Heterotopes Hilfstransplantationsmodell für die ganze Leber von Ratten unter Verwendung einer Hepaticoureterostomie für Studien zur Abstoßung von Allotransplantaten

Das hier beschriebene heterotope Hilfslebertransplantationsprotokoll der Ratte bietet ein praktisches Untersuchungswerkzeug zur Erforschung der Mechanismen der Abstoßung von Lebertransplantaten. Dieses Modell trägt dazu bei, die chirurgischen Hürden und den Stress der orthotopen Lebertransplantation bei Ratten zu verringern.

Kleintiertransplantationsmodelle sind unverzichtbar für Organtoleranzstudien, um in präklinischen Studien praktikable therapeutische Interventionen zu untersuchen. Bei der Rattenlebertransplantation (LTx) wird in der Regel ein orthotopes Modell verwendet, bei dem die native Leber des Empfängers entnommen und durch eine Spenderleber ersetzt wird. Dieser technisch anspruchsvolle chirurgische Eingriff erfordert fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten und wird durch lange anhepatische und unterkörpereigene Ischämiezeiten zusätzlich erschwert. Dies führte zur Entwicklung einer weniger komplizierten heterotopen Methode, die schneller und ohne anhepatische oder ischämieartige Zeit des Unterkörpers durchgeführt werden kann, wodurch der postoperative Stress für das Empfängertier reduziert wird.

Dieses heterotope LTx-Protokoll umfasst zwei Hauptschritte: das Herausschneiden der Leber der Spenderratte und das Transplantieren der gesamten Leber in die Empfängerratte. Während der Exzision der Spenderleber ligatisiert der Chirurg die suprahepatische Hohlvene (SHVC) und die Leberarterie (HA). Auf der Empfängerseite entfernt der Chirurg die linke Niere und positioniert die Spenderleber mit der Pfortader (PV), der infrahepatischen Hohlvene (IHVC) und dem Gallengang in Richtung der Nierengefäße. Weiterhin anastomosiert der Chirurg die Nierenvene des Empfängers von Ende zu Ende mit dem IHVC der Leber und arteriisiert die PV mit der Nierenarterie unter Verwendung eines Stents. Eine Hepaticoureterostomie wird für die Gallendrainage eingesetzt, indem der Gallengang in den Harnleiter des Empfängers anastomosiert wird, wodurch die Galle über die Blase abgeführt werden kann.

Die durchschnittliche Dauer der Transplantation betrug 130 Minuten, die Dauer der kalten Ischämie betrug etwa 35 Minuten und die Dauer der warmen Ischämie betrug weniger als 25 Minuten. Die Hämatoxylin- und Eosin-Histologie der Hilfsleber aus syngenen Transplantaten zeigte 30 Tage nach der Transplantation eine normale Hepatozytenstruktur ohne signifikante parenchymale Veränderungen. Im Gegensatz dazu zeigten allogene Transplantatproben 8 Tage nach der Transplantation eine umfangreiche lymphozytäre Infiltration mit einem Banff-Schema-Abstoßungsaktivitätsindex von 9. Daher ermöglicht diese LTx-Methode eine Alternative zu orthotopem LTx mit niedrigem Morbiditätsabstoßungsmodell.

Kleintier-LTx ist ein unschätzbares Modell für die Untersuchung von Mechanismen der Leberabstoßung. Die heterotope Hilfslebertransplantation mit Pfortaderarterialisation (HALT-PVA) bei Ratten wurde 1968 von Lee und Edgington¹eingeführt, als sie berichteten, dass die Nierenvene und die Arterie eines Empfängers verwendet wurden, um eine transplantierte Hilfsleber wieder zu vaskularisieren. In der Folge verbesserten Hess et ^al.2 das Protokoll durch die Abschwächung der funktionellen Konkurrenz zwischen der nativen und der Hilfsleber, indem sie die Größe der nativen Leber und der Spenderleber reduzierten und die Verbindung zwischen den Spendergallengängen rekonstruierten, was zu einem langfristigen Überleben des Transplantats führte. Weitere Verfeinerungen wurden mit der Einführung der Manschettenanastomose ^3,4 vorgenommen, und Schleimer et ^al.5 bestimmten den optimalen Stentdurchmesser für die Regulierung des Blutflusses, um einen physiologischen Pfortaderfluss zu erhalten und eine Hyper- oder Hypoperfusion des Transplantats zu vermeiden. Andere Forscher entwickelten signifikante Veränderungen des Verfahrens, indem sie die Milzarterie⁶ oder die Arteria iliaca⁷ communis für die Blutversorgung des Transplantats verwendeten, während einige Modelle entwickelten, die nur venöses Blut⁸ oder nur arterielles Blut über die Leberarterie⁹ verwendeten, um das zusätzliche Lebertransplantat zu versorgen.

Die vorliegende Studie ging von der Hypothese aus, dass die funktionelle Konkurrenz durch die native Leber die Abstoßung des Allotransplantats nicht beeinträchtigen würde, daher entwickelten wir ein Protokoll auf der Grundlage des flussregulierten Schleimer-Modells¹⁰ , das keine Größenreduktion der nativen oder Hilfsleber beinhaltete. Die linke Seite des Empfängers wurde ausgewählt, um das Transplantat zu lokalisieren, da sie eine optimale Orientierung zwischen den Nieren- und Spenderlebergefäßen des Empfängers bietet. Ursprünglich versuchten wir eine Gallenrekonstruktion mittels Hepaticoduodenostomie, aber diese Versuche bestätigten lediglich Schleimers Behauptung, dass "die Gallendrainage die Achillesferse der Lebertransplantation ist"¹⁰. Dies veranlasste die Entwicklung einer neuen Technik, bei der der Gallengang mit einem Stent mit dem Harnleiter des Empfängers durchgehend anastomosiert wird, was den Abfluss der Galle über die Blase ermöglicht. Ein bemerkenswerter Vorteil einer Hepatikureterostomie besteht darin, dass die Leberfunktion des Transplantats täglich durch Beobachtung des Urins überwacht werden kann. Ein Gallen produzierendes Lebertransplantat färbt den Urin hellgelb. Abbildung 1 stellt einen schematischen Überblick über die HALT-PVA-Methode dar.

Ein wichtiger Vorteil der heterotopen gegenüber der orthotopen Ratten-LTx bezieht sich auf das Fehlen einer anhepatischen oder totalen Unterkörperischämiezeit, was eine schnellere und einfachere Genesung der heterotopen Empfänger ermöglicht. Darüber hinaus stützen sich immunologische LTx-Studien mit orthotopen Methoden oft auf eine schwere Abstoßung oder den Tod des Empfängers als experimentellen Endpunkt, was bei heterotopen Transplantaten nicht der Fall ist, bei denen das Tier auch dann gesund bleibt, wenn das Allotransplantat aufgrund einer Abstoßung nicht mehr funktioniert. Beide Merkmale der heterotopen Methode unterstützen die Prinzipien der internationalen 3R-Initiative (Replacement, Reduction, and Refinement)¹¹, die einen Rahmen zur Minimierung von Schmerzen, Leiden und Leiden von Versuchstieren und zur Verbesserung ihres Wohlbefindens fördert.

Das hier vorgestellte HALT-PVA-Modell ist eine praktische und zuverlässige Methode, um die Mechanismen der Abstoßung von Allotransplantaten in der Leber in präklinischen Studien zu untersuchen. Diese nützliche experimentelle Technik hilft, den erheblichen chirurgischen Bedarf und den Stress der orthotopen LTx bei Ratten zu überwinden. In Zukunft beabsichtigen wir, diese Methode zu nutzen, um die Mechanismen der akuten Immunabstoßung zu untersuchen und gleichzeitig neue Ziele und therapeutische Strategien zur Unterdrückung der Abstoßung von Lebertransplantaten zu erforschen.

Die Tiere wurden in den Tierpflegeeinrichtungen der University of Wisconsin (UW)-Madison Institute for Medical Research gemäß den institutionellen Richtlinien gezüchtet und unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Das Studienprotokoll (Nr. M006022) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee an der UW School of Medicine and Public Health genehmigt, und alle Tiere wurden ethisch behandelt.

1. Tiere

1. Als Spenderratten werden adulte weibliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 205-235 g und männliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 250-280 g verwendet. Als Empfänger werden adulte männliche Lewis- und Brown-Ratten mit einem Gewicht von 365-420 g verwendet.
2. Führen Sie syngene Transplantationen durch, indem Lewis-Spender in Lewis-Empfänger transplantiert werden, während bei den allogenen Transplantaten Lewis-Spender verwendet werden, die in Brown-Norwegen-Empfänger transplantiert wurden.
3. Führen Sie alle Operationen von zwei Personen mit einem Doppelkopfmikroskop durch.

2. Verfahren zur Beschaffung von Leberhilfsspendern

1. Betäuben Sie die Spenderratte mit 5% Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer. Notieren Sie das Gewicht der Ratte und rasieren Sie den Bauch mit einer elektrischen Schermaschine.
2. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer beheizten Operationsunterlage mit der Nase in einem Anästhesiekegel und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Desinfizieren Sie den Bauch mit 75% Alkohol und senken Sie den Isofluran auf 2%.
3. Machen Sie mit einer Schere einen Haut- und Muskelschnitt in Längsrichtung der Mittellinie vom Schambein bis zum Xiphoid. Nahe der Mitte des Längsschnitts wird dieser seitlich nach links und rechts verlängert, dann werden auf beiden Seiten der Bauchdecke und des Xiphoid-Prozesses Retraktoren installiert.
4. Ziehen Sie den Darm mit feuchten Wattestäbchen auf die linke Seite des Bauches zurück, während Sie mit einer Federschere die an der Leber befestigten Magenbänder durchtrennen und dann den Darm unter angefeuchteter Gaze ruhigstellen. Decken Sie die Leber mit einem kleinen Stück steriler Gaze ab, die mit warmer Kochsalzlösung angefeuchtet ist.
5. Verwenden Sie feuchte Wattestäbchen, um die Leber zurückzuziehen und die falciformen, dreieckigen, hepatogastrischen und hepatoduodenalen Bänder zu präparieren. Anschließend wird mit einer bipolaren Pinzette kauterisiert und die paraösophagealen Gefäße zwischen dem linken lateralen und dem vorderen Schwanzlappen geteilt.
6. Präparieren Sie mit einer Winkelzange oder Nadelhaltern hinter dem SHVC unterhalb des Zwerchfells, führen Sie dann eine 5-0-Seidennaht unter das SHVC und binden Sie locker einen Doppelknoten für den späteren Gebrauch.
7. Ziehen Sie den unteren rechten Seitenlappen nach oben zurück, durchtrennen Sie das Band und immobilisieren Sie es unter angefeuchteter Gaze. Isolieren Sie das IHVC aus dem retroperitonealen Gewebe bis hinunter zur rechten Nierenvene und ligieren Sie die rechte Nebennierenvene mit einer 6-0-Seidennaht so nah wie möglich an der IHVC. Teilen Sie diese Vene später, wenn das Transplantat entfernt wird.
8. Dissoziieren Sie das PV mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel (Abbildung 2A) vom umgebenden Bindegewebe und trennen es von den Pylorus- und Milzvenen, indem Sie sie mit einer 7-0-Seidennaht ligatisieren und teilen.
9. Isolieren, mit einer 6-0-Seidennaht ligatisieren und die Arteria hepatica communis in der Nähe der Stelle teilen, an der sie unter der PV verläuft.
10. Lilizieren Sie den Gallengang mit einer 5-0-Seidennaht an der Verzweigung der Arteria gastroduodenalis, wobei das Fettgewebe um den Gallengang herum so weit wie möglich erhalten bleibt. Vermeiden Sie insbesondere, den Gallengang von der eigentlichen Leberarterie zu trennen, und halten Sie die Gesamtlänge so kurz wie möglich.
11. Machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt in die Wand des Gallengangs proximal der Ligatur. Führen Sie einen Polyimidschlauch-Stent mit einem Durchmesser von 0,0215 Zoll und einem Durchmesser von 5 mm in das Gallengangslumen ein und befestigen Sie ihn mit einer 6-0-Seidennaht, wobei ein Ende der Naht für die spätere Verwendung lang bleibt. Teilen Sie den Gallengang, indem Sie zwischen den Ligaturen 5-0 und 6-0 schneiden.
12. Markieren Sie die Oberseite von IHVC und PV mit einem chirurgischen Färbestift, um die Gefäße während der Anastomose auszurichten, und klemmen Sie dann die Pfortader mit einer Mikrogefäßklemme so distal wie möglich zur Leber ein.
13. Führen Sie eine 20-ml-Spritze mit einer 26-g-Nadel in das PV proximal der Mikroklemme ein und perfundieren Sie die Leber mit 10-15 ml eiskalter, heparinisierter Kochsalzlösung; Teilen Sie gleichzeitig den IHVC mit einer Federschere so nah wie möglich an der rechten Nierenvene.
14. Exzitieren Sie die Leber mit einer Federschere, indem Sie das PV proximal zur Mikroklemme präparieren, die zuvor um das SHVC gelegte 5-0-Naht festziehen und das Zwerchfell präparieren, um die intrathorakale Hohlvene zu durchtrennen.
15. Fahren Sie fort, indem Sie die verbleibenden Bänder im hinteren Teil der Leber präparieren und die zuvor ligierte Nebennierenvene teilen. Legen Sie die herausgeschnittene Leber in kalte Kochsalzlösung auf Eis.

3. Verfahren zur Transplantation von Hilfslebern

1. Betäuben Sie die Empfängerratte mit einer 5%igen Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer. Notieren Sie das Gewicht der Ratte und rasieren Sie den Bauch mit einer elektrischen Schermaschine.
2. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer beheizten Operationsunterlage mit der Nase in einem Anästhesiekegel und fixieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Tragen Sie ein Augenschmiermittel auf, desinfizieren Sie den Bauch mit 75% Alkohol und senken Sie den Isofluran auf 2%.
3. Machen Sie mit einer Schere einen Längsschnitt in der Mittellinie der Haut und der Muskeln vom Schambein bis zum Xiphoid und installieren Sie dann Retraktoren auf beiden Seiten der Bauchdecke.
4. Ziehen Sie die Eingeweide mit feuchten Wattestäbchen auf die rechte Seite des Bauches zurück und bedecken Sie sie mit angefeuchteter Gaze. Tragen Sie eine weitere feuchte Gaze auf, um Magen, Milz und Leber zu bedecken, und legen Sie die linke Niere und die Nierengefäße frei.
5. Trennen Sie mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel und einer Zange mit stumpfer Spitze die linke Nierenvene von der Nierenarterie und entfernen Sie vorsichtig Fett und Bindegewebe aus beiden Gefäßen.
6. Isolieren Sie die Gonaden- und Nebennierenvenen und verwenden Sie 6-0-Seide, um sie proximal zur Nierenvene vorübergehend zu ligieren. Mit einer bipolaren Pinzette werden alle Mikroseitenäste, die die Nierenvene und die Arterie zwischen der Aorta/VC und der Niere isolieren, verätzt.
7. Mobilisieren und ligieren Sie den Harnleiter mit einer 6-0-Seidennaht am unteren Pol. Markieren Sie die Nierenvene und die Arterie mit einem chirurgischen Färbestift, um die Gefäße während der Anastomose auszurichten und sicherzustellen, dass keine Verdrehungen auftreten.
8. Klemmen Sie die Nierenarterie und die Nierenvene mit einer Mikrogefäßklemme so nah wie möglich an der Aorta und VC. Durchschneiden Sie die Nierenarterie mit einer Federschere kurz hinter der Gefäßgabelung und teilen Sie die Nierenvene etwa auf halbem Weg zwischen VC und Niere. Mobilisieren Sie die linke Niere aus dem umgebenden Bindegewebe und entfernen Sie diese.
9. Spülen Sie beide Gefäße mit heparinisierter Kochsalzlösung mit einer 27-G-Hydrodissektionsnadel, um das restliche Blut zu entfernen.
10. Schneiden Sie mit einer Federschere eine kleine Öffnung des Fischmauls in die Gabel der Nierenarteriengabelung, um eine trichterförmige Öffnung zu erhalten, und setzen Sie einen 8 mm Stent, der aus einem 26 G-Katheter geschnitten wurde (Abbildung 2B). Befestigen Sie den Stent mit einer 6-0-Seidennaht, wobei Sie ein Ende der Naht für die spätere Verwendung lang lassen.
