השתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת שרוול

כאן, מוצג פרוטוקול להשתלת שתל כלי דם מהונדס רקמות בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, המספק מודל בעל חיים מתאים לחקירת מנגנוני התחדשות רקמות כלי הדם.

פיתוח שתלי כלי דם בקוטר קטן היה מאמץ עולמי, עם קבוצות מחקר רבות התורמות לתחום זה. ניסויים בבעלי חיים ממלאים תפקיד מרכזי בהערכת היעילות והבטיחות של שתלים בכלי דם, במיוחד בהיעדר יישומים קליניים. בהשוואה למודלים חלופיים של בעלי חיים, מודל השתלת העכברים מציע מספר יתרונות, כולל רקע גנטי מוגדר היטב, שיטה בוגרת לבניית מודל מחלה והליך כירורגי פשוט. בהתבסס על יתרונות אלה, המחקר הנוכחי המציא טכניקת שרוול פשוטה להשתלת שתלי כלי דם מהונדסים רקמות בעורק הצוואר של העכבר. טכניקה זו החלה בייצור שתלי כלי דם בקוטר קטן של פוליקפרולקטון (PCL) באמצעות ספינינג אלקטרוסטטי, ולאחר מכן זריעה של מקרופאגים על השתלים באמצעות ספיחת זלוף. לאחר מכן, שתלי כלי הדם המהונדסים ברקמות תאיות הושתלו בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול כדי להעריך את הסבלנות ויכולת ההתחדשות. לאחר 30 יום של השתלה in vivo , הסבלנות של כלי הדם נמצאה משביעת רצון, עם עדות להתחדשות רקמות ניאו והיווצרות שכבת אנדותל בתוך לומן השתלים. כל הנתונים נותחו באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. מחקר זה ביסס בהצלחה מודל השתלת עורק הצוואר של עכבר שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המקורות התאיים של התחדשות כלי הדם ואת מנגנוני הפעולה של חומרים פעילים. יתר על כן, הוא מספק תמיכה תיאורטית לפיתוח שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן.

השכיחות והתמותה של מחלות לב וכלי דם עולות ברחבי העולם, ומייצגות דאגה משמעותית לבריאות הציבור¹. השתלת מעקף כלי דם היא התערבות יעילה למחלת לב כלילית חמורה ומחלת כלי דם היקפיים². השימוש בשתלי כלי דם מלאכותיים בקוטר העולה על 6 מ"מ תועד היטב במסגרות קליניות. לעומת זאת, בעלי קוטר מתחת ל -6 מ"מ נוטים לפקקת והיפרפלזיה אינטימית, מה שעלול להוביל לסיכון ניכר לרסטנוזיס³. למרות התקדמות משמעותית במחקר ופיתוח של שתלי כלי דם בקוטר קטן בשנים האחרונות, עם מספר מוצרים המתקרבים ליישום קליני, נותרו אתגרים מרובים ^4,5. אלה כוללים שיעור סבלנות נמוך יחסית לטווח ארוך, התחדשות כלי דם מוגבלת והבנה לא מספקת של מנגנון ההתחדשות.

הערכה פרה-קלינית של שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן מסתמכת על השתלה in vivo במודלים שונים של בעלי חיים. המודלים הנפוצים ביותר כוללים את עורק הצוואר של הכבשים, עורק הירך של הכלב, עורק הצוואר של הארנב ודגמי השתלת עורק הבטן של חולדות 6,7,8,9. ניתן להעריך את הסבלנות של שתלי כלי דם בבעלי חיים בינוניים עד גדולים, כגון כבשים, חזירים וכלבים. עם זאת, מחקרים אלה כרוכים בעלויות משמעותיות בשל המומחיות והציוד הנדרשים. בנוסף, המורכבות הטכנית שלהם מציבה אתגר ליישום. לעומת זאת, במודלים של בעלי חיים קטנים כמו ארנבות וחולדות חסרים מינים טרנסגניים מבוססים היטב עם רקע גנטי מוגדר בבירור, מה שמהווה מכשול משמעותי בחקר מנגנוני התחדשות כלי הדם.

בהשוואה למודלים של בעלי חיים שהוזכרו לעיל, מודל העכבר מציע הליך כירורגי פשוט יחסית, מתודולוגיה מבוססת היטב ליצירת עכברים מהונדסים גנטית ורקע גנטי מוגדר בבירור. עם זאת, הקוטר הקטן של כלי הדם של העכברים הופך את האנסטומוזה מקצה לקצה בהשתלת כלי דם למורכבת מבחינה טכנית, הדורשת מומחיות משמעותית ומניבה אחוזי הצלחה נמוכים יחסית. כדי להפחית את מורכבות ההליך ולשפר את אחוזי ההצלחה של השתלת שתל כלי דם, המחקר הנוכחי השתמש בטכניקת השרוול במודל השתלת עורק הצוואר של עכבר.

לאחר השתלת in vivo , שתלים וסקולריים יכולים לגייס תאים אנדוגניים התורמים להתחדשות רקמות כלי הדם. נוכחותם של תאים אלה מקלה על אנדותליזציה והתחדשות של שכבת השריר החלק של השתלים. ¹⁰. עם זאת, מקור וסוג התאים המעורבים בהתחדשות רקמות כלי הדם נותרו לא ברורים, ותיאוריות מתחרות מרובות נחקרות¹¹. בין אלה, המחקר התמקד בתפקידים של תאי דלקת ותאי גזע. ברויאר ועמיתיו זרעו מונוציטים שמקורם במח עצם אנושי (hBMCs) על שתלים וסקולריים ומצאו כי התאים הזרעים גייסו תאי מארח לדופן השתל באמצעות שחרור חלבון כימואטרקנטי מונוציטי-1 (MCP-1), ובכך קידמו את התחדשות רקמת כלי הדם¹². במחקר זה, הוצעה שיטת זריעת תאים יעילה לספיחת זלוף ושימשה בהצלחה לזריעה של מקרופאגים על גבי שתלי כלי דם בקוטר קטן של פוליקפרולקטון (PCL). לאחר ההשתלה, תאים אלה הפגינו כדאיות מתמשכת.

מאמר זה מפרט את המתודולוגיה להכנת שתלי כלי דם מהונדסי רקמות ואת הליך השתלת עורק הצוואר בעכברים בטכניקת השרוול. התהליך מתחיל בייצור שתלי כלי דם בקוטר קטן PCL עם פרמטרים מוגדרים באמצעות ספינינג אלקטרוסטטי. לאחר מכן, שתלים הנחשבים מתאימים להשתלה עוברים בדיקות מכניות. לאחר מכן נזרעים מקרופאגים על שתלי כלי הדם בשיטת ספיחת הזלוף. לבסוף, שתלי כלי דם זרעי מקרופאגים מושתלים בעורק הצוואר של העכבר בטכניקת השרוול, ותכונות הסבלנות וההתחדשות מנותחות לאחר חודש של השתלת in vivo .

לטכניקה זו יש פוטנציאל לשפר את היעילות ושיעורי ההצלחה של השתלת כלי דם במודלים של עכברים. יתר על כן, ניתן להשתמש במודל כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס מקורות תאים, גנים מרכזיים וגורמים פעילים בהתחדשות כלי הדם, ולספק תמיכה תיאורטית ומתודולוגית לשינוי תפקודי ופיתוח של שתלי כלי דם חדשים בקוטר קטן.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של המכון לרפואת קרינה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, ועמדו בהנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6, בני 6-8 שבועות, עם משקל גוף של 25-30 גרם. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור שתלים וסקולריים בקוטר קטן

הערה: לייצר שתלי כלי דם PCL בקוטר קטן בטכניקת אלקטרו-ספינינג¹³.

1. הכן תמיסות PCL ב-10%, 15% ו-20% (w/v) ב-hexafluoroisopropanol (HFIP) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 12 שעות.
2. טען את תמיסות ה-PCL למזרק של 10 מ"ל ומקם את המזרק עם מחט נירוסטה 21 גרם.
3. הניחו ציר מפלדת טונגסטן (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 20 ס"מ) על מכשיר האיסוף.
4. לייצר תשע קבוצות של שתלי כלי דם PCL בטכניקת אלקטרו-ספינינג. חבר ספק כוח בעל מתח גבוה למחט. מקם מוט פלדת טונגסטן בקוטר פנימי של 0.7 מ"מ במרחק קבוע מול המחט כמכשיר קבלה.
   הערה: התיאור של קבוצות השתלות כלי הדם מופיע בטבלה 1, והפרמטרים של שתלי כלי הדם מפורטים בטבלה 2.
5. הכפף את שתלי כלי הדם המפוברקים לתהליך פינוי. הכניסו את השתלים לכלי הדם לתנור לייבוש ואקום למשך 72 שעות כדי להסיר שאריות ממסים.
6. עקר את השתלים על ידי טבילתם באלכוהול רפואי למשך 30 דקות וחשיפתם לאור UV למשך הלילה.
7. התבוננו במורפולוגיה המיקרוסקופית של שתלי כלי הדם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). חבר את שתלי כלי הדם לשלב דגימת ה-SEM עם דבק מוליך והנח אותם במכשיר התזת הזהב לציפוי.
   1. התבונן במבנה ובמורפולוגיה של הסיבים של שתלי כלי הדם באמצעות SEM במתח מאיץ של 15 קילו וולט. מדוד את קוטר הסיבים וגודל הנקבוביות מתמונות SEM (n = 5) באמצעות תוכנת ImageJ.
8. להעריך את התכונות המכניות (תכונות מתיחה ואלסטיות) של השתלים בכלי הדם באמצעות מכונת בדיקת מתיחה. מהדקים את הקצוות העליונים והתחתונים של שתל כלי הדם בעזרת מהדקים קבועים המרוחקים 1 ס"מ זה מזה.
   1. מותחים את שתל כלי הדם בקצב של 10 מ"מ לדקה עד לקרע. אסוף את עקומת המתח-מתח ממכונת בדיקת המתיחה.
   2. חשב פרמטרים מכניים, כולל עומס מרבי (2-15 N), מתח בהפסקה (5-30 MPa), מתח בשבירה (200%-1500%) ומודול אלסטי (1-20 MPa)¹⁴.
9. לבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנות סטטיסטיות וגרפיות. בטא נתונים כממוצע ± סטיית תקן. לנתח ולהשוות הבדלים חד משתנים בין מספר קבוצות באמצעות מבחן הפוסט הוק של טוקי ב-ANOVA חד-כיווני. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

2. זריעת מקרופאגים על גבי שתלים וסקולריים

הערה: ודא שכל הפתרונות והחומרים סטריליים. בצע את כל הפעולות בחדר תרבית התאים.

1. תרבית RAW264.7 (מקרופאג מונוציטים של עכבר) בצלוחיות בתנאים דביקים (איור 1A). הכן את מדיום תרבית התאים באמצעות מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי. מניחים את הצלוחיות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% פחמן דו חמצני.
2. אוספים מקרופאגים באמצעות מגרד תאים. השליכו את המדיום בעזרת פיפטה של 1 מ"ל ושטפו את התאים עם PBS.
   1. מוסיפים 2 מ"ל מדיום טרי לבקבוק התרבות ומגרדים בעדינות את פני השטח בעזרת מגרד תאים. העבירו את התאים שנאספו לצינור ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש 5 × 10⁶ תאים ב -100 מיקרוליטר של מדיום שלם.
3. הנח שתל כלי דם PCL (באורך 1 ס"מ) בצינור של 15 מ"ל מלא ב-DMEM וצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 5 דקות. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שהשתל שוקע לתחתית הצינור, מה שמבטיח חדירה מלאה של החומר באמצעות DMEM.
4. מכינים צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ מרופדת בשכבת נייר פילטר. הנח את שתל כלי הדם PCL הרטוב על נייר הסינון וגלגל אותו כדי להסיר עודפי מדיום.
5. קח 10 מיקרוליטר מתרחיף התא באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר והזריק אותו לקצה אחד של שתל כלי הדם. סובב את שתל כלי הדם מעל נייר הסינון כדי להקל על פיזור אחיד של המתלה. יש להזריק כל קצה חמש פעמים ובסך הכל עשר זריקות (איור 1B,C).
6. הנח את שתל כלי הדם העמוס במקרופאגים בצלחת של 24 בארות המכילה 1 מ"ל של מדיום שלם ודגר למשך שעתיים בחממת תרבית תאים לפני ההשתלה.
7. קבע את התפלגות התאים בתוך דופן השתל. הטמע את שתל כלי הדם הטעון במקרופאגים בתרכובת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) להקפאה. צביעת גרעיני תאים עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) והתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. מודל השתלת עורק הצוואר של עכבר

הערה: שמור על אזור כירורגי סטרילי להליכים בבעלי חיים. יש לעקר את כל המכשירים והכלים החד-פעמיים לפני הניתוח.

1. בחר שלושה עכברי C57BL/6 זכרים בריאים, כל אחד במשקל 25-30 גרם. צמו את העכברים יום לפני הניתוח. השתלת שתל כלי דם אחד בכל בעל חיים, בסך הכל שלושה שתלים.
2. בנו אזיקים מצינור ניילון (איור 2A) והציגו את התרשים הסכמטי של טכניקת שרוול כלי הדם באיור 2B.
3. להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל בריכוז של 50 מ"ג/ק"ג (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אשר הרדמה יעילה על ידי הקפדה על הרפיית שרירים ואפילו נשימה. מרחו משחת עיניים וזלין על העיניים כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.
4. מקם את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים והסר את שיער הצוואר. עקר את אזור הניתוח ביודופור. כסו את האזור הלא ניתוחי בגזה סטרילית כדי לשמור על סביבה סטרילית (איור 3A).
5. השתמש במספריים עיניים כדי לבצע חתך בקו האמצע (אורך 1.5-2 ס"מ) מהלסת התחתונה לעצם החזה. הרם את בלוטות הרוק השמאליות וכרת את שריר הקלידומסטואיד השמאלי כדי להגדיל את שדה הראייה הכירורגי. חשפו את עורק הצוואר המשותף השמאלי באמצעות מיקרו פינצטה (איור 3B).
6. בודדו את עורק הצוואר השמאלי באמצעות מיקרו-מלקחיים (איור 3C).
7. קשרו את עורק הצוואר בשני מיקומים בחלק האמצעי באמצעות תפר 9-0. חצו את העורק בין שתי הקשרים באמצעות מספריים. העבירו את השרוול דרך העורקים בכל קצה ואבטחו את העורק ואת השרוול יחד באמצעות קליפסים עורקיים (איור 3D).
8. סובב את העורק כלפי חוץ כדי לכסות את גוף השרוול ולהדק אותו לשרוול באמצעות תפר 9-0 עם מיקרו-מלקחיים (איור 3E).
9. השתל שתל כלי דם בין שני הקצוות של עורק הצוואר על ידי החלקת קצות השתל מעל שרוול העורק ואבטחתם עם תפרים 9-0 (איור 3F).
   הערה: הנתונים הממדיים של השרוול, עורק הצוואר ושתל כלי הדם מוצגים בטבלה 3. למרות שקוטר השתל והשרוול תואמים מאוד לאלה של עורקי הצוואר של העכבר, קיימת אי התאמה בין קוטר הלומן האנסטומוטי לקוטר השתל. קוטר הלומן האנטומוטי מחושב על ידי הפחתת פי שניים מעובי דופן עורק הצוואר (0.1 מ"מ) מהקוטר הפנימי של השרוול (0.5 מ"מ), וכתוצאה מכך קוטר לומן של 0.3 מ"מ. לשתל כלי הדם קוטר פנימי של 0.7 מ"מ, מה שמוביל לאי התאמה של כ -2.3 פעמים (0.7 מ"מ / 0.3 מ"מ = 2.3).
10. הסר את תפסי העורקים בשני הקצוות והשקה את מקום ההשתלה במי מלח. העריכו את הסבלנות של שתל כלי הדם על ידי התבוננות בפעימה העורקית הדיסטלית (איור 3G).
11. מקם מחדש את בלוטת הרוק השמאלית וסגור את אתר הניתוח באמצעות 6-0 תפרים (איור 3H).

4. טיפול וניתוח לאחר ההליך

1. העבירו את העכבר לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ועקבו באופן רציף אחר הסימנים החיוניים שלו עד שיחזור להכרה.
2. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קרבינול לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
3. עקוב אחר העכבר במהלך תקופת ההתאוששות ואל תחזיר אותו לדיור קבוצתי עד שהוא התאושש לחלוטין.
4. להרדים את העכברים חודש לאחר ההשתלה ולקצור את דגימות השתל של כלי הדם לניתוח היסטולוגי⁹.
5. בצע המתת חסד באמצעות חנק CO₂ ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות אתיות.

שתלים וסקולריים בקוטר קטן עם פרמטרים שונים הוכנו בהצלחה באמצעות אלקטרו-ספינינג. תמונות SEM חשפו כי הסיבים היו מפוזרים באופן אחיד והציגו סידור לא סדיר בתוך דופן השתל, עם נוכחות של מבני נקבוביות (איור 4). ככל שריכוז ה-PCL גדל, גם קוטר הסיבים וגם גודל הנקבוביות גדלו. ערכים ספציפיים עבור כל קבוצת השתלות כלי דם מוצגים בטבלה 2. תוצאות הבדיקות המכניות הראו כי כל השתלים בכלי הדם עומדים בתקנים המכניים הנדרשים. העומס והמתח המקסימליים בעת השבירה גדלו עם ריכוזי PCL גבוהים יותר ועובי דופן כלי הדם גדול יותר (איור 5A-C), בעוד שמודול האלסטיות ירד (איור 5D). על סמך ממצאים אלה, שתלים וסקולריים בקוטר קטן עם ריכוז PCL של 15% ועובי דופן של 150 מיקרומטר נבחרו כשתלים האופטימליים לניסויים הבאים.

במחקר זה, מקרופאגים נזרעו על שתלים וסקולריים בשיטת ספיחת הזלוף. ניתוח SEM אישר כי מקרופאגים נזרעו בהצלחה על שתלי כלי הדם והראו פיזור אחיד (איור 6A). שתלי חתך שעברו צביעת DAPI גילו שהמקרופאגים הזרעים חדרו מלומן השתל לדופן השתל (איור 6B).

שלושים יום לאחר ההשתלה in vivo , שיעור ההישרדות של בעלי החיים היה 100%, ושניים מתוך שלושת השתלי כלי הדם שהושתלו נותרו פטנטים, מה שהיווה תוצאה משביעת רצון במודלים של עכברים. לא נצפו מפרצת או אנקפסולציה סיבית ניכרת של השתלים תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 7A). היקף החדירה התאית והתחדשות הרקמות הוערך עוד יותר באמצעות ניתוח היסטולוגי. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) חשפה חדירה תאית משמעותית בתוך דופן השתל והיווצרות רקמות בתוך הלומן הפנימי של השתל (איור 7B). צביעה אימונופלואורסצנטית CD31 הדגימה התחדשות של שכבה אחת של רקמת אנדותל בתוך הלומן הפנימי של השתלים, עם כיסוי תאי אנדותל שלם יחסית (איור 7C).

