21 מ"ל של מדיום לכל דגימות העדשות. מחממים את מדיום הניסוי למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.
3. השתמש בפיפטה של פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את מדיום התרבית מתאי העדשות. מלאו מיד את התאים בתמיסת הבדיקה. לאחר מרווח החשיפה, החלף במדיום תרבית משלים, ובצע תחילה שטיפה במידת הצורך. במידת הצורך, בצע שלב זה עם דגימות בשלוש עותקים.
   הערה: במחקר הנוכחי, תנאי הבדיקה היו 21 מ"ל של מדיום בתוספת לנוסטרול ו-7 מ"ל של תמיסת BAK 0.0075%. נדרש נפח מינימלי של 7 מ"ל לכיסוי מלא של העדשה. במקרה זה, העדשות חייבות להיות מכוונות תחילה עם הפנים כלפי מעלה. ניתן להשתמש בפיפטה של פסטר כדי ליצור זרם בתא התרבות עם חלק ממדיום התרבות שמסביב כדי למקם מחדש את העדשה.
4. החזר את העדשות לחממה למשך 3.5 שעות לפחות כדי להתאקלם לפני הערכת האיכות האופטית.
   הערה: העדשות מכוונות עם הפנים כלפי מטה כהכנה לבדיקת סורק הלייזר.

4. בדיקת איכות אופטית (סורק לייזר עדשה)

1. ודא שהעדשות מכוונות עם הפנים הקדמיות כלפי מטה וברמה החזותית בתא התרבית, תוך שימוש בטכניקה משלב 3.3 כדי להתאים את מיקום העדשה במידת הצורך.
   הערה: מיקום זה מבטיח שקרן האירוע תשתקף למעלה דרך תחתית החדר ותעבור דרך העדשה מהמשטח הקדמי לאחורי.
2. מקם תא תרבית עדשה לתוך סורק הלייזר כך שסיכת עגלת התא תתאים לחריץ בבסיס החדר.
3. בחר את העדשה ונקודת הסריקה שעבורם יש לבצע סריקה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על עדשת הסריקה והמתן עד שהסורק יבקש למצוא וליישר את האלומה. בחר התחלה ונקודות קצה מרוחקות היטב עבור הקרן שמאחורי העדשה. ודא שהקרן המרכזית מיושרת באמצעות לחצני הכוונון הגסים והעדינים בתוכנת הסורק וכפתור הכוונון בסורק. כאשר הקרן מיושרת, לחץ על כיול והזן מבחר מתאים של צעדים רדיאליים והפרדת אלומה.
   הערה: עבור מחקר זה באמצעות עדשת בקר, ההגדרות לצעדים רדיאליים והפרדת אלומה נקבעו ל-10 צעדים ו-0.5 מ"מ, בהתאמה. הסריקה הראשונה שהסורק מבצע משמשת לכיול סורק הלייזר. זה נדרש פעם אחת, וכל סריקות העדשות הנוספות עשויות להתבצע ישירות לאחר היישור.
4. לאחר כיול הסורק, לחץ על סריקה. המתן ליצירת ערכים עבור ממוצע BVD, סטיית תקן ושגיאה לאורך ציר אחד לאחר השלמת סריקת העדשה, והיקף הקרן נקבע. הגדר את ההיקף מהמקום שבו הקרניים יוצאות מהעדשה לנקודת הקצה הרצויה, ובחר את המרחק המרבי מאחורי העדשה תוך אי הכללת כל הפרעה נראית לעין.
5. השתמש בתרשים שנוצר כדי להציג את מרחקי הקודקוד האחורי הבודדים עבור כל קרן.
   הערה: אל תכלול קרניים העוברות דרך תפרי העדשה. כדי לא לכלול אלומה, השתמש במקרא שעל המסך כדי ללחוץ לחיצה ימנית על קרן בודדת ולבחור אל תכלול.
6. סובב ידנית את מיקום בסיס תא התרבות בתוך הסורק ב-90°, כך שהסריקה השנייה לאורך משטח העדשה הקדמית תהיה בניצב לסריקה הקודמת. ודא שהקרן המרכזית מיושרת כמפורט בשלב 4.3, ולאחר מכן סרוק את העדשה.

