同種移植拒絶反応研究のための肝瘻造設術を用いたヘテロトピア補助全肝ラット移植モデル

ここで説明するラットヘテロトピア補助肝移植プロトコルは、肝同種移植片拒絶反応のメカニズムを調査するための実用的な調査ツールを提供します。このモデルは、ラットの同所性肝移植の外科的ハードルと動物的ストレスを軽減するのに役立ちます。

小動物移植モデルは、前臨床試験で実行可能な治療介入を調査する臓器耐性研究に不可欠です。ラット肝移植(LTx)プロトコルは、通常、レシピエントの天然肝臓を切除し、ドナーの肝臓に置き換える同所性モデルを使用します。この技術的に要求の厳しい外科的処置には、高度なマイクロサージェリー技術が必要であり、長い無肝および下半身の虚血時間によってさらに複雑になります。これにより、無肝や下半身の虚血時間なしでより迅速に実行できる、より複雑でないヘテロトピア法の開発が促され、レシピエント動物の術後ストレスが軽減されました。

このヘテロトピアLTxプロトコルには、ドナーラットからの肝臓の切除と、レシピエントラットへの肝臓全体の移植という2つの主要なステップが含まれます。ドナーの肝臓の切除中に、外科医は肝上大静脈 (SHVC) と肝動脈 (HA) を結紮します。レシピエント側では、外科医は左腎臓を切除し、門脈(PV)、肝下大静脈(IHVC)、および胆管を腎血管に面してドナーの肝臓を配置します。さらに、外科医は、レシピエントの腎静脈を肝臓のIHVCで端から端まで吻合し、ステントを使用してPVを腎動脈で動脈化します。肝尿道切開術は、胆管をレシピエントの尿管に吻合することにより、膀胱を介した胆汁の排出を可能にする胆道ドレナージに利用されます。

移植の平均期間は130分、寒冷虚血の持続時間は約35分、温虚血の持続時間は25分未満でした。同系移植による補助肝臓のヘマトキシリンおよびエオシン組織型は、移植後30日で正常な肝細胞構造を示し、有意な実質的変化は認められなかった。対照的に、移植後8日間の同種移植片標本は、広範なリンパ球浸潤を示し、バンフスキーマ拒絶活性指数スコアは9でした。したがって、この LTx 法は、同所性 LTx に代わる低罹患率拒絶モデルを容易にします。

小動物のLTxは、肝臓拒絶反応のメカニズムを調査するための非常に貴重なモデルです。ラットの門脈動脈化を伴う異所性補助肝移植(HALT-PVA)は、1968年にLeeとEdgington1によって導入され、レシピエントの腎静脈と動脈を使用して移植された補助肝臓を再血管化したことを報告しました。その後、Hess et ^al.2 は、天然肝臓と補助肝臓との間の機能的競争を緩和し、天然肝臓と補助肝臓との間の機能的競争を緩和し、ドナーの胆管接続を再構築するとともに、プロトコルを強化し、移植片の長期生存をもたらしました。カフ吻合^3,4の導入によりさらに改良が加えられ、Schleimerら⁵は、生理学的門脈流を取得し、移植片の過灌流または低灌流を回避するために、血流を調節するための最適なステント径を決定しました。他の研究者は、移植血液供給に脾臓⁶動脈または総腸骨⁷動脈を使用することにより、方法に大幅な変更を加えたが、一部の研究者は、補助肝移植片を供給するために静脈血⁸のみまたは肝動脈⁹を介した動脈血のみを使用するモデルを開発した。

本研究では、天然肝臓との機能的競争が同種移植片拒絶反応を妨げないという仮説を立てたため、天然肝臓または補助肝臓のサイズ縮小を含まない、流れ調節されたシュライマーモデル¹⁰ に基づくプロトコルを開発しました。レシピエントの左側は、レシピエントの腎臓血管とドナーの肝臓血管との間の最適な配向を提供するため、移植片の位置を特定するために選択されました。当初、私たちは肝十二指腸吻合術による胆道再建を試みましたが、これらの試験は、「胆道ドレナージは肝移植のアキレス腱である」というシュライマーの主張を単に確認したに過ぎません¹⁰。これにより、レシピエントの尿管を備えたステントを使用して胆管を端から端まで吻合し、膀胱を介した胆汁の排出を可能にする新しい技術の開発が促されました。肝瘻造設術を使用することの注目すべき利点は、移植片の肝臓の機能を尿を観察することで毎日監視できることです。胆汁産生肝臓移植片は、尿を明るい黄色に着色します。 図1 は、HALT-PVA方式の概略図を示しています。

同所性ラットLTxに対するヘテロトピアの重要な利点は、無肝または総下半身虚血時間がないことに関連しており、これによりヘテロトピアレシピエントの回復がより迅速かつ容易になります。さらに、同所性法を利用したLTx免疫学的研究は、実験的エンドポイントとしてレシピエントの重度の拒絶反応または死亡に依存することがよくありますが、異所性移植には当てはまりません。これは、拒絶反応により同種移植片が機能を停止しても動物が健康なままである。ヘテロトピア法のこれらの特徴は、研究動物が経験する痛み、苦しみ、苦痛を最小限に抑え、その福祉を向上させるための枠組みを推進する国際的な3Rイニシアチブ(Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹の原理を支えています。

ここで報告されているHALT-PVAモデルは、前臨床試験における肝同種移植片拒絶反応のメカニズムを調査するための実用的で信頼性の高い方法です。この有用な実験技術は、ラットの同所性LTxのかなりの外科的要求と動物ストレスを克服するのに役立ちます。将来的には、この手法を用いて急性免疫拒絶反応のメカニズムを解明するとともに、肝臓の同種移植片拒絶反応を抑制する新たな標的や治療戦略を探求していきたいと考えています。

動物は、ウィスコンシン大学(UW)-マディソン医学研究所の動物管理施設で、機関のガイドラインに従って、特定の病原体のない条件で飼育および飼育されました。研究プロトコル(第M006022号)は、UW医学部および公衆衛生学部の施設動物管理および使用委員会によって承認され、すべての動物が倫理的に扱われました。

1. 動物たち

1. ドナーラットには、体重205-235gの成体ルイス雌ラットと体重250-280gのルイス雄を使用します。レシピエントとして、体重365〜420gの成体のオスのルイスラットとブラウンノルウェーラットを使用します。
2. ルイスドナーをルイスレシピエントに移植することにより同系移植を行い、同種移植はブラウンノルウェーレシピエントに移植されたルイスドナーを利用しました。
3. すべての手術は、デュアルヘッド顕微鏡を使用して2人で行います。

2.補助肝臓ドナー調達手続き

1. 誘導チャンバーで5%イソフルラン吸入でドナーラットに麻酔をかけます。ラットの体重を記録し、電動バリカンで腹部を剃ります。
2. ラットを加熱された手術パッドの仰臥位に置き、鼻を麻酔コーンに入れ、手足をテープで固定します。腹部を75%アルコールで消毒し、イソフルランを2%に下げます。
3. はさみを使用して、恥骨から剣状突起までの縦方向の正中線の皮膚と筋肉の切開を行います。縦方向の切開の中間点近くで、それを左右に横方向に伸ばし、次に腹壁と剣状突起の両側に開創器を取り付けます。
4. 湿った綿棒を使用して、腸を腹部の左側に引っ込めながら、スプリングハサミを使用して肝臓に付着した胃靭帯を切断し、湿らせたガーゼの下で腸を固定します。温かい生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼの小片で肝臓を覆います。
5. 湿った綿棒を使用して肝臓を引っ込め、鎌状靭帯、三角形靭帯、肝胃靭帯、および肝十二指腸靭帯を解剖します。次に、双極鉗子で焼灼し、傍食道血管を左外側尾状葉と前尾状葉の間で分割します。
6. アングル鉗子またはニードルホルダーを使用して、横隔膜より下のSHVCの後ろを解剖し、次にSHVCの下に5-0シルク縫合糸を通し、後で使用するために二重結び目を緩く結びます。
7. 下右外側葉を上方に引っ込め、靭帯を切断し、湿らせたガーゼの下で固定します。IHVCを後腹膜組織から右腎静脈まで分離し、IHVCにできるだけ近い6-0シルク縫合糸で右副腎静脈を結紮します。後でグラフトを取り外すときに、この静脈を分割します。
8. 27 Gのハイドロ解剖針(図2A)を使用して、PVを周囲の結合組織から解離し、7-0シルク縫合糸を使用してそれらを結紮および分割することにより、幽門静脈と脾静脈からPVを分離します。
9. 分離し、6-0シルク縫合糸で結紮し、総肝動脈をPVの下を通過する場所の近くで分割します。
10. 胆管の周りの脂肪組織を可能な限り保存しながら、胃十二指腸動脈の分岐部で5-0シルク縫合糸で胆管を結紮します。特に、胆管を適切な肝動脈から分離することは避け、全体の長さは実用的にできるだけ短く保ちます。
11. スプリングハサミを使用して、結紮の近位にある胆管の壁に小さな切開を行います。直径0.0215インチ×長さ5mmのポリイミドチューブステントを胆管内腔に挿入し、6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一端を後で使用するために長く残します。5-0と6-0の結紮を切断して胆管を分割します。
12. IHVCとPVの上面を外科用染料ペンでマークして、吻合中に血管の位置を合わせてから、肝臓のできるだけ遠位に門脈をクランプします。
13. 26 G針付きの20 mLシリンジをマイクロクランプの近位のPVに挿入し、10〜15 mLの氷冷ヘパリン食塩水で肝臓を灌流します。同時に、スプリングハサミを使用してIHVCを右腎静脈にできるだけ近づけて分割します。
14. スプリングハサミを使用して、マイクロクランプの近位にあるPVを解剖し、以前にSHVCの周りに配置された5-0縫合糸を締め、横隔膜を解剖して胸腔内大静脈を横断することにより、肝臓を切除します。
15. 肝臓の後ろに残っている靭帯を解剖し続け、以前に結紮した副腎静脈を分割します。切除した肝臓を氷の上の冷たい生理食塩水に入れます。

