Peritonite padronizada do stent Colon Ascendens em ratos - um modelo animal simples e viável para induzir lesão renal aguda séptica

A lesão renal aguda (LRA) é uma complicação grave em pacientes críticos e está relacionada a um aumento da mortalidade. Aqui, apresentamos um modelo in vivo confiável e reprodutível para mimetizar LRA em condições inflamatórias que podem contribuir para a compreensão da patogênese da LRA séptica.

A LRA em pacientes sépticos está associada ao aumento da mortalidade e desfecho desfavorável, apesar dos grandes esforços para refinar a compreensão de sua fisiopatologia. Aqui, é apresentado um modelo in vivo que combina um foco séptico padronizado para induzir LRA e uma configuração de terapia intensiva (UTI) para fornecer um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia comparável na sepse humana. A sepse é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). A LRA é investigada funcionalmente pela medição de amostras de sangue e urina, bem como histologicamente pela avaliação de escores histopatológicos. Além disso, a monitorização hemodinâmica avançada e a possibilidade de amostragem repetitiva de gasometria permitem uma análise diferenciada da gravidade da sepse induzida.

O método sCASP é um método padronizado, confiável e reprodutível para induzir LRA séptica. A configuração de terapia intensiva, o monitoramento hemodinâmico e de troca gasosa contínuo, a baixa taxa de mortalidade, bem como a oportunidade de análises detalhadas da função renal e comprometimentos são vantagens dessa configuração. Portanto, o método descrito pode servir como um novo padrão para investigações experimentais de LRA séptica.

A sepse ainda continua sendo a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (UTI) não cardíacas, com taxas de mortalidade de ≈ 30 a 50%^1,2,3. Uma característica marcante da sepse grave e do choque séptico é a lesão renal aguda que causa um aumento adicional da taxa de mortalidade quando associada a disfunção de órgãos distantes, como insuficiência cardíaca e respiratória ^4,5,6. A incidência geral de LRA em pacientes de UTI varia de 20 a 50%⁷. Apesar do papel fundamental da LRA em relação ao desfecho e mortalidade na sepse, o mecanismo patológico subjacente ainda é pouco compreendido.

No geral, existem os 3 componentes principais: inflamação, lesão tóxica e alterações hemodinâmicas que contribuem para o desenvolvimento da LRA⁷. As alterações hemodinâmicas englobam redução do fluxo sanguíneo renal (RBF) e isquemia renal global ou regional. Aqui, deve-se considerar que a sepse também pode causar comprometimento da microcirculação renal devido à hipotensão sistêmica e/ou ruptura da barreira endotelial⁸. Portanto, o estudo da LRA séptica deve sempre incluir a monitorização hemodinâmica. Estudos in vivo recentes sobre LRA usaram principalmente modelos animais, como lesão renal de isquemia-reperfusão ou nefrectomia bilateral. Esses estudos geralmente mostraram falta de monitorização hemodinâmica e cuidados intensivos.

A investigação de potenciais novos mecanismos patológicos e terapias da LRA séptica requer um modelo in vivo com um foco séptico definido, uma configuração de terapia intensiva, um resultado previsível e uma lesão de órgão 9,10,11,12. Aqui, descrevemos um modelo inovador de roedor para LRA séptica que atende aos requisitos mencionados anteriormente. A LRA séptica é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). O modelo sCASP utilizado causa sepse abdominal por vazamento fecal intestinal, levando à invasão bacteriana e falência de múltiplos órgãos¹³. Foi demonstrado que as alterações fisiopatológicas após a CASP são semelhantes às da sepse humana e, portanto, a CASP representa um modelo clinicamente relevante na pesquisa da sepse^11,14.

Além disso, uma configuração de terapia intensiva (UTI) que compreende um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia de UTI é estabelecida no protocolo experimental. A configuração da UTI permite ressuscitação fluídica, aplicação de analgesia por via intravenosa e análise repetitiva de gases sanguíneos. A função renal é avaliada pela medição de valores padrão, como creatinina, e pela depuração do ácido aminohipúrico (PAH) e da inulina. Informações adicionais são fornecidas por escores patohistológicos de tecidos e órgãos colhidos no final do experimento. O modelo sCASP para induzir LRA séptica já foi avaliado e revelou novos insights na patologia renal¹⁵. A aplicação adicional deste protocolo apresentado abaixo pode ajudar a refinar a compreensão da LRA séptica.

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Distrito de Unterfranken, Alemanha, e realizados de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Preparo cirúrgico e instalação de monitorização invasiva e medicação contínua

1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley usando isoflurano administrado por vaporizador de precisão em uma concentração e vazão aprovadas pelo órgão de supervisão de pesquisa animal da instituição local e/ou equipe veterinária. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando a frequência respiratória, que se torna mais lenta e profunda, e verifique a falta de resposta após o beliscão da cauda/dedo do pé. Raspe a garganta e o estômago com uma navalha.
   Nota: A redução maciça da frequência respiratória pode ser um indicador de uma overdose de anestesia e levar a bradipneia, hipotensão e, finalmente, morte.
2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar que os olhos sequem. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento automatizada.
   Nota: A hipotermia e a lesão térmica influenciam os parâmetros macro e micro-hemodinâmicos e devem ser evitadas para obter um resultado confiável. Recomenda-se o uso de uma almofada de aquecimento com mecanismo de controle que é ligado ao rato por meio de uma sonda retal flexível para manter a temperatura corporal na faixa fisiológica.
3. Após a desinfecção do pescoço e da garganta com a solução desinfetante apropriada, incisar a pele da garganta medial com um bisturi e fazer uma incisão de cerca de 2 cm. Vire o rato e faça uma incisão de cerca de 1 cm com tesoura cirúrgica no pescoço cerca de 1 cm distal do occipital.
4. Coloque o rato de volta em decúbito dorsal. Disseque suavemente a veia jugular direita e a artéria carótida esquerda com a tesoura e os cotonetes. Disseque os vasos das estruturas vizinhas. Evite muito arrasto e prepare-se ainda mais com movimentos cuidadosos de espalhamento.
   Nota: Mantenha os vasos sempre úmidos pela aplicação de solução salina estéril pré-aquecida.
5. Disseque suavemente e com movimentos de propagação subcutânea dos vasos até o pescoço para obter uma conexão entre as duas incisões. Insira grampos em cada túnel formado.
6. Lave o giro e os cateteres, provenientes do dispositivo giratório com NaCl 0,9%. Insira os cateteres em uma mola de aço inoxidável.
   Nota: Os cateteres devem ser lavados com cloreto de sódio antes de serem inseridos, pois a aplicação mínima de ar pode levar à morte súbita devido à embolia gasosa.
7. Vire o rato e prenda os cateteres usando as pinças inseridas. Deslize os cateteres do pescoço para a garganta. Fixe a mola com uma corda de botão de plástico cerca de 1 cm distal do occipital com 6 suturas singulares (por exemplo, 4/0) no pescoço.
8. Coloque o rato novamente em decúbito dorsal. Coloque fios de algodão de cerca de 4 cm distais e proximais a cada recipiente preparado. Corte a artéria proximal com um microclipe, geralmente usado para clipagem de aneurismas subaracnoides. Como alternativa, deixe o clipe e interrompa o fluxo sanguíneo arterial apertando um dos fios.
9. Incisar a artéria com uma microtesoura cirúrgica, manter a incisão aberta com um gancho em uma mão e inserir o cateter arterial no vaso usando uma pinça com a outra mão. Abra o clipe ou o fio puxado, empurre o cateter cerca de 1 cm para a frente no vaso em direção ao coração e fixe-o com nós cirúrgicos usando os fios de algodão colocados.
10. Repita o passo 1.8 na veia jugular e deixe o clipe, pois a veia não é tão sólida quanto a artéria.
11. Depois de fixar os dois cateteres em linha reta nos vasos, feche a ferida na garganta com suturas.