5. בדיקת פעילות מטבולית (רזזורין)

1. הכן בינוני ללא FBS. מחממים את המדיום למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הכן 50 מ"ל של מגיב רזזורין 8% במדיום ללא תוספת.
   הערה: מספיק להכין 50 מ"ל כדי למלא את כל הבארות בצלחת של 12 בארות. יש להכין את התמיסה סטרילית בתנאים עמומים במיכל אטום, מכיוון שרזזורין רגיש לאור.
2. הוסף 3.8 מ"ל של תמיסת רזזורין 8% לכל באר בתוך צלחת שקופה וסטרילית של 12 בארות כדי לכסות את העדשה.
3. השתמש בכפות מתכת סטריליות כדי להרים בזהירות עדשות מתחת למשטח האחורי ובצע שטיפה באמצעות פיפטה של פסטר כדי לשטוף את העדשה עם נפח קטן של מדיום תרבית ללא תוספת. הנח את העדשות בנפרד בכל באר.
4. דגרו את צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 5 שעות. לאחר הדגירה, הסר את העדשות בעזרת כפות מתכת מהבארות והניח אותן במיכל לסילוק פסולת בעלי חיים. העבירו דגימה של 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת סטרילית, שקופה, עם 96 בארות.
   הערה: ניתן להעריך עדשות מספר פעמים באמצעות בדיקת הפעילות המטבולית. במקרה זה, החזירו את העדשות לתאי התרבות עם מדיום טרי לדגירה. בדיקת הפעילות המטבולית מבוצעת בצורה הטובה ביותר לאחר השלמת כל הסריקות, מכיוון שהצבע עשוי להשפיע על מדידות ה-BVD.
5. מדוד את הקרינה של נקודת הקצה של דגימות 100 מיקרוליטר באמצעות קורא לוחות פלורסנט, כאשר אורכי גל העירור והפליטה מוגדרים ל-560 ננומטר ו-590 ננומטר, בהתאמה.

6. ניתוח נתונים

1. עבור בדיקת האיכות האופטית, חשב את ממוצע הערכים המחושבים על ידי התוכנה עבור שגיאת BVD²⁴ משתי הסריקות שבוצעו בכל נקודת זמן. בצע חישוב זה עבור כל העדשות וכל נקודות הסריקה.
2. לבדיקת הפעילות המטבולית, אסוף את ערכי הקרינה היחסית של נקודת הקצה שנוצרו על ידי קורא הצלחות. נרמל את הנתונים על-ידי הגדרת הממוצע של כל ערכי הבקרה בנקודת סריקה ל- 100%. חשב את הפעילות של כל עדשה כאחוז מערך הבקרה הממוצע עבור אותה נקודת סריקה.
3. בצע בדיקת נורמליות עבור כל קבוצות הניסוי. בהנחה שהנתונים תקינים, נתח את הבדלי השגיאות של BVD בין עדשות בקרה לניסוי באמצעות ANOVA הדו-כיווני. בנוסף, בצע את מבחן ההשוואות המרובות הפוסט-הוק של Tukey. בצע ANOVA חד כיווני ובדיקת פוסט-הוק של Dunnett לנתוני הפעילות המטבולית.

