ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

זחלי דג הזברה הם מערכת מודל מבטיחה של בעלי חוליות לחקר המנגנונים העצביים של ההתנהגות. השקיפות והמעגלים העצביים הפשוטים יחסית שלהם מקלים על השימוש בטכניקות אופטוגנטיות בניתוחי התנהגות תאיים. אינדיקטורים פלואורסצנטיים של פעילות עצבית in vivo , כגון GCaMP6s, היו בשימוש נרחב כדי לחקור את הפעילות העצבית הקשורה להתנהגויות פשוטות בדג זברה זחל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי פעילות הנגרמת על ידי חושים בזחלי דג זברה מרוסנים למחצה באמצעות הקו הטרנסגני Tg (elav3:GCaMP6s). בפרט, אנו משתמשים בחומר הכימי אליל איזותיוציאנט כדי לגרום לתגובה פלואורסצנטית חזקה וניתנת לשחזור באזור במוח בגבול המוח האחורי וחוט השדרה. אנו דנים בשימושים הפוטנציאליים של GCaMP6s לניטור אופטי של פעילות עצבית במהלך מגוון פרדיגמות התנהגותיות ובמגבלות של טכניקה זו. הפרוטוקול שלנו מתאר גישה נגישה לניטור פעילות עצבית דינמית הקשורה להתנהגות in vivo במוח דג הזברה הזחל.

דג הזברה מייצג מודל של בעלי חוליות עם יכולת משיכה לחקירות נוירוביולוגיות תאיות-מולקולריות מפורטות. לדג הזברה הזחל יש ~100,000 נוירונים ב-5 ימים לאחר ההפריה (DPF), הרבה פחות ממוחות של יונקים. יתר על כן, דגי הזברה שקופים יחסית, תכונה המאפשרת מחקרים אופטיים של מבנה ותפקוד עצבי 1,2,3,4,5. מספר כלים אופטוגנטיים פותחו לשימוש בדגי זברה, כולל מחווני סידן בנאמנות גבוהה⁶, חיישני מתח ^7,8 וסמנים תלויי פעילות של פעילות עצבית 9,10,11,12,13. כלים אלה משלימים יתרונות אחרים שיש למודל זה, כגון התאמה לשינויים גנטיים 14,15,16,17 והמוכנות שבה זחלי דג הזברה סופגים כימיקלים הקיימים בתמיסות רחצה 18,19,20,21.

מגוון שיטות שימושיות לפיזיולוגיה אופטית של דג הזברה, במיוחד שני פוטונים, יריעת אור ומיקרוסקופיה קונפוקלית. כל אחת מהטכנולוגיות הללו חייבת לאזן בין שתי בעיות קשורות של רזולוציה: גישה אופטית, כולל פיזור אור על ידי הרקמה הסובבת, ומהירות הדגימה, במיוחד ללכידת קינטיקה פוטנציאלית לפעולה בקנה מידה של תת-אלפית שנייה²². חלו שיפורים דרמטיים בהדמיית סידן in vivo באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני, אך שיטה זו מוגבלת לרוב לשדה ראייה של <1 מ"מ², ובדרך כלל, ניתן לרכוש רק מישור עומק אחד, ובכך להגביל את לכידת הפעילות על פני אזורים גדולים של מעגלים עצביים²². עבור מיקרוסקופ גיליון אור, הפוטנציאל לתעד את הפעילות של כמעט כל הנוירונים במוח פותר את מגבלת שדה הראייה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית, אך מהירויות המצלמה הנוