פיתוח מודלים של עכברים למחלת מנטריה

המחקר הנוכחי מדגים כי עכברי MT-TGFα מציגים מטפלזיה מבטאת פוליפפטיד עוויתית (SPEM) בקיבה. הזלזול של האמרגן מנע את ההוכחה ששושלות התאים העיקריות קשורות ל-SPEM. לפיכך, פיתחנו בנוסף מודל עכבר המושרה על ידי דוקסיציקלין (Doxi-TGFα) ואישרנו כי SPEM נגזר מתאים ראשיים.

מחלת מנטריה (MD) היא מחלת קיבה טרום ממאירה נרכשת נדירה המאופיינת בקפלי רוגל ענקיים, ירידה בהפרשת חומצה ואובדן חלבון. חולי MD מראים ביטוי מוגבר של ליגנד קולטן EGF (EGFR), המשנה גורם גדילה-α (TGFα) בקיבה. הנוגדן המנטרל EGFR, cetuximab, מביא לשיפור קליני מהיר ולהפוגה היסטולוגית. מעבר לממצאים אלה, האטיולוגיה והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסם אינם מובנים היטב. קו העכברים הטרנסגניים Metallothionein (MT)-TGFα הוא מודל העכבר הראשון של MD המסכם מאפיינים היסטופתולוגיים של MD, כולל היפרפלזיה פובאולרית ואובדן תאים פריאטליים. במודל עכבר זה, TGFα מונע על ידי משפר/מקדם MT המעורר מתכת כבדה. מחקרים קודמים השתמשו באבץ גופרתי (ZnSO4) במי שתייה או בהזרקות תוך-צפקיות של קדמיום גופרתי (CdSO4) כדי לגרום ל-TGFα. עם זאת, מצאנו שעכברי MT-TGFα מפתחים פנוטיפים ללא טיפול במתכות כבדות, מה שמעיד על דליפה של המקדם. מצאנו גם שביטוי יתר של TGFα מדכא את ביטוי Mist1, גורם שעתוק חשוב להתמיינות תאים ראשיים, ובכך מעכב מניפולציה גנטית בתאים ראשיים באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2. כדי להתגבר על כך, פיתחנו מודל עכבר מעורר (Doxi-TGFα) שבו TGFα מושרה על ידי טיפול בדוקסיציקלין (CMV-rtTA; TetO-TGFα). למרות שמודל העכבר Doxi-TGFα מפתח פנוטיפים מתונים יותר ממודל MT-TGFα, הוא סיכם מאפיינים של MD, כולל היפרפלזיה פובאולרית ואובדן תאים קודקודיים. באמצעות מודל העכבר Doxi-TGFα, מצאנו כי מטאפלזיה המבטאת פוליפפטיד עוויתית (SPEM) מושרה ב-MD, ו-SPEM נגזר מהתאים הראשיים על ידי מעקב אחר שושלת באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2. שני דגמי העכברים MT-TGFα ו-Doxi-TGFα מציעים מודלים in vivo של MD והם שימושיים לחקירת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פתוגנזה של MD ואפשרויות הטיפול במחלה. עכברי Doxi-TGFα יהוו גם מודל שימושי לחקר ההשפעות של ביטוי יתר של TGFα ברקמות אחרות.

מחלת מנטרייה (MD), הידועה גם בשם גסטרופתיה היפרטרופית מאבדת חלבון, היא מצב טרום ממאיר נדיר בקיבה. הקיבה של חולי MD מציגה היפרפלזיה פובאולרית מסיבית, מה שמוביל להפרשת ריר קיבה מוגברת, וירידה במספר התאים הקודקודיים, מה שמוביל לירידה בהפרשת חומצת הקיבה. בנוסף, חלבון הולך לאיבוד באופן סלקטיבי על פני רירית הקיבה, מה שמוביל להיפואלבומינמיה ובצקת היקפית ^1,2,3. הפתוגנזה של MD לא הייתה ידועה עד שדווח כי עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה TGFα תחת שליטת משפר/מקדם הגן מטלותיונין (MT) סיכמו את הפנוטיפים של MD בקיבה ^4,5. קיבה של חולי MD הראתה גם ביטוי מוגבר של TGFα, ליגנד קולטן EGF (EGFR). Cetuximab, נוגדן נגד EGFR, דווח כטיפול הרפואי היעיל הראשון ל-MD, שאישר כי הפעלת EGFR על ידי ביטוי יתר של TGFα תורמת לפתוגנזה של MD ^6,7.

מאז, קו העכבר MT-TGFα שימש כמודל עכבר עבור MD. מכיוון שביטוי TGFα מווסת על ידי גן תגובת המתכות הכבדות, משפר/מקדם מטאלותיונין, אבץ גופרתי (ZnSO4) במי שתייה או הזרקות תוך-צפקיות של קדמיום גופרתי (CdSO4) שימשו כדי לגרום לביטוי TGFα ^5,8. מודל העכבר MT-TGFα אופיין עוד יותר עבור הפנוטיפים של MD. באמצעות מודל עכבר זה, הוכח כי TGFα גורם להתמיינות תאי פובאולרים על פני השטח המפרישים מוצין בעוד שהוא מעכב התמיינות לתאים פריאטליים המפרישים חומצה ולשושלות תאים ראשיים המפרישים פפסינוגן ^9,10. כמו כן, הוכח כי גוף הקיבה/רירית הפונדיקה הופכת לאנטרלית וכי תאים חיוביים לפקטור 2 (TFF2) נמצאים בבסיס בלוטות הקיבה, מה שמרמז על מטאפלזיה המבטאת פוליפפטיד עוויתית (SPEM) מתרחשת ב-MD ^8,11.

במחקר הנוכחי, אנו מראים שעכברי MT-TGFα מפתחים תכונות של MD ללא טיפול במתכות כבדות. פנוטיפים אלה כוללים אובדן ביטוי Mist1, גורם שעתוק החיוני להתמיינות תאים ראשיים ואובד ב-SPEM. עקב אובדן Mist1, לא ניתן היה להשתמש בקו העכברים Mist1-CreERT2¹² יחד עם קו העכבר MT-TGFα כדי לבחון אם SPEM ב-MD נובע מתאים ראשיים על ידי מעקב אחר שושלת. במטרה להתגבר על הדליפה של מודל העכבר MT-TGFα, פיתחנו דגם חדש של עכבר MD (CMV-rtTA¹³; TetO-TGFα¹⁴) כאשר TGFα מושרה על ידי טיפול בדוקסיציקלין (Doxi-TGFα). אישרנו שדגם עכבר זה מציג גם תכונות של MD. באמצעות מודל העכבר Doxi-TGFα, אנו מראים ש-SPEM נובע מתאים ראשיים על ידי מעקב אחר שושלת באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2. אנו מציגים שני מודלים של עכברי MD במחקר הנוכחי. ניתן להשתמש בשני המודלים כדי לחקור פתוגנזה ולחפש מטרות טיפוליות פוטנציאליות. העכבר החדש Doxi-TGFα יהיה בעל ערך במיוחד כאשר יש צורך בשליטה מדויקת על התחלת פנוטיפים של MD או כאשר נדרש שינוי גנטי בתאים ראשיים באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2.

כל גידול בעלי חיים והנהלים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ייל ובהתאם לעקרונות ממשלת ארה"ב לניצול וטיפול בבעלי חיים המשמשים במחקר, הוראה וניסוי.

1. ניסויים בעכברים

1. טיפולי עכברים
   1. טפל בעכברי MT-TGFα (זכרים ונקבות בגילאי 2-4 חודשים) עם 25 מ"מ ZnSO4 במי שתייה למשך שבועיים כדי לגרום לביטוי יתר של TGFα.
   2. לטפל ב-CMV-rtTA/+; עכברי TetO-TGFα/+ (Doxi-TGFα) (זכרים ונקבות בגילאי 2-4 חודשים) עם 2 מ"ג/מ"ל דוקסיציקלין במי שתייה למשך שבועיים כדי לגרום לביטוי יתר של TGFα.
   3. הוסף Mist1-CreERT2/+ אחד; R26-LSL-mTmG/+ עכבר זכר או נקבה ולהוסיף עכבר Doxi-TGFα אחד מהמין השני בכלוב הרבייה למעקב אחר שושלת של תאים ראשיים במודלים של עכברי MD.
   4. להזריק Mist1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+; CMV-rtTA/+; עכברי TetO-TGFα/+ (זכרים ונקבות בגילאי 2-4 חודשים) עם טמוקסיפן (37.5 מ"ג/ק"ג) תוך צפקית. יש להזריק במשך 7 ימים רצופים, לסירוגין בין הרבעים התחתונים הימניים והשמאליים של הבטן ולהימנע מפגיעה באיברים פנימיים. לגרום לביטוי TGFα על ידי טיפול בדוקסיציקלין (2 מ"ג/מ"ל) במי שתייה למשך שבועיים.
      הערה: בדוק אם אין פגיעה הנגרמת על ידי טמוקסיפן בקיבה^15,16, כפי שנעשה כאן על ידי ספירת התאים הקודקודיים בעכברים מסוג בר עם ובלי טיפול בטמוקסיפן (איור משלים 1).
2. קיבוע רקמת קיבה
   1. המתת חסד של עכברים על ידי מנת יתר של איזופלורן לאחר שבועיים של ביטוי יתר של TGFα. בעזרת צנצנת ייבוש במכסה אדים כימי, הניחו עכברים על פלטפורמה מחוררת המונעת מגע ישיר עם חומר ההרדמה הנוזלי. סגור את המכסה ופקח על העכברים עד שהם חסרי נשימה במשך יותר מ -60 שניות, ואחריהם נקע צוואר הרחם.
   2. חתכו את הקיבה על ידי חיתוך בצומת מערכת העיכול, חיתוך התריסריון עם תריסריון בקוטר 5 מ"מ שמחובר לקיבה, והסרת כל הרצועות הצפק סביב הקיבה באמצעות מספריים ומלקחיים (איור 1A).
   3. יש להחדיר תמיסת מלח עם פוספט (PBS) באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם קצה פיפטה המחובר לצד התריסריון. סחטו אותו בעזרת האצבעות כדי להסיר תוכן לומינלי. חזור על הפעולה 3x (איור 1B).
   4. נפחו את הקיבה ב-2 מ"ל של פורמלין 10% באמצעות מזרק נוסף של 10 מ"ל עם קצה פיפטה מחובר. מהדקים בחוזקה עם מלקחיים בצומת מערכת העיכול במשך 5-10 שניות תוך הסרת הקצה מהקיבה (איור 1C).
   5. טבלו את הקיבה המנופחת בפורמלין 10% למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם טלטול (איור 1D).
      זהירות: השתמש בציוד מגן מתאים בעת עבודה עם חומרים רעילים כגון פורמלין.
3. הכנת קיבה להטמעת פרפין
   1. חתכו את התריסריון ואת הבטן הקדמית באמצעות סכין גילוח (איור 1E). שטפו את רקמת הקיבה עם PBS למשך 5 דקות, 3 פעמים בניעור.
   2. חותכים את הבטן ל 3-4 טבעות בעובי זהה (3-5 מ"מ) בעזרת סכין גילוח. הטמיעו את טבעות הקיבה ב-2% אגרוז כדי לשמור על התמצאות. מקמו את טבעות הקיבה ברצף מהפרוקסימלי לדיסטלי על ידי מיקום הצד העקמומי, באותו הכיוון (איור 1F).
   3. הנח את טבעות הקיבה המוטבעות באגרוזים בקלטת רקמות (איור 1G) ושלח את הדגימות למתקן הליבה ההיסטולוגי להטמעת פרפין¹⁷.

2. צביעה אימונו-פלואורסצנטית

1. הכנת שקופיות
   1. מחממים שקופיות עם חלקי פרפין עליהן בתנור יבש או על גוש חום המוגדר ל -60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות עד לילה. מניחים להתקרר לטמפרטורת החדר ומניחים ברשת.
2. דה-פראפיניזציה, החזרת נוזלים ואחזור אנטיגן
   1. סמן שתי צנצנות שקופיות, A ו-B, ומלא כל אחת בתמיסת Trilogy מספקת כדי לטבול רקמות במלואן.
   2. מניחים את מתלה השקופיות בצנצנת A ומכניסים את שתי הצנצנות לסיר לחץ. הגדר את סיר הלחץ ללחץ גבוה למשך 15 דקות. הניחו לסיר הלחץ להתקרר לפני פתיחה ואחזור שקופיות.
   3. הנח מיד את מתלה השקופיות מצנצנת A לצנצנת B למשך 2 דקות כדי להבטיח שהפרפין יוסר מהשקופיות. הסר את השקופיות מצנצנת B והנח אותן במים נטולי יונים (DI).
      הערה: ניתן למלא את Jar A בטרילוגיה שהייתה פעם בשימוש. טרילוגיה חדשה תמיד צריכה לשמש בצנצנת ב'.
   4. הנח שקופיות במי מלח Tris-buffered (TBS) למשך 5 דקות לפני שתמשיך לחסימה.
3. חסימת כתמי רקע לא ספציפיים
   1. הסר שקופיות ממתלה השקופיות והקש עליהן לצדדים כדי להסיר TBS עודפים.
   2. צייר קופסה סביב הרקמה באמצעות טוש הידרופובי. יש למרוח את המאגר החוסם כדי לכסות את הרקמה במלואה ולדגור למשך 30-60 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר.
4. דגירה עם נוגדנים ראשוניים
   1. בחר נוגדנים ראשוניים של חלבוני מטרה הגדלים במינים מארחים שונים ודלל בדילול נוגדנים בהתאם להמלצת היצרן. במחקר זה נעשה שימוש בנוגדנים הבאים: H⁺/K⁺-ATPase, GIF, Mist1^18,19 ו-CD44v9^20,21. מידע מפורט על הנוגדנים העיקריים ניתן למצוא בטבלת החומרים.
   2. הסר את המאגר החוסם, החל נוגדנים מדוללים והנח את המגלשות בחזרה בתא הלח. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. הסר נוגדנים ראשוניים ושטוף שקופיות 3 פעמים ב-TBS למשך 5 דקות לכל שטיפה.
5. נוגדנים משניים ולקטינים
   1. בחר נוגדנים משניים בהתאם למין המארח של הנוגדנים הראשוניים. ניתן לערבב לקטינים עם נוגדנים משניים ולמרוח בו זמנית.
   2. יש לדלל את הנוגדנים והלקטינים המשניים בהתאם להמלצות היצרן בדילול נוגדנים. מידע מפורט על נוגדנים ולקטינים משניים המשמשים במחקר זה ניתן למצוא בטבלת החומרים.
   3. יש למרוח נוגדנים משניים, לקטינים ו-DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) ולהחזיר את השקופיות לתא הלח. יש לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר הרחק מאור.
   4. הסר שקופיות מהתא הלח ושטוף 3 פעמים עם TBS למשך 5 דקות לכל שטיפה.
6. הרכבה והכנת מיקרוסקופיה
   1. הסר שקופית מה-TBS והסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על המגלשה הצידה על מגבת נייר.
   2. הוסף 15-20 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה. החזק כיסוי נקי בקצוות והנח קצה אחד מול הרקמה עם אמצעי ההרכבה ביניהם.
   3. הורד לאט את הכיסוי כך שהמדיום יתפזר באופן שווה על הרקמה, היזהר להימנע מלכידת בועות.
   4. השתמש במגבון משימה כדי לספוג אמצעי הרכבה מוגזם סביב הקצוות. יבש את השקופית המוגמרת בחושך בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך למיקרוסקופיה. חזור על תהליך זה עבור השקופיות הנותרות.

עכברים בוגרים מסוג בר (WT) ועכברי MT-TGFα קיבלו אבץ גופרתי (25 מ"מ ZnSO4) במי השתייה במשך שבועיים לפני ההקרבה. הבטן של עכברי WT נראתה נורמלית, גסה והיסטולוגית. בניגוד ניכר, הקיבה של MT-TGFα הייתה מעובה באופן גס (איור 2A). מבחינה מיקרוסקופית, קיבות אלה הראו היפרפלזיה פובאולרית מסיבית עם אובדן של תאים קודקודיים וראשיים (איור 2B-D), מה שמסכם את המאפיינים ההיסטולוגיים של מחלת Ménétrier (MD). אובדן תאים ראשיים יכול להתרחש בשתי דרכים שונות: מוות של תאים ראשיים או מטאפלזיה המבטאת פוליפפטיד עוויתית (SPEM) הנובעת מתאים ראשיים. כדי להבחין בין שתי האפשרויות הללו, ביצענו מעקב שושלת של תאים ראשיים על ידי הכלאה של Mist1-CreERT2; עכברי R26-LSL-mTmG עם עכברי MT-TGFα. עכברים אלה טופלו תחילה בטמוקסיפן במינון נמוך (37.5 מ"ג/ק"ג תוך צפקי במשך 7 ימים רצופים) כדי לסמן תאים ראשיים עם GFP ולאחר מכן עם ZnSO4 במי השתייה כדי לגרום לביטוי יתר של TGFα. צפינו בתאים נדירים עם תווית GFP בעכברי MT-TGFα (נתונים לא מוצגים). בנוסף, לא היו הבדלים גסים והיסטולוגיים בעכברי MT-TGFα בנוכחות או בהיעדר ZnSO4  (איור 3A-C). הסבר אפשרי אחד לממצא זה היה ש-TGFα עשוי להפחית את הביטוי של Mist1, גורם שעתוק חיוני לתאים ראשיים¹⁸, ולערער את התועלת של האלל Mist1-CreERT2. למעשה, צביעה אימונוהיסטוכימית עבור Mist1 אבדה בעכברי MT-TGFα ללא טיפול ב-ZnSO4 (איור 3D).

כדי להתגבר על הדליפה של מודל העכבר MT-TGFα, פנינו למודל טרנסגני Doxi-TGFa המושרה על ידי דוקסיציקלין. זה הושג על ידי הכלאה של עכברי TetO-TGFα¹⁴ לקו עכבר CMV-rtTA¹³; דווח בעבר כי rtTA מתבטא בקיבה. אישרנו ששבועיים של טיפול בדוקסיציקלין גורמים להיפרפלזיה פובאולרית וירידה במספר התאים הקודקודיים והראשיים במודל עכבר MD החדש הזה (איור 4A-C). בהשוואה למאפיינים היסטומורפולוגיים בעכברי MT-TGFα, עכברי Doxi-TGFα הראו עובי רירי פחות חמור והיפרפלזיה פובאולרית כמו גם פחות ירידה בתאים הקודקודיים (איור משלים 2). אף על פי כן, הצלחנו לאתר עקבות של תאים ראשיים באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2 ואישרנו ששושלות תאים ראשיות מסומנות גם ב-GSII ו-CD44v9^20,21, מה שמאשר שביטוי יתר של TGFα גורם ל-SPEM מהתאים הראשיים (איור 4D).

המחקר הנוכחי מראה כי מודל העכבר MT-TGFα מעתיק את המאפיינים ההיסטופתולוגיים של MD בהיעדר טיפול במתכות כבדות, ככל הנראה בשל הדליפה הפנימית של המקדם/משפר ו/או חוסר היכולת להימנע מחשיפה למתכות כבדות (איור 3 ואיור משלים 2). מכיוון ש-TGFα מדכא ביטוי Mist1, לא ניתן להשתמש בקו העכבר Mist1-CreERT2 במודל העכבר MT-TGFα. יצרנו מודל עכבר MD חדש שבו ניתן לגרום לביטוי TGFα על ידי טיפול בדוקסיציקלין. באמצעות מודל העכבר החדש הזה של Doxi-TGFα MD, הצלחנו לאשר שביטוי יתר של TGFα גורם ל-SPEM שמקורו בתאים ראשיים. מודל העכבר Doxi-TGFα MD יהיה שימושי כאשר יש צורך בשליטה מדויקת בביטוי TGFα וגם כאשר נדרש שינוי גנטי בתאים הראשיים באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2.

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים זמינים כקבצים משלימים.

איור 1: זרימת עבודה עבור קיבוע והכנה של הטבעה של רקמת קיבה. (A) לנתח את הקיבה יחד עם מקטע קצר (3-5 מ"מ) של התריסריון. (B) הסירו את תכולת הלומינל על ידי החדרת PBS מהתריסריון באמצעות מזרק עם קצה פיפטה וסחיטתו באצבעות פי 3. (C) נפחו את הקיבה בפורמלין מהתריסריון באמצעות מזרק וצבטו את צומת התריסריון כדי לשמור על הפורמלין. (D) טבלו את הקיבה בפורמלין וקבעו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור. (E) הסירו את הקיבה הקדמית ואת התריסריון בעזרת סכין גילוח ושטפו עם PBS. (F) חתכו את גוף הקיבה ואת האנטרום ל-3-4 טבעות באופן חתך והטמיעו אותם ב-2% אגרוז כדי לשמור על הכיוון של טבעות רקמת הקיבה. (G) הניחו את הרקמה המוטבעת באגרוז בקלטות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פנוטיפים ברוטו ומיקרוסקופיים של עכברי MT-TGFα שטופלו במתכת כבדה ZnSO4. (A) דופן הקיבה עבה יותר בעכברי MT-TGFα (מימין) בהשוואה לעכברי הביקורת (משמאל). (B) קיבה של עכברי MT-TGFα (מימין) מראה היפרפלזיה פובאולרית מסיבית ואובדן של תאים פריאטליים. ראשי חץ צהובים מציינים תאים קודקודיים, וראשי חץ ירוקים מציינים תאים פובאולרים. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (C) צביעה אימונו-פלואורסצנטית מאשרת כי קיבת העכבר MT-TGFα (מימין) מראה מספר מוגבר של תאים פובאולרים (חיובי UEA1) ותאי SPEM (GIF ו-GSII חיוביים כפולים) וירידה במספר התאים הקודקודיים (H⁺/K⁺-ATPase חיובי) ותאים ראשיים (GIF יחיד חיובי) בהשוואה לקיבה של עכבר ביקורת (משמאל). פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (D) כימות של סוגי תאי אפיתל שונים ועובי רירי בעכברים מסוג בר (WT) שטופלו ב-ZnSO4 (n = 5) ועכברי MT-TGFα עם ZnSO4 (n = 3). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: עכברי MT-TGFα מפתחים פנוטיפים בקיבה ללא טיפול במתכות כבדות. (A) קיבה של עכברי MT-TGFα (מימין) מראה היפרפלזיה פובאולרית מסיבית ואובדן של תאים קודקודיים ללא טיפול במתכות כבדות. ראשי חץ צהובים מציינים תאים קודקודיים, וראשי חץ ירוקים מציינים תאים פובאולרים. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (B) צביעה אימונו-פלואורסצנטית מאשרת שקיבה של עכבר MT-TGFα (מימין) ללא טיפול במתכות כבדות מראה מספר מוגבר של תאים פובאולרים (חיובי UEA1) ותאי SPEM (GIF ו-GSII חיוביים כפולים), וירידה במספר התאים הקודקודיים (H⁺/K⁺-ATPase חיובי) ותאים ראשיים (GIF יחיד חיובי) בהשוואה לקיבה של עכבר ביקורת (משמאל). פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (C) כימות של סוגי תאי אפיתל שונים ועובי רירי בעכברי WT ללא ZnSO4 (n = 5) ועכברי MT-TGFα ZnSO4 (n = 3). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (***p < 0.001, ****p < 0.0001). (D) קיבה של עכברי MT-TGFα (מימין) מראה אובדן ביטוי של Mist1, שמתבטא באופן נורמלי בתאים הראשיים (משמאל). GSII הוא סמן לתאי צוואר ריריים. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מודל עכבר TGFα המושרה על ידי דוקסיציקלין (Doxi-TGFα) מסכם את הפנוטיפים של מחלת Ménétrier, והיווצרות SPEM מאושרת במודל עכבר זה. (A) קיבה מ-CMV-rtTA; עכברי TetO-TGFα (Doxi-TGFα; מימין) מראים היפרפלזיה פובאולרית מסיבית וירידה במספר התאים הקודקודיים. ראשי חץ צהובים מציינים תאים קודקודיים, וראשי חץ ירוקים מציינים תאים פובאולרים. פסי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. (B) צביעה אימונו-פלואורסצנטית מאשרת שקיבה של עכבר Doxi-TGFα (מימין) מראה מספר מוגבר של תאי פובאולרים (חיובי UEA1) ותאי SPEM (GIF ו-GSII חיוביים כפולים), וירידה במספר התאים הקודקודיים (H⁺/K⁺-ATPase חיובי) ותאים ראשיים (GIF יחיד חיובי) בהשוואה לקיבה של עכבר ביקורת (משמאל). פסי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. (C) כימות של סוגי תאי אפיתל שונים ועובי רירי בעכברי WT (n = 5) ועכברי Doxi-TGFα (n = 5). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). (D) מעקב אחר שושלת של תאים ראשיים (GFP חיובי) באמצעות Mist1-CreERT2; קו העכברים R26-LSL-mTmG מגלה שתאים חיוביים ל-GFP חיוביים גם ל-GSII ו-CD44v9 בקיבת העכבר Doxi-TGFα, מה שמאשר היווצרות SPEM שמקורה בתאים ראשיים בעוד שקיבה בקרה (משמאל) מראה שכמעט ואין תאים חיוביים ל-GFP חיוביים גם ל-GSII או CD44v9. פסי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: טיפול בטמוקסיפן במינון נמוך (TMX) אינו גורם לפגיעה ברירית הקיבה. שבעה ימים רצופים של טיפול TMX במינון נמוך (37.5 מ"ג/ק"ג) אינם גורמים לפגיעה ברירית הקיבה, המודגמת על ידי שמירה על מספר התאים הקודקודיים. (A) תמונות מייצגות של H&E ללא טיפול TMX (פאנל שמאלי) ועם טיפול TMX (פאנל ימני). פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. (B) כימות מספר התאים הקודקודיים ליחידת קיבה בעכברי WT (n = 5) ו- WT עם טיפול TMX (n = 5). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: השוואה בין פנוטיפים בין מודלים שונים של עכברים עם מחלת מנטרייה (MD). (A) MT-TGFα עם טיפול ב-ZnSO4, MT-TGFα ללא טיפול ב-ZnSO4 ומודלים של עכברי Doxi-TGFα MD מראים היפרפלזיה פובאולרית, אובדן תאים פריאטליים ועיקריים, עלייה בתאי מטאפלזיה המבטאים פוליפפטידים (SPEM) (תאים מבטאים GIF ו-GSII), ורירית מעובה. אין הבדלים פנוטיפיים בין MT-TGFα עם ובלי קבוצות טיפול ב-ZnSO4. מודל העכבר Doxi-TGFα מציג פנוטיפים פחות חמורים ממודל העכבר MT-TGFα. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