2. Procedimento sCASP

1. Mantenha o rato em decúbito dorsal, raspe o abdômen e desinfete a região abdominal com as soluções de desinfecção apropriadas.
   Nota: Utilize sempre a técnica asséptica.
2. Realizar uma incisão abdominal na linha média da pele de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e depois novamente ao longo da linha alba para abrir a caverna peritoneal.
3. Identifique o pólo cecal e puxe o ceco suavemente usando cotonetes.
4. Perfure o cólon ascendente cerca de 2 cm distal da válvula ileocecal com uma sutura (6/0) [sutura 1] no lado antimesentérico e fixe-o com dois nós cirúrgicos. Evite lesões de quaisquer vasos do cólon.
5. Corte a extremidade distal - cerca de 1,5 cm - de um cateter de sucção de 10 FR. Corte este pedaço do cateter com a tesoura para formar uma aba retangular com um comprimento de cerca de 0,5 cm. Prepare o retalho com uma sutura (6/0) [sutura 2] no meio do retalho.
6. Colocar o retalho sobre uma agulha 14G e puncionar o cólon ascendente com a agulha onde foi fixada a sutura¹⁵.
7. Insira o tubo de plástico preparado no cólon sobre a agulha. Remova simultaneamente a agulha com cuidado. Posicione o tubo de forma que o retalho fique fora do cólon e o resto do tubo dentro do cólon.
   1. Após o posicionamento exato do tubo plástico, fixe o retalho com a sutura 2 já existente, costurando a parede do cólon e os nós cirúrgicos. Evite novamente qualquer lesão dos vasos do cólon. Coloque as extremidades livres da sutura 1 ao redor do resto do tubo de plástico que sai do cólon e faça 2 nós cirúrgicos.
8. Ordenhe as fezes do ceco em direção ao stent colônico usando cotonetes até que as fezes apareçam na saída do stent.
9. Coloque o intestino delgado e o cólon de volta na caverna abdominal. Assim, o tubo de plástico com as fezes deve estar em contato com o peritônio. Lave o stent com 2 mL de NaCl a 0,9% para distribuir as fezes na caverna peritoneal.
10. Feche a caverna abdominal com uma sutura contínua (4/0) do peritônio e depois com uma sutura contínua (4/0) da pele.

3. Procedimento pós-operatório

1. Pare a inalação de isoflurano e coloque o rato de volta em sua gaiola.
2. Inicie a analgesia intravenosa através da linha venosa usando fentanil (2,0 μg / 100 g de peso corporal / h).

4. Preparando as medições no segundo dia

1. 24 h após o procedimento sCASP, aplicar 0,5-1,0 mg de midazolam por via intravenosa. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local.
2. Depois de desinfetar novamente com álcool e solução, realizar uma traqueostomia com o tubo de plástico de uma cânula venosa de 14 G para fornecer oxigenação e ventilação suficientes.
   1. Portanto, abra a sutura na garganta com uma tesoura cirúrgica e abra suavemente da linha média até a traqueia. Incise a traqueia verticalmente entre duas cartilagens de cerca de 2 mm de comprimento com uma tesoura cirúrgica - apenas o suficiente para inserir uma tesoura cirúrgica. Alargue a incisão sem rodeios até cerca de metade do diâmetro da traqueia com a tesoura. Insira 1 cm de um tubo de plástico de 14 G e fixe-o com 2 suturas. ¹⁶
      Nota: Se a incisão da traqueia for maior que a metade da circunferência, os vasos que acompanham a traqueia podem ser prejudicados, resultando em hemorragia grave, aspiração de sangue ou bradicardia letal.
   2. Iniciar ventilação mecânica com ventilador de roedores com F_iO₂ de 0,28 e 0,7 Vol. % isoflurano e iniciar anestesia venosa com midazolam (0,7 mg/100 g PV/h) e fentanil (7 μg/100 g PV/h). Realize análises de gases sanguíneos para garantir ventilação e oxigenação suficientes. Portanto, retire cerca de 0,7 mL de sangue através do cateter arterial e meça-o com um analisador de gases sanguíneos.
      Nota: A anestesia intravenosa deve ser iniciada apenas se a ventilação controlada mecanicamente for estabelecida.
3. Depois de ter sido barbeado e desinfetado de maneira semelhante à do item 2.1, fazer uma incisão longitudinal de 1 cm na pele da perna direita, 0,5 cm proximal do joelho. Disseque a artéria das estruturas vizinhas usando tesouras cirúrgicas e cotonetes sem rodeios.
   Nota: Se a artéria femoral for rompida, ainda é possível a inserção do cateter em posição proximal. Assim, recomenda-se iniciar o implante o mais distal possível.
4. Insira um cateter de termodiluição na artéria femoral abrindo a artéria com um gancho e inserindo o cateter com uma pinça.
5. Comece a medir o débito cardíaco pelo método de termodiluição. Portanto, infundir 1 mL de NaCl resfriado rapidamente manualmente através do cateter venoso após ter iniciado a medição de um software de medição do índice cardíaco. Efetue esta medição duas vezes.

5. Avaliação da função renal

1. Realize uma laparotomia abrindo as suturas da pele e do peritônio com uma tesoura. Incise a bexiga urinária com uma tesoura cirúrgica apenas o suficiente para cateterizá-la com um pequeno cateter de plástico. Depois de colocar um fio de algodão de cerca de 7 cm ao redor da bexiga, prenda o fio, fixe o cateter com nós e, finalmente, colete o máximo de urina possível através do cateter.
2. Dissolva a fluoresceína-isotiocianato-inulina (FITC-inulina) em NaCl a 0,9% e o sal de sódio (PAH) do ácido p-aminohipúrico em NaCl a 0,9% para obter concentrações de 2 mg/mL de inulina, 5 mg/mL de PAH.
3. Aplicar um bolus de uma mistura de ambas as substâncias de 75 μL i.v., seguido de infusão intravenosa constante de ambas as substâncias com uma taxa de 3,7 μL / h / 300 g BW.
4. Depois de ter atingido um estado estacionário¹⁷ com a infusão de FITC-Inulina e PAH coletar a urina por 20 min. Colher amostras de sangue através do cateter arterial, conforme descrito no ponto 4.2.1, para a realização de uma gasometria.
5. Determinar as concentrações de inulina na urina e no plasma por espectrometria de fluorescência e medir o PAH por fotoespectrometria utilizando o método da antrona¹⁷.

6. Fim das experiências

1. Eutanásia do animal de acordo com os regulamentos legais locais.
2. Retire o máximo de sangue possível através do cateter arterial usando seringas.
3. Colha o intestino delgado e grosso cortando a fixação peritoneal do duodeno e do cólon, retire algumas partes deles usando uma tesoura cirúrgica. Prepare e colha os rins preparando retroperitoneal e libere-os de sua cápsula gordurosa e corte o ureter e os vasos anexos. Faça uma toracotomia e corte os pulmões e o coração. Fixe todos os órgãos em formaldeído e faça colorações histológicas conforme publicado anteriormente. ^15,18

Conforme publicado anteriormente por Schick et ^al.8, demonstramos os seguintes resultados.

Indução de sepse sem mortalidade
No modelo CASP, a sepse é induzida por um vazamento contínuo de bactérias localizadas intraluminais do cólon ascendendo para a cavidade abdominal, resultando em peritonite fecal e bacteremia. Assim, o tamanho do cateter implantado regula a saída de fezes e, portanto, a gravidade da peritonite e sepse. No protocolo experimental apresentado acima, uma agulha 14G combinada com a ponta do cateter de sucção 10 FR especialmente preparado foi usada para ter uma peritonite suficiente. Cateteres menores causaram apenas abscessos com inflamação local, pois a vesícula seminal ocluiu principalmente os stents menores e impediu uma produção fecal contínua.