3. 補助的な肝臓レシピエント移植の手技

1. 誘導チャンバーで5%イソフルラン吸入でレシピエントラットに麻酔をかけます。ラットの体重を記録し、電動バリカンで腹部を剃ります。
2. ラットを加熱された手術パッドの仰臥位に置き、鼻を麻酔コーンに入れ、手足をテープで固定します。アイローションを塗布し、腹部を75%アルコールで消毒し、イソフルランを2%に下げます。
3. はさみを使用して、縦方向の正中線の皮膚と恥骨から剣状突起までの筋肉を切開し、次に腹壁の両側に開創器を取り付けます。
4. 湿った綿棒を使用して、腸を腹部の右側に引っ込め、湿らせたガーゼで覆います。別の湿ったガーゼを胃、脾臓、肝臓に当て、左の腎臓と腎臓の血管を露出させます。
5. 27 Gのハイドロダイセクション針と鈍い先端鉗子を使用して、左腎静脈を腎動脈から分離し、両方の血管から脂肪と結合組織を慎重に除去します。.
6. 性腺静脈と副腎静脈を分離し、6-0シルクを使用してそれらを一時的に腎静脈の近位に結紮します。バイポーラ鉗子を使用して、大動脈/VCと腎臓の間の腎静脈と動脈を隔離するすべての微小側枝を焼灼します。
7. 尿管を動員し、下極で6-0シルク縫合糸で結紮します。腎静脈と動脈に外科用染料ペンで印を付け、吻合中に血管の向きを調整し、ねじれがないことを確認します。
8. 腎動脈と腎静脈を、大動脈とVCにできるだけ近い微小血管クランプでクランプします。血管の分岐部を過ぎたところでスプリングハサミで腎動脈を横断し、VCと腎臓の約半分で腎静脈を分割します。周囲の結合組織から左腎臓を動員し、それを取り除きます。
9. 27 Gのハイドロ解剖針を使用して、両方の血管をヘパリン化生理食塩水で洗い流し、残りの血液をすべて除去します。.
10. スプリングハサミを使用して、腎動脈分岐部のフォークに小さな魚の口の開口部を切って漏斗状の開口部を作り、26 Gカテーテルから切り取った8 mmのステントを挿入します(図2B)。ステントを6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一端を後で使用するために長く残します。
11. ドナーの肝臓を導入し、PV、IHVC、胆管をレシピエントの左腎静脈と動脈に向けます。9-0ナイロン縫合糸を使用して、IHVCと腎静脈接続の反対側に2つのステー縫合糸を取り付けます。
12. 血管の幅を比較し、スプリングハサミを使用して腎静脈の顔に小さな魚の口を切開し、ドナーのIHVCと同じ幅になるまでします(図2C)。
13. 9-0ナイロン縫合糸を使用して、血管の前壁と後壁の両方に9または10のランニング縫合糸を使用して、肝臓IHVCを腎静脈まで端から端まで吻合します。あるいは、カフ法を使用して、この吻合^3,4を完了します。
14. 腎動脈の配置がIHVCの下にあることを確認し(図2D)、以前に腎動脈に留置したステントを肝臓の門脈に挿入し、6-0シルク縫合糸で固定し、縫合糸の一方の端を動脈の反対側の糸に取り付けます。両端を一緒に引き寄せて、それぞれがステントから滑り落ちないようにします。
15. 最初に腎静脈のマイクロクランプを取り外し、次に腎動脈のマイクロクランプを取り外します。
16. 肝臓の再灌流中は、ガーゼと綿棒を使用して、パテント吻合が達成されるまで吻合領域の周囲に軽い圧力を加えます(図2D)。以前に副腎静脈と性腺静脈に配置されていた一時的な結紮を取り除きます。
17. 周囲の結合組織から左尿管の端を約10mm慎重に動かし、かなりの量の脂肪組織が付着したままになります。スプリングハサミを使用して、以前に配置した5-0結紮の近位にある尿管の壁に小さな切開を行います。
18. 胆管に以前に取り付けたポリイミドステントを、尿管壁に作られた小さな切開部に挿入します。6-0シルク縫合糸で固定し、一方の端をステントの胆管側の長い糸で結び、両端をしっかりと引き込みます。
19. 腸を自然な位置に戻し(図2E)、生理食塩水2〜3mLで洗浄し、3〜0シルクランニング縫合糸を使用して腹部を2層に閉じます。
20. 0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射し、レシピエントを清潔で加熱されたケージに入れ、動物を動物飼育施設に戻す前に1〜2時間回復を監視します。.