איור 2 ואיור 3 (n = 6) מדגימים את תוצאות המחקר שבדק את השפעת הטיפול הכימי (לנוסטרול) על עדשת הבקר. לנוסטרול הוא סטרול טבעי בעדשה שבעבר הראה תוצאות מבטיחות כהתערבות תרופתית פוטנציאלית לקטרקט²⁵, אם כי זה עדיין לא הוכח²⁶. תכנון המחקר כלל מדיום ובקרת רכב למתחם. לא היה הבדל משמעותי בין הרכב (2-הידרוקסיפרופיל-β-ציקלודקסטרין) לבין השליטה הבינונית (עמ' > 0.05), מה שמצביע על כך שהשפעה פוטנציאלית כלשהי בקבוצת הניסוי לא צפויה לנבוע מהרכב. לא היה הבדל משמעותי בשונות ה-BVD בין קבוצת הטיפול לקבוצת הביקורת (p > 0.05). תוצאות אלה היו עקביות עם בדיקת הפעילות המטבולית (איור 3). לכן, הטיפול לא הכניס רעילות משמעותית לתאים או השפיע באופן משמעותי על ביצועי השבירה של העדשה (p > 0.05).

איור 4 ואיור 5 (n = 3) מציגים את תוצאות הטיפול ב-BAK על העדשה. BAK הוא חומר פעילי שטח והחומר המשמר הנפוץ ביותר בתכשירים עיניים²⁷. חשיפה של 10 דקות הביאה לשונות BVD גדולה יותר באופן משמעותי בעדשות המטופלות בהשוואה לביקורת 4 ימים לאחר החשיפה (p < 0.05). הטיפול גם הביא להבדל משמעותי בפעילות המטבולית של העדשות (p < 0.05).

איור 1: קביעת מרחק הקודקוד האחורי כמדד לאיכות אופטית באמצעות סורק לייזר. (A) סדרה של אלומות מועברת דרך העדשה בזמן שהיא יושבת בתא התרבית שלה לאורך ציר אחד. (ב) הקרניים עוברות דרך העדשה במרווחי זמן מוגדרים. מרחק הקודקוד האחורי נקבע עבור כל קרן, וערכי שגיאה של ממוצע BVD (במ"מ) ו-BVD נוצרים כמדדים כמותיים של תפקוד שבירה של העדשה. מידע זה מוצג בצורה גרפית, כאשר BVD מוצג על ציר ה-x ומיקום האלומה על ציר ה-y. ככל שהאלומות ממוקדות בצורה חדה יותר לנקודה עקבית מאחורי העדשה (C), כך ערך השגיאה המחושב של BVD קטן יותר בהשוואה לעדשות באיכות אופטית ירודה יותר (D). קיצור: BVD = מרחק קודקוד אחורי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעת תרחיף לנוסטרול על האיכות האופטית של עדשות בקר. שונות מרחק הקודקוד האחורי משקפת את יכולתה של העדשה לשבור אור לנקודה אחת. האיכות האופטית של עדשות שטופלו בלנוסטרול הייתה דומה לזו של עדשות בינוניות ועדשות בקרת רכב לא מטופלות (p > 0.05) (n = 6). הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן. קיצור: BVD = מרחק קודקוד אחורי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השפעת תרחיף לנוסטרול על הפעילות המטבולית של עדשת הבקר. פעילות מטבולית ממוצעת של עדשות בקר, מכומתת על ידי הקרינה היחסית של אינדיקטור מטבולי לאחר חשיפה לטיפול לנוסטרול תלוי ברכב (n = 6). הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השפעת בנזלקוניום כלוריד על האיכות האופטית של עדשות בקר. חשיפה ל-BAK 0.0075% למשך 10 דקות גרמה לעלייה הדרגתית בשונות מרחק הקודקוד האחורי בתוך עדשות הטיפול (n = 3). ההבדלים היו מובהקים בין עדשות הביקורת המטופלות לעדשות הביקורת הבינוניות 4 ימים לאחר החשיפה, כמו גם עבור העדשות המטופלות בין נקודות הסריקה שלהן לפני החשיפה ואחרי החשיפה (p < 0.05). הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן. קיצורים: BVD = מרחק קודקוד אחורי; BAK = בנזלקוניום כלוריד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השפעת בנזלקוניום כלוריד על הפעילות המטבולית של עדשת הבקר. נקודת הקצה של הפעילות המטבולית נמדדה 4 ימים לאחר חשיפה של 10 דקות ל-BAK 0.0075% (n = 3). השינויים בפעילות המטבולית היו שונים באופן משמעותי מקבוצת הביקורת (p > 0.05). הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן. קיצור: BAK = בנזלקוניום כלוריד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ישירות את ההשפעות של כימיקלים או חשיפות סביבתיות על העדשה בתרבית רקמה ראשונית. ראשית, העדשות מנותחות ונסרקות לאיכות אופטית. מניעת זיהום והבטחת איכות הנתיחה הם קריטיים. העדשות נסרקות במרווחי זמן תקופתיים כדי לנטר באופן רציף שינויים בתפקוד השבירה ביחס לקבוצת הביקורת או למצב לפני החשיפה. בדיקת הפעילות המטבולית מייצגת נקודת קצה כדי לקבוע אם החשיפות השפיעו על חילוף החומרים התאי. אלו הם השלבים הקריטיים כדי לקבוע אם חומר קסנוביוטי או מצב סביבתי גורמים לרעילות משמעותית, שעלולה להוביל לקטרקט והאם העדשה עשויה להתאושש מטיפול זה.