Os animais controle e sCASP sobreviveram ao experimento, mas no grupo sCASP foi necessária ressuscitação volêmica para manter a pressão arterial média (PAM) ≥ 70 mmHg. Os animais tratados com sCASP apresentaram peritonite fecal ubíqua sem formação de abscesso e exibiram sinais clínicos de sepse grave revelados por diminuição da atividade, redução do estado de alerta, pêlo eriçado e postura curvada. Esse quadro clínico deteriorou-se continuamente ao longo do tempo.

Os ratos sCASP ressuscitados com fluidos mostraram diferenças significativas na PAM e na frequência cardíaca, mas nenhuma diferença no débito cardíaco em comparação com os animais controle (Figura 1). As análises sanguíneas após 24 horas revelaram sinais de sepse nos animais tratados com sCASP com aumento do lactato, aumento da IL-6 e leucopenia típica desses animais em comparação com o controle (Figura 1).

Determinação da LRA induzida por sepse
A depuração de inulina, descrita como padrão-ouro para avaliar a função renal, foi significativamente diminuída nos animais sCASP em comparação com o controle após 24 horas (Figura 2 A). Além disso, o débito urinário (Figura 1) e a depuração de PAH foram significativamente reduzidos nos animais sCASP (Figura 2 B). NGAL (Figura 2 C) e Cistatina C (Figura 2 D) estavam aumentadas na sepse em comparação com o grupo controle. Os parâmetros padrão para LRA, como uréia e creatinina, confirmaram o comprometimento da função renal no grupo sCASP por níveis elevados de ambos os parâmetros medidos no soro sanguíneo (Figura 2, E e F).

A lesão renal aguda no grupo sCASP não foi determinada apenas por parâmetros funcionais, mas também por um aumento do escore histopatológico da lesão (Figura 3). Essa pontuação é baseada em alterações morfológicas, incluindo formação de edema, edema celular, descolamento do epitélio tubular da membrana basal, perda da borda em escova das células tubulares proximais, morte celular e vacuolização. O grupo sCASP apresentou aumento do escore histopatológico dos rins 24 horas após a indução da sepse, sendo que o edema intersticial e a borda em escova dos túbulos prejudicada foram os principais fatores para o maior escore em comparação aos animais controle (Figura 3). Além disso, a taxa de células mortas e eventos de descolamento da membrana basal foram significativamente aumentadas em animais sCASP (Figura 3).

Figura 1: Parâmetros macrohemodinâmicos e de sepse. Os seguintes valores confirmam a presença de sepse nos animais operados por sCASP: frequência cardíaca (FC), pressão arterial média (PAM), índice cardíaco (IC), lactato, leucócitos, interleucina 6 (IL 6) e débito urinário. * p<0,05 vs. controle, § p<0,05 vs. simulação. Os dados já foram publicados no ICMex por Schick et ^al.15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Parâmetros da função renal. Os parâmetros inulina (A) e depuração de HAP (B) [mL/min], descritos como padrão-ouro para medir a função renal, diminuíram significativamente no grupo sCASP. Em contraste, NGAL (C) e cistatina C (D) [pg/mL] estavam aumentadas como um sinal adicional de LRA séptica. Os parâmetros clínicos padrão, como creatinina (E) e uréia (F) [mg/dL], também apresentaram níveis elevados em animais sépticos. * p< 0,05 vs. controle, § p<0,05 vs. simulação. Os dados já foram publicados no ICMex por Schick et ^al.15 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Escores histológicos de lesão. Mostrando as diferenças entre controle, sham e sCASP em relação ao edema intersticial, perda da borda em escova das células tubulares proximais, morte celular e escore total da lesão. As barras mostram a média ± o desvio padrão. * p< 0,05 vs. controle, § p<0,05 vs. simulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fisiopatologia da LRA séptica ainda permanece desconhecida em sua complexidade. Pesquisas clínicas e ensaios clínicos em pacientes não permitirão obter novos insights com relação a alterações histopatológicas, distúrbios da microcirculação ou interações medicamentosas em níveis celulares¹⁵. Foi postulado anteriormente que há necessidade de modelos animais novos e aprimorados para investigar a lesão renal aguda associada à sepse¹⁹. Portanto, estabelecemos um novo modelo animal para LRA séptica induzida por peritonite com stent ascendente do cólon.