מחלת מנטריה (MD) היא הפרעת קיבה טרום ממאירה נדירה הנגרמת על ידי ביטוי יתר של TGFα ^1,2,3. עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה TGFα תחת שליטת משפר/מקדם הגנים מטלותיונין (MT-TGFα) היו מודל העכבר היחיד ל-MD עד כה ^4,5. מכיוון שהגן Metallothionein מגיב למתכות כבדות, מוסיפים אבץ גופרתי למי השתייה, או מוזרק קדמיום גופרתי כדי לגרום ל-TGFα במודל עכבר זה ^5,8. אחד הפנוטיפים האופייניים ב- MD הוא החלפת תאים ראשיים בבסיס בלוטות הקיבה בתאים ריריים החיוביים לסמנים הקיימים הן בתאי צוואר ריריים והן בתאי מוצין אנטרליים. זה יכול להתרחש על ידי מוות של תאים ראשיים או תכנות מחדש של תאים ראשיים למטאפלזיה המבטאת פוליפפטידים עוויתית (SPEM)^8,11. ניתן לבדוק זאת על ידי מעקב אחר שושלת של תאים ראשיים במודל עכבר MD. ניסינו לעקוב אחר התאים הראשיים באמצעות Mist1-CreERT2; עכברי R26-LSL-mTmG שבהם תאים ראשיים חיוביים ל-Mist1 מסומנים עם GFP ממוקד ממברנה. עם זאת, צפינו רק במספר מוגבל של תאים עם תווית GFP בעכברי MT-TGFα. זה מצביע על כך שרוב התאים הראשיים המסומנים ב-GFP מתו עקב ביטוי יתר של TGFα או שהיעילות של תיוג GFP בתאים הראשיים הייתה נמוכה מדי. מכיוון שדווח כי לא הייתה עלייה במוות תאים על ידי ביטוי יתר של TGFα⁸, בחנו את האפשרות של אובדן ביטוי Mist1 על ידי הערכת עכברי MT-TGFα ללא טיפול במתכות כבדות. הופתענו מהפנוטיפים המלאים בעכברי MT-TGFα ללא טיפול במתכות כבדות, כולל היפרפלזיה פובאולרית ואובדן תאים קודקודיים וראשיים. אישרנו גם שביטוי Mist1 אובד בעכברי MT-TGFα גם ללא טיפול במתכות כבדות. בעבר דווח כי ביטוי TGFα לא נשלט בקפדנות בעכברי MT-TGFα עקב חוסר יכולת למנוע חשיפה למתכות כבדות; עם זאת, ביטוי TGFα גדל באופן משמעותי על ידי טיפול במתכות כבדות⁸. הערכה פנוטיפית מקיפה לא נעשתה בעבר בעכברי MT-TGFα ללא טיפול במתכות כבדות. המחקר הנוכחי מראה שעכברי MT-TGFα מפתחים ביטוי פנוטיפי מלא ללא טיפול במתכות כבדות.

מכיוון שביטוי Mist1 אבד בעכברי MT-TGFα עוד לפני הטיפול במתכות כבדות, נותר צורך במודל עכבר אחר שבו ביטוי TGFα נשלט באופן ספציפי כך שפנוטיפים אינם מתפתחים ללא אינדוקציה של ביטוי יתר של TGFα. יצרנו מודל עכבר MD חדש שבו ביטוי TGFα מושרה על ידי טיפול בדוקסיציקלין (Doxi-TGFα). אישרנו שמודל עכבר זה גורם להיפרפלזיה פובאולרית ואובדן תאים קודקודיים וראשיים, שהם הפנוטיפים העיקריים של MD. הצלחנו לעקוב אחר תאים ראשיים באמצעות Mist1-CreERT2; עכברי R26-LSL-mTmG במודל עכבר זה ומצאו כמה תאים המסומנים ב-GFP סומנו גם ב-GSII ו-CD44v9, מה שמאשר ש-SPEM מתרחש במודל עכבר MD חדשני זה. זהו הדיווח הראשון המאשר ש-SPEM מתפתח בקיבה עם ביטוי יתר של TGFα. SPEM הוא מצב קיבה טרום ממאיר שכיח יותר, וזו עשויה להיות הסיבה לעלייה בסרטן הקיבה בחולי MD^22,23.