11. Führen Sie die Spenderleber ein und positionieren Sie sie mit dem PV, dem IHVC und dem Gallengang in Richtung der linken Nierenvene und Arterie des Empfängers. Platzieren Sie mit einer 9-0-Nylonnaht zwei Stay-Nähte auf gegenüberliegenden Seiten der IHVC-Nierenvenenverbindung.
12. Vergleichen Sie die Breite der Gefäße und machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt aus dem Fischmaul in das Gesicht der Nierenvene, bis es eine ähnliche Breite wie die IHVC des Spenders hat (Abbildung 2C).
13. Anastomosieren Sie mit einer 9-0-Nylonnaht das Leber-IHVC von Ende zu Ende mit der Nierenvene mit 9 oder 10 verlaufenden Nähten an der Vorder- und Rückwand des Gefäßes. Alternativ können Sie eine Manschettenmethode verwenden, um diese Anastomose^{zu vervollständigen 3,4}.
14. Vergewissern Sie sich, dass sich die Position der Nierenarterie unter dem IHVC befindet (Abbildung 2D), und führen Sie den zuvor in der Nierenarterie platzierten Stent in die Leberpfortader ein und befestigen Sie ihn mit einer 6-0-Seidennaht, wobei Sie ein Ende der Naht lang lassen, um mit dem gegenüberliegenden Faden an der Arterie zu verbinden. Ziehe die Enden zusammen, damit sie nicht vom Stent rutschen.
15. Entfernen Sie zuerst die Mikroklemme an der Nierenvene, dann die Mikroklemme an der Nierenarterie.
16. Während der Reperfusion der Leber wird mit Mulle und Wattestäbchen leichter Druck auf die Anastomosenregion ausgeübt, bis eine offene Anastomose erreicht ist (Abbildung 2D). Entfernen Sie die temporären Ligaturen, die zuvor an den Nebennieren- und Gonadenvenen platziert wurden.
17. Mobilisieren Sie vorsichtig etwa 10 mm am Ende des linken Harnleiters aus dem umgebenden Bindegewebe und lassen Sie eine beträchtliche Menge an Fettgewebe anhaften. Machen Sie mit einer Federschere einen kleinen Schnitt in die Wand des Harnleiters proximal der zuvor platzierten 5-0-Ligatur.
18. Führen Sie den zuvor am Gallengang befestigten Polyimid-Stent in den kleinen Schnitt in der Harnleiterwand ein. Befestigen Sie es mit einer 6-0-Seidennaht und binden Sie ein Ende mit dem langen Faden auf der Gallengangsseite des Stents zusammen, indem Sie beide Enden fest zusammenziehen.
19. Bringen Sie den Darm wieder in seine natürliche Position zurück (Abbildung 2E), spülen Sie mit 2-3 ml Kochsalzlösung und verschließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit 3-0 Seidennähten.
20. Injizieren Sie 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan, setzen Sie den Empfänger in einen sauberen, beheizten Käfig und überwachen Sie die Genesung 1-2 Stunden lang, bevor Sie das Tier in die Haltungseinrichtung zurückbringen.

4. Nachsorge nach der Operation

1. Ab Tag 2 nach der Operation wird allogenen Transplantatempfängern täglich subkutan Heparin (1 I.E./g) injiziert.
2. Ab dem 2. Tag nach der Operation injizieren Sie syngenen Transplantatempfängern jeden zweiten Tag subkutan Heparin (1 I.E./2 g).

Gegenwärtig wurden 29 Rattenpaare verwendet, um das HALT-PVA-Protokoll zu etablieren, 17 syngene Transplantate und 12 allogene Transplantate. Die syngenisch transplantierten Lebern überlebten bis zu ihrem vorgesehenen 8- oder 30-Tage-Endpunkt mit einer Erfolgsrate von 70 %, während allogene transplantierte Lebern mit einer Erfolgsquote von 50 % bis zu ihren vorgesehenen 3- oder 8-Tage-Endpunkten überlebten. Zu den Misserfolgen gehören Ratten, die aufgrund chirurgischer Komplikationen starben, und Hilfslebern, die auch dann versagten, wenn der Empfänger überlebte.

Die durchschnittliche Dauer der Operation betrug 130 min, mit einer kalten Ischämiezeit von ca. 35 min und einer warmen Ischämiezeit von weniger als 25 min. Unter der Voraussetzung, dass es keine intraoperativen Komplikationen gab, wachten die Empfänger innerhalb von 10-20 Minuten auf und wurden aktiv, begannen innerhalb von 1 h zu trinken und zu wandern und 24 h später verhielten sie sich wie normale gesunde Ratten.

Syngene Lebertransplantate zeigten 30 Tage nach der Transplantation eine ausgezeichnete Farb- und Gallengangsdurchgängigkeit (Abbildung 3), während die Histologie von Hämatoxylin und Eosin (H&E) eine normale Hepatozytenstruktur ohne signifikante Parenchymveränderungen sowohl zu den 8-Tage- als auch zu den 30-Tage-Zeitpunkten zeigte (Abbildung 4A,B). Nach nur 3 Tagen zeigte die Histologie der allogenen Transplantate eine signifikante portale Entzündung (Abbildung 4C), während die 8-Tage-allogenen Transplantate eine akute zelluläre Abstoßung mit ausgedehnter lymphozytärer Infiltration zeigten (Abbildung 4D).

Repräsentative allogene und syngene LTx-Proben wurden von einem staatlich geprüften Leberpathologen bewertet, und die Abstoßung wurde anhand des Banff-Schema-Abstoßungsaktivitätsindex (RAI)¹² bewertet. Die pathologische Untersuchung ergab sowohl bei 8-Tage- als auch bei 30-Tage-Syngentransplantaten keine Abstoßung mit einem Banff RAI von 0, während 8-Tage-Allotransplantate mit einem Banff RAI-Score von 9 stark abgestoßen wurden (Tabelle 1).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des HALT-PVA-Verfahrens bei Ratten. Der PV wird mit Hilfe eines Stents mit der linken Nierenarterie arteriell versorgt, der IHVC wird von Ende zu Ende mit der linken Nierenvene anastomosiert und der Gallengang wird mit einem Stent am Harnleiter befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Chirurgischer Eingriff. (A) Hydrodissektion von PV. Dissoziieren Sie das PV mit einer 27 G Hydrodissektionsnadel vom umgebenden Bindegewebe. (B) Einsetzen eines arteriellen Stents. Der arterielle Stent wird in eine kleine trichterförmige Öffnung eingeführt, die in die Gabel der Nierenarteriengabelung geschnitten ist. (C) Erweiterung der Nierenvene. Um die größere Breite des Spender-IHVC für die Anastomose anzupassen, wird ein kleiner Fischmaulschnitt in das Gesicht der Nierenvene des Empfängers gemacht, nachdem zwei Stay-Nähte gelegt wurden. (D) Perfundiertes Lebertransplantat unmittelbar nach der Anastomose. Die Positionierung der Nierenarterie und der PV-Verbindung unter der Nierenvene und der IHVC ist entscheidend für die Vorbeugung von Thrombosen des Transplantats. (E) Ratten-HALT-PVA in situ. Die Hilfsleber wird an der linken Bauchwand positioniert, bevor sie in den Darm zurückkehrt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Syngene HALT-PVA 30 Tage nach der Transplantation. (A) Nach 30 Tagen hat die Hilfsleber eine ähnliche Farbe und Textur wie die native Leber, während (B) der Gallengang und der PV-Stent offen und uneingeschränkt bleiben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Histologie von Leberhilfstransplantaten. H&E-Färbung von (A) 8-Tage- und (B) 30-Tage-posttransplantierten syngenen Transplantaten, die eine normale Hepatozytenstruktur aufweisen, zusammen mit (C) 3-Tage- und (D) 8-Tage-allogenen Transplantaten, die eine portale Entzündung und lymphozytäre Infiltration aufweisen. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Banff-Schema. Abstoßungsaktivitätsindex (RAI) von allogenen und syngenen LTx's der Ratte.