העדשות נסרקות לאיכות אופטית בתוך תאי התרבות שלהן. למרות שעדשות יכולות להיחשף גם לחומר בדיקה בתוך התאים שלהן, אחת המגבלות של פרוטוקול זה היא שעדשות רגישות לשינויים באוסמולריות ויש להזין אותן באופן רציף בסרום ולשמור עליהן במדיום מתאים. זה מהווה אתגר לטיפולים עם מרווחי חשיפה ארוכים או מסיסות ירודה בתוך מדיום תרבית²⁸. מכיוון שהבדיקה משתמשת בהדמיית וידאו, מתלים עם כמויות גדולות של חלקיקים בלתי מסיסים עלולים להכניס פיזור, שאינו אינדיקציה לביצועי העדשה. התנאים שהפיקו את הנתונים המייצגים באמצעות תרחיף לנוסטרול מצביעים על כך שהפרוטוקול יכול לסבול תרחיפי ריכוז מסוימים ברמה נמוכה. בעוד שהוצע בעבר כי עדשת הבקר המתורבתת יכולה להיות בקורלציה עם תגובות בעדשה האנושית²¹, הבדלים עיקריים, כולל אך לא רק סינון UV, דחיסה הקשורה לגיל ותכולת פוספוליפידים, מגבילים את מגוון החומרים שעבורם פרוטוקול זה משמש כראוי בבדיקות פרה-קליניות ^29,30.

בדיקת רעילות עיניים כרוכה בהכרח בסוללה גדולה של בדיקות לקביעת תמונה רחבה של הבטיחות והסבילות של תרכובת, החל מניסויים במבחנה ובבעלי חיים לפני שממשיכים לניסויים קליניים. לבדיקת עדשת בקר יש תפוקה גבוהה למספר הפעמים שניתן לסרוק עדשה מכיוון שהשיטה אינה הרסנית וניתן לבצע אותה בקלות תוך מספר דקות. עם זאת, בדיקת מספר רב של עדשות יכולה להיות בעלת תפוקה נמוכה, מכיוון שניתוח עדשה מהעין יכול לגזול זמן. השימוש בסורק הלייזר שימש באופן נרחב יותר לחקר עדשות שרקנים, דגים, חזירים, חולדות וגוזלים 31,32,33,34,35. באופן אידיאלי, תוצאות הבדיקות הפרה-קליניות מספקות תובנה לגבי הבטיחות והסיכון הפוטנציאלי בבני אדם. בעוד שעדשות אנושיות יהיו שימושיות ביותר מבחינה זו, מכיוון שעדשות אנושיות וחיות יהיו שונות באופן בלתי נמנע במקרים מסוימים³⁶, עדשות המסופקות על ידי בית מטבחיים שימושיות באיזון המשאבים הזמינים והאתיקה. פרוטוקול זה מייצג שיטה רגישה, ניתנת לשחזור, לא רעילה ואובייקטיבית במבחנה לבדיקת התנאים התאיים והתפקודיים של העדשה בתגובה לטיפול.