אזהרה אחת של שימוש בקו העכברים Mist1-CreERT2 היא שדווח כי Mist1 יכול להתבטא גם בתאי גזע בקיבה²⁴. מצאנו כי מינון נמוך (37.5 מ"ג/ק"ג) של טיפול בטמוקסיפן גורם להפעלת Cre, ליתר דיוק בתאים הראשיים, עם הפעלה מינימלית באזור האיסטמוס גם בנקודות זמן מוקדמות יותר לפני הטיפול בדוקסיציקלין. ממצאים דומים דווחו בעבר²⁵. מעקב אחר שושלת באמצעות Mist1-CreERT2; עכברי R26-LSL-mTmG מראים תאים חיוביים ל-GFP ליד GFP וסמן SPEM (GSII ו-CD44v9) תאים חיוביים כפולים ממוקמים בעיקר בבסיס שבו נמצאים התאים הראשיים (איור 4C). אם עקבו אחר התאים החיוביים הכפולים של סמן GFP ו-SPEM מתאי הגזע, היו צריכים להיות יותר תאים חיוביים ל-GFP לכיוון המצר שבו נמצאים תאי הגזע. לחלופין, ניתן להשתמש בעכבר GIF-rtTA בהשראת דוקסיציקלין קו²⁶ או קו עכבר GPR30-rtTA²⁷ יחד עם עכברי MT-TGFα לשינויים גנטיים או מעקב אחר שושלת של התאים הראשיים. עם זאת, תאים חיוביים ל-GIF יורדים בעכברי MT-TGFα ללא טיפול ב-ZnSO4 (איור 3B,C), ותאים חיוביים ל-GPR30 הולכים לאיבוד ב-SPEM, מה שמתרחש בעכברי MT-TGFα ללא טיפול ב-ZnSO4. לכן, הם יהיו פחות יעילים בהשוואה לעכברי Doxi-TGFα שחוצים עם קו העכבר Mist1-CreERT2.

המחקר הנוכחי מראה כי עכברי MT-TGFα מפתחים שינויים פנוטיפיים מלאים בקיבה ללא טיפול במתכות כבדות. אנו מראים גם שאחד הפנוטיפים הוא אובדן ביטוי Mist1 וזה מונע את השימוש ב-Mist1-CreERT2; קו עכבר R26-LSL-mTmG לשושלת עקבות תאים ראשיים. יצרנו מודל עכבר MD חדשני, Doxi-TGFα, ואישרנו לראשונה ש-SPEM מתפתח ב-MD באמצעות מודל עכבר זה. מודל עכבר MD חדשני זה יהיה שימושי כאשר יש צורך בשליטה מדויקת על התפתחות פנוטיפים של MD וכאשר יש צורך בשינויים גנטיים בתאים הראשיים באמצעות קו העכבר Mist1-CreERT2. פנוטיפים של MD מושרים על ידי הפעלת איתות EGFR על ידי ביטוי יתר של TGFα. עם זאת, לא ידוע על הפעלת EGFR שבה סוגי תאים אחראים לפנוטיפים שנצפו. באמצעות מודל העכבר Doxi-TGFα, אנו חוקרים כעת את תפקיד איתות ה-EGFR בסוגי תאים שונים, כולל תאים ראשיים המשתמשים בקו העכברים Mist1-CreERT2.

לכל המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (K08 DK124686 ל-WJH). אנו מודים לג'ינה דלה פורטה ולשרה א. גלאס על עריכת כתב היד.

תרומת המחבר:
TTG ביצעה ניסויים, יצרה דמויות, כתבה את כתב היד וערכה את כתב היד. JDP ביצע ניסויים, יצר דמויות, כתב את כתב היד וערך את כתב היד. SKM סיפקה את קו העכבר TetO-TGFα וערכה את כתב היד. RJC הגה ניסויים וערך את כתב היד. WJH הגה ניסויים, ביצע ניסויים, פירש נתונים, חיפש בספרות, כתב את כתב היד וערך את כתב היד.