Die Lebertransplantation ist die einzige Behandlungsoption für Patienten mit Lebererkrankungen im Endstadium, wobei in den USA jährlich fast 9.000 LTxs durchgeführt werden¹³. Leider wird bei bis zu 25 % der LTx-Empfänger eine immunologische Abstoßung beobachtet, die sich nachteilig auf das transplantierte Organ und den Patienten auswirkt^14,15. Um die Ergebnisse nach LTx zu verbessern, ist die Entwicklung innovativer Modelle zur Untersuchung der Organabstoßung und die Implementierung von Strategien zur Verringerung der Abstoßung erforderlich.

Im Vergleich zur orthotopen Rattenlebertransplantation ist das vorliegende heterotope Modell bemerkenswert einfach zu etablieren. Der Grad der technischen Schwierigkeit lässt sich am besten berechnen, wenn man den schwierigsten Schritt des Verfahrens berücksichtigt, nämlich die End-to-End-Anastomosen des IHVC zur Nierenvene. Unsere persönliche Präferenz für diese Verbindung ist die Verwendung traditioneller Nähte, während andere ein Manschettensystem bequemer finden ^3,4; In jedem Fall verfügt jeder, der mit der End-to-End-Anastomose einer 3-mm-Vene mit einer beliebigen Methode vertraut ist, über alle technischen Fähigkeiten, die für die Durchführung dieses Verfahrens erforderlich sind. Da wir Zugang zu einem Doppelkopfmikroskop haben, bevorzugen wir es, diese Operationen mit zwei Personen durchzuführen. Dies ist jedoch keine Voraussetzung für den Erfolg mit diesem Protokoll, da es auch solo durchgeführt wurde.

Die primäre postoperative Komplikation dieses Modells ist die Thrombose der Transplantatleber, die durch drei Faktoren provoziert wird. Erstens kann der arterielle Stent selbst eine Thrombose auslösen, wenn die Enden des Stents Grate oder Unregelmäßigkeiten aufweisen, die wirbelnde Turbulenzen im Blutfluss verursachen. Der Stent sollte mit einem scharfen Rasiermesser und nicht mit einer Schere geschnitten und dann unter dem Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass keine Unvollkommenheiten vorhanden sind. Zweitens, wenn die Nierenarterien-/PV-Stent-Anastomose auf der Nierenvene/IHVC-Anastomose positioniert wird, schränkt sie den Blutfluss ein und induziert eine Thrombose. Die endgültige Platzierung des arteriellen Stents sollte unter dem IHVC erfolgen, siehe Abbildung 2D. Drittens ist die postoperative Behandlung mit dem Gerinnungshemmer Heparin unerlässlich, um Thrombosen bei allogenen Transplantaten zu verhindern, während eine niedrigere Dosis Heparin auch hilfreich ist, um das Thromboserisiko bei den syngenen Transplantaten zu beseitigen.

Die niedrigere Überlebensrate der allogenen Transplantate im Vergleich zu den hier berichteten syngenen Transplantaten spiegelt die prothrombotische Natur der abstoßenden Hilfsleber wider, die eine Thrombose des arteriellen Stents auslöst. Es waren mehrere Versuche erforderlich, um ein Heparin-Dosierungsschema zu finden, das die Thrombose des Stents bei allogenen Transplantaten verhindern konnte. Von den ersten 6 Empfängern von Allotransplantaten, die die Operation überlebten, versagten zunächst 50 % der Hilfslebern aufgrund von Thrombosen, aber nach einer Erhöhung der Heparindosis überlebten die nächsten, letzten drei allogenen Transplantate ohne Thrombose. Nachdem wir eine wirksame Heparindosis bestimmt haben, erwarten wir, dass die Erfolgsrate allogener Transplantationen signifikant steigen wird. Ebenso traten die meisten syngenen Misserfolge früh in der Entwicklung auf, und wir erwarten, dass sich die Erfolgsrate syngener Transplantationen ebenfalls verbessern wird.

Wir haben das Modell der akuten Abstoßung von Lewis zu Brown Norway LTx verwendet, da die Kombination aus Brown-Norwegen zu Lewis-Stamm¹⁶ nicht abstößt. Es ist bemerkenswert, dass, wenn orthotope Transplantationsmethoden mit diesem Abstoßungsmodell angewendet werden und eine Leberabstoßung auftritt, die Empfängertiere eine schwere Morbidität erleiden, da sie depressiv und inaktiv werden und aufhören zu fressen, bevor sie innerhalb von 14 Tagen sterben¹⁶. Bei diesem heterotopen LTx-Modell wird der Tod jedoch nicht als Endpunkt verwendet, und Morbidität tritt nicht auf; Das Tier bleibt für die Dauer des Versuchs gesund und aktiv, auch wenn die Hilfsleber vollständig abgestoßen wird. Zweifellos trägt dieses heterotope LTx-Modell wesentlich dazu bei, die Schmerzen, Leiden und Ängste der Empfängertiere zu minimieren.

Die jüngsten Fortschritte in der normothermen ex vivo Leberperfusion (NEVLP) sind ein spannender Fortschritt in der Art und Weise, wie Lebern vor einer klinischen Transplantation gelagert werden 17,18,19. Während der NEVLP nimmt die Spenderleber ihre physiologische Aktivität wieder auf, was therapeutische Eingriffe vor der Transplantation ermöglicht^20,21. NEVLP wird zunehmend auch zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von marginalen Organen (Lebern von älteren oder adipösen Spendern oder Lebern, die von Spendern nach dem Herztod beschafft wurden) ^{eingesetzt22,23}. Obwohl es spannend ist, war nur eine Handvoll Labore in der Lage, Rattenlebern nach NEVLP ^24,25 zu transplantieren. Dies ist wahrscheinlich auf die chirurgische Belastung des Tieres und den hohen technischen Aufwand zurückzuführen, die mit der Vorbereitung der Leber sowohl für NEVLP als auch für die Transplantation verbunden sind. Im Gegensatz dazu ist die in diesem Manuskript beschriebene heterotope LTx-Operationstechnik technisch weniger anspruchsvoll und verursacht weniger Stress für das Tier. Als solches könnte es eine praktikable Option für Kleintiermodelle von NEVLP und anschließende Transplantationen sein.

Abschließend stellen wir ein alternatives, niedriges Morbiditätsmodell für Lebertransplantationen vor, das für zukünftige Studien zur Abstoßung von Transplantaten von Vorteil sein könnte.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Forschung wurde vom National Institute of Health (NIH) K08AI155816 unterstützt, der an DA vergeben wurde.