איור 1: הליך זריעת תאים. (A) תרבית של תאי RAW264.7. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (B) סכמטי של תהליך זריעת התאים. (C) תאי RAW264.7 שנזרעו על דופן השתל בשיטת ספיחה פרפוזיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טכניקת שרוול. (A) הכנת אזיקים לכלי הדם. (B) ייצוג סכמטי של טכניקת שרוול כלי הדם. שתלי כלי דם הושתלו בעורק הצוואר בשיטה זו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הליך כירורגי להשתלת שתל כלי דם במודל עכבר. (A) הזרקת חומרי הרדמה, מיקום העכבר במצב שכיבה וקיבוע הכפות. (ב) חשיפת אזור הניתוח. (ג) בידוד של עורק הצוואר. (D) מיקום השרוול סביב עורק הצוואר. (ה) היפוך העורק מעל גוף השרוול וקיבוע באמצעות תפר 9-0. (F) שרוול של שתל כלי הדם מעל השרוול העורקי ותפירה. (ז) הסרת מהדקי כלי דם. (ח) סגירת עור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מורפולוגיה של שתלי כלי דם פוליקפרולקטון (PCL). תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מייצג (SEM) המדגימות את המבנה הסיבי המוגדר היטב של שתלי כלי הדם. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר (תמונות מוגדלות). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מאפיינים מכניים של שתלי כלי דם PCL אלקטרו-ספוניים. אפיון מכני של שתלי כלי הדם בכיוון האורך, המראה עומס מרבי (A), מתח מרבי (B), מתח בשבירה (C) ומודול אלסטי (D). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD) (n = 3). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן הפוסט הוק של Tukey. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: אפיון שתלים טעוני תאים. (A) תמונות SEM מייצגות וצביעה (B) 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) של שתלי כלי דם טעונים בתאים, המראים השתלת מקרופאגים מוצלחת ופיזור אחיד. פסי קנה מידה: 30 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ניתוח היסטולוגי של שתלי כלי דם שהושתלו חודש לאחר ההשתלה. (A) תמונה סטריאוסקופית שלא מראה היווצרות מפרצת או אנקפסולציה סיבית. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B) צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) המדגימה תאית טובה והתחדשות רקמות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (C) צביעה אימונופלואורסצנטית CD31 החושפת שכבה אחת של תאי אנדותל על פני השטח הלומינלי. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תיאור קבוצות השתלות כלי הדם. PCL, פוליקפרולקטון.

טבלה 2: פרמטרים מבניים של שתלי כלי דם שונים.

טבלה 3: נתונים ממדיים של השרוול, עורק הצוואר ושתל כלי הדם.

השימוש בטכניקת השרוול להשתלת שתלי כלי דם מהונדסים רקמות בעורק הצוואר של העכבר מייצג התקדמות משמעותית במחקר הלב וכלי הדם¹⁵. השלבים הקריטיים של טכניקה זו כוללים זריעת תאים והשתלת שתלים. מחקר זה השתמש בגישת ספיחת זלוף כדי לשפר את צפיפות הזריעה של מקרופאגים כדי לטפל בבעיות הקשורות לזריעת תאים לא אחידה וכדאיות תאים נמוכה. שיטה זו אפשרה למקרופאגים לחדור לדופן השתל של כלי הדם ולהפיץ אותו באופן שווה.

בכל הנוגע להשתלת כלי דם, טכניקת השרוול, בניגוד לאנסטומוזה מקצה לקצה¹⁶, עשויה להיות קשורה לשכיחות גבוהה יותר של היצרות, במיוחד כאשר היא מיושמת על כלי דם בקוטר קטן יותר. כדי למזער השפעה זו, נבחרו אזיקים בקוטר פנימי וחיצוני התואמים מאוד לאלה של עורקי הצוואר של העכבר. המידות הרלוונטיות מופיעות בטבלה 3.