בהשוואה לתקן הנוכחי in vivo לבדיקת רעילות עיניים, סורק הלייזר של העדשה מספק הערכה ישירה של ההשפעות של חשיפות שעלולות להיות רעילות על העדשה. בשל מקור הרקמה העוברי הנפוץ של העדשה והקרנית, כמו גם קווי דמיון תפקודיים כגון שקיפות ושבירה, התרבית הראשונית של העדשה מייצגת מודל מתאים לגירוי עיניים. מחקרי אימות ראשוניים של סורק הלייזר של העדשות הראו תוצאות דומות ביחס לבדיקת Draize ואף הוכחו כרגישים יותר מבלי לגרום אי נוחות לבעל חיים^{חי 18}. תוצאות אלה נאספות בנוסף באופן אובייקטיבי, ללא פרשנות של צופה.

מדידות בדיקת סורק הלייזר של העדשה רלוונטיות ישירות לתפקוד הטבעי של העדשה in vivo. יתרה מכך, בניגוד למבחנים המתרבבים את הקרנית או קווי התאים, עדשת הבקר שומרת על תפקוד השבירה שלה בשיטת תרבית התאים ארוכת הטווח שפותחה, וניתן לבצע את בדיקת האיכות האופטית תוך שמירה על העדשה בסביבתה. התוצאה היא שבניגוד למבחנים אחרים המייצרים נקודת קצה אחת כתוצאה מהבדיקה עצמה שפוגעת בעדשה, ניתן לבצע את בדיקת האיכות האופטית שוב ושוב תוך תרבית מוצלחת של העדשה עד 1000 שעות²⁴.

מכיוון שהעדשה נטולת אברונים ברובה, למעט האפיתל הקדמי ותאי הסיבים השטחיים בקליפת המוח, תאים אלה מבצעים פונקציות אברונים עבור כל העדשה³⁷. אם כן, קל להבין את הקשר בין שינויים תאיים לבין השראת קטרקט בעדשה, כפי שנצפה במבחנה וב-vivo ^15,19. הפעילות המטבולית של העדשה מייצגת למעשה את הפעילות של חד-שכבת האפיתל הקדמית. בעוד שקיימות בדיקות דומות לרזזורין, למשל, מלחי טטרזוליום כולל MTT, XTT, MTS ו-WST, רזזורין מספק בדיקה לא רעילה ורגישה התואמת מאוד לתרבית עדשות ראשוניות. בניגוד ל-MTT, הדורש המסה של גבישים משקעים, פרוטוקול רזזורין אינו כולל פתרונות שעשויים לגרום לליזה. בנוסף, מחקרי תרביות תאים רמזו כי נקודת הקצה של רזזורין רגישה יותר ממבחני מלח טטרזוליום³⁸.

שיטה זו נועדה למדל את תגובת העדשה כרקמת עין ומכשיר אופטי לחשיפות כימיות וסביבתיות שונות. שתי התרכובות המייצגות שנבחרו למחקר זה הן בנזלקוניום כלוריד, חומר משמר בתמיסות עיניים, ולנוסטרול, סטרול שנחקר בעבר כחלק מהמאמץ למצוא התערבויות פרמצבטיות לקטרקט. התוצאות מדגימות לחץ בעדשה בתגובה לחומר המשמר וללא תגובה משמעותית ללנוסטרול. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את הרעילות של טיפולים תרופתיים פוטנציאליים לקטרקט.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודה למועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (NSERC) ולקרן הנאמנות הקנדית לחינוך אופטומטרי (COETF) על המימון לפרויקט זה.