O modelo CASP apresenta um modelo clinicamente relevante para mimetizar a sepse em humanos iniciada com peritonite fecal observada em pacientes cirúrgicos. A grande vantagem do CASP é que ele não começa com um golpe isquêmico como no modelo CLP amplamente utilizado, onde é realizada uma ligadura do ceco¹⁴. Além disso, Maier et al. mostram que o modelo FLP representa uma situação de abscesso intra-abdominal, em vez de uma peritonite ubíqua com bacteremia sistêmica¹⁴. Com o uso de diferentes tamanhos de stent implantado no cólon ascendente, a gravidade da sepse e a taxa de sobrevida podem ser afetadas, conforme mostrado em publicações anteriores 13,14,20. Para evitar a oclusão do stent pelo omento ou vesículas seminais, foi inserido um stent modificado com diâmetro de 10 FR¹⁵. No modelo animal descrito acima, apenas ratos machos foram usados para excluir a variação hormonal em vez de animais fêmeas, como no modelo CASP original de Zantl et al. e Traeger et ^al.13,21.

Deve-se considerar que, mesmo após a realização da configuração experimental apresentada acima de maneira padronizada, a variabilidade pode ocorrer com base em diferentes linhagens de camundongos, instalações de animais, sexo e operador. Portanto, pode ser necessário ajustar o tamanho do stent e, portanto, a gravidade da peritonite e sepse. Além disso, recomenda-se que o mesmo operador realize o sCASP e o controle no mesmo dia para reduzir a variabilidade.

Uma lesão renal aguda pode ocorrer devido à hipóxia e isquemia causada por hipotensão ou insuficiência respiratória com diminuição da_PaO2 na sepse²². Alterações nas condições hemodinâmicas e metabólicas levaram à hipóxia tecidual que influencia a integridade renal e pode afetar a morbidade e mortalidade²³. Portanto, uma avaliação contínua dos valores hemodinâmicos e respiratórios deve estar disponível em um modelo in vivo que seja usado para investigar LRA séptica. Aqui, apresentamos um modelo in vivo que se caracteriza por uma configuração de UTI comparável aos pacientes 24,25,26. Permite uma medição contínua de valores hemodinâmicos, como frequência cardíaca e pressão arterial, e avaliação do estado respiratório por meio da coleta de sangue para análise de gases sanguíneos. Além disso, esses dados obtidos pelo monitoramento contínuo são necessários e úteis para a ressuscitação fluídica e adaptação do protocolo anestésico.

A avaliação da função renal pela medição da depuração da inulina e da HAP só é possível no final do experimento, pois é necessária uma relaparotomia e uma incisão da bexiga urinária. Se for necessária uma investigação da função renal durante o experimento, amostras de sangue podem ser coletadas para medir parâmetros padrão, como creatinina e ureia. Por meio deste, deve-se considerar que uma reposição de fluidos deve ser realizada para evitar uma insuficiência pré-renal devido à hipovolemia.

O objetivo deste modelo foi estabelecer uma configuração estável de roedores de LRA séptica com relevância clínica que permita novos estudos em fisiopatologia e tratamento da insuficiência renal. Este modelo também pode ser usado para investigar diferentes estratégias terapêuticas de sepse abdominal e LRA séptica. Portanto, este modelo pode servir como uma configuração estável de roedores de LRA séptica estando próximo ao ambiente clínico de uma unidade de terapia intensiva. Além disso, o modelo descrito pode ser modificado e usado com sucesso para um amplo espectro de pesquisa de sepse in vivo , por exemplo, desregulação imunológica, ruptura endotelial, coagulopatia, distúrbio da microcirculação, farmacoterapia e ressuscitação²⁵.

Os autores não têm nada a divulgar.

M.A. Schick e N. Schlegel receberam financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 e SCHL 1962/4-1.