טכניקה זו מאפשרת הליך כירורגי פשוט יותר להשתלת שתל כלי דם בעורק הצוואר של העכבר. המודלים של בעלי החיים ששימשו לרוב במחקרים קודמים של שתלי כלי דם בקוטר קטן כוללים את הפיסטולה העורקית הצווארית של הכבשים ואת דגמי השתלת עורק הבטן של חולדה^17,18. מודלים אלה יעילים להערכת החוזק המכני ויכולת שיפוץ הרקמות של שתלים בכלי הדם; עם זאת, הם מוגבלים ביכולתם להבהיר את המנגנונים הבסיסיים. עכברים מהונדסים גנטית התגלו כמודל חשוב לחקר מנגנוני התחדשות כלי הדם, תוך התייחסות למגבלות של מודלים אחרים של בעלי חיים.

לדוגמה, עכברי נוקאאוט של אפוליפופרוטאין E (ApoE) מפתחים באופן ספונטני היפרכולסטרולמיה ונגעים טרשת עורקים¹⁹, מה שהופך אותם למודל רב ערך להדמיית מצבים קליניים הדורשים השתלת כלי דם. הערכת סבלנות והתחדשות כלי הדם בעכברי ApoE-knockout מספקת נתוני התייחסות חשובים לתרגום הקליני של שתלי כלי דם. בנוסף, ניתן להשתמש בעכברים חסרי גנים כדי לחקור את תפקידם של גנים מרכזיים בהתחדשות כלי הדם. סינתאז תחמוצת החנקן האנדותל (eNOS), מווסת קריטי של תפקוד כלי הדם, הוא מקור עיקרי לתחמוצת החנקן²⁰. עכברים חסרי גן eNOS משמשים כמודל מחקר להבהרת המנגנונים שבאמצעותם גן זה משפיע על עיצוב מחדש של כלי הדם. יתר על כן, ניתן לחקור את מקורם של תאים המעורבים בהתחדשות רקמות כלי הדם באמצעות תיוג תאים in vivo ומעקב אחר שושלת באמצעות עכברי כלי גן מדווחים^21,22.

לטכניקה זו מגבלות מסוימות הנוגעות למספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש ומשך ההשתלה. המחקר הנוכחי התמקד בעיקר בהערכת ההיתכנות של שיטת השתלה זו באמצעות גישת in vivo לטווח קצר. מחקרים עתידיים צריכים להגדיל את גודל המדגם ולבצע הערכות ארוכות טווח כדי להעריך באופן מקיף את ההשפעה של שיטה זו על היווצרות מפרצת, סבלנות והיפרפלזיה אינטימית.

בנוסף, שיעור הסבלנות של השתל היה 66.6%, אשר עשוי להיות מושפע מחוסר התאמה בקוטר (פי 2.3) באתר האנסטומוזיס. חוסר התאמה זה יכול להוביל להפרעות מקומיות בזרימת הדם, מה שמגביר את הסיכון לפקקת. נדרשים מחקרים נוספים כדי לייעל את עיצוב השרוול כדי להפחית את פערי הקוטר ולחקור את השפעותיהם על שיעורי הסבלנות.

לסיכום, מודל השתלת עורק הצוואר של העכבר המבוסס על טכניקת השרוול מספק מודל בעלי חיים פשוט ויעיל להערכה ביולוגית של שתלי כלי דם בקוטר קטן. יתר על כן, הוא מאפשר לחקור את תפקידיהם של סוגי תאים שונים בעיצוב מחדש של רקמות כלי הדם ואת מנגנוני ההתחדשות הבסיסיים.

למחברים אין אינטרסים כלכליים מנוגדים.

המימון למחקר זה ניתן על ידי פרויקטים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 32101098, 32071356 ו-82272158) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (מס' 2022-I2M-1-023).