4. 術後の経過観察

1. 術後 2 日目から、同種異系移植レシピエントにヘパリン (1 IU/g) を毎日皮下注射します。
2. 術後2日目から、同系移植レシピエントにヘパリン(1IU / 2 g)を隔日で皮下注射します。

現在、29組のラットを使用してHALT-PVAプロトコルを確立し、17組の同系移植、および12組の同種移植を行っています。同系移植された肝臓は、指定された8日または30日間の実験エンドポイントまで70%の成功率で生存し、同種移植された肝臓は、指定された3日または8日間のエンドポイントまで50%の成功率で生存しました。失敗には、外科的合併症により死亡したラットや、レシピエントが生き残った場合でも失敗した補助肝臓が含まれます。

手術の平均時間は130分で、冷冷虚血時間は約35分、温冷虚血時間は約25分未満でした。術中の合併症がなかった場合、レシピエントは10〜20分以内に目を覚まし、活動的になり、1時間以内および24時間以内に飲酒と歩行を開始し、通常の健康なラットのように行動しました。

同系肝移植片は、移植後30日で優れた色と胆管の開存性を示しました(図3)、一方、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の組織型は、8日と30日の時点で有意な実質変化がなく、正常な肝細胞構造を示しました(図4A、B)。わずか3日後、同種移植の組織型は著しい門脈炎症を示し(図4C)、8日間の同種移植片は広範なリンパ球浸潤を伴う急性細胞拒絶反応を示しました(図4D)。

代表的な同種および同系のLTx検体を、委員会認定の肝病理学者によって評価し、拒絶反応をBanff Schema拒絶活性指数(RAI)¹²を用いて採点した。病理学的評価では、8日間および30日間の同系移植の両方で、バンフRAIが0で拒絶反応は存在しないと判断されましたが、8日間の同種移植片はバンフRAIスコア9で厳しく拒絶されました(表1)。

図1:ラットのHALT-PVA手順の概略図。 PVはステントを使用して左腎動脈で動脈化され、IHVCは左腎静脈に端から端まで吻合され、ステントを使用して胆管が尿管に接着されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: 外科的処置 (A)PVの水解剖。PVを周囲の結合組織から27Gのハイドロ解剖針で解離します。(B)動脈ステントの挿入。動脈ステントは、腎動脈分岐部のフォークに切られた小さな漏斗状の開口部に挿入されます。(C)腎静脈を広げる。吻合のためのドナーIHVCのより大きな幅に一致させるために、2つのステー縫合糸が所定の位置に配置された後、レシピエントの腎静脈の顔に小さな魚の口の切り込みが行われます。 (D)吻合直後の灌流肝移植。腎動脈とPV接続を腎静脈とIHVCの下に配置することは、移植片の血栓症を予防するために重要です。(E)ラットHALT-PVAの その場。 補助肝臓は、腸に戻る前に腹部の左壁に対して配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:移植後30日間の同系HALT-PVA (A)30日後、補助肝臓は天然肝臓と同様の色と質感を持つが、(B)胆管とPVステントは特許を保持し、制限を受けていない。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:補助肝移植片の組織学。 正常な肝細胞構造を示す移植後 8 日間および (B) 移植後 8 日間および (B) 30 日間の同系移植片と、門脈の炎症とリンパ球浸潤を示す (C) 3 日間および (D) 8 日間の同種移植片の H&E 染色。スケールバー:50μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: バンフ スキーマ。 同種および同系ラットLTxの拒絶活性指数(RAI)。

肝移植は、末期肝疾患の患者にとって唯一の治療選択肢であり、米国では年間約9,000回のLTxが行われています¹³。残念ながら、免疫学的拒絶反応はLTxレシピエントの最大25%に見られ、この拒絶反応は移植された臓器と患者に有害です^14,15。LTx後の転帰を改善するためには、臓器拒絶反応を研究する革新的なモデルの開発と、拒絶反応を減らすための戦略の実施が必要です。

同所性ラット肝移植と比較して、現在のヘテロトピアモデルは著しく確立が容易です。技術的な難易度は、手順で最も困難な単一のステップ、つまりIHVCの腎静脈へのエンドツーエンドの吻合を考慮することによって最もよく計算されます。この接続に対する私たちの個人的な好みは、従来の縫合を利用することですが、他の人はカフシステムの方が便利だと感じています^3,4;いずれにせよ、3mm静脈のエンドツーエンドの吻合に慣れている人なら誰でも、この手順を達成するために必要なすべての技術スキルを持っています。デュアルヘッド顕微鏡を利用できるため、これらの手術は2人で行うことを好みます。ただし、これはこのプロトコルが単独でも実行されているため、成功するための要件ではありません。

このモデルの主な術後合併症は、移植片肝臓の血栓症であり、これは 3 つのことによって引き起こされます。まず、ステントの端に血流に渦乱を引き起こすバリや凹凸がある場合、動脈ステント自体が血栓症を引き起こす可能性があります。ステントはハサミではなく鋭利なカミソリで切断し、顕微鏡で検査して欠陥がないことを確認します。第二に、腎動脈/PVステント吻合が腎静脈/IHVC吻合の上部に配置されている場合、血流が制限され、血栓症が誘発されます。動脈ステントの最終的な配置は、IHVCの下にある必要があります( 図2Dを参照)。第三に、抗凝固剤ヘパリンによる術後治療は、同種移植の血栓症の予防に不可欠であり、一方、低用量のヘパリンも同系移植片の血栓症のリスクを排除するのに役立ちます。

ここで報告された同系移植片と比較して同種移植の生存率が低いのは、拒絶反応を示す補助肝臓の血栓促進性を反映しており、これが動脈ステントの血栓症を引き起こします。同種移植でステントが血栓になるのを防ぐことができるヘパリン投与スキームを見つけるために、いくつかの試みが必要でした。当初、手術を生き延びた最初の6人の同種移植レシピエントのうち、補助肝臓の50%が血栓症のために機能しませんでしたが、ヘパリン投与の増加後、次の最後の3つの同種移植は血栓症なしで生存しました。今後、ヘパリンの有効投与量が決定されたことで、同種移植の成功率は大幅に増加すると予想しています。同様に、同系移植の失敗も発生初期に多く発生しており、今後、同系移植の成功率も向上すると予想しています。

ルイスからブラウンへのノルウェーLTxへの急性拒絶モデルを使用しました。これは、ブラウンノルウェーからルイスへのひずみの組み合わせが¹⁶を拒絶しないためです。注目すべきは、同所性移植法がこの拒絶反応モデルで利用され、肝臓拒絶反応が起こると、レシピエント動物はうつ病になり、活動的でなくなり、14日以内に死亡する前に食事をやめるため、重度の罹患率に苦しむことです¹⁶。しかし、このヘテロトピアLTxモデルでは、死亡はエンドポイントとして使用されず、罹患率は発生しません。動物は、補助肝臓が完全に拒絶された場合でも、実験期間中は健康で活動的なままです。間違いなく、このヘテロトピアLTxモデルは、レシピエント動物が経験する痛み、苦しみ、および苦痛を最小限に抑えるのに大きく貢献しています。

常温ex vivo肝灌流(NEVLP)における最近の進歩は、臨床移植17,18,19に先立って肝臓が保存される方法における刺激的な進歩である。NEVLP中、ドナーの肝臓は生理学的活動を再開し、移植前の治療介入を可能にする^20,21。NEVLPは、辺縁臓器(高齢または肥満のドナーからの肝臓、または心臓死後にドナーから調達した肝臓)の生存率を評価するためにもますます使用されています^22,23。エキサイティングではありますが、NEVLP^24,25以降にラットの肝臓を移植できた研究室はほんの一握りです。これは、動物への外科的ストレスと、NEVLPと移植の両方のために肝臓を準備するという高い技術的要求によるものと思われます。対照的に、この原稿で概説されているヘテロトピアLTx手術技術は、技術的に要求が少なく、動物へのストレスが少ないです。そのため、NEVLPの小動物モデルとその後の移植にとって実行可能な選択肢となる可能性があります。

結論として、将来の移植拒絶研究に有益である可能性のある代替の低罹患率肝移植モデルを提示します。

著者は何も開示していません。

この研究は、DAに授与された国立衛生研究所(NIH)K08AI155816の支援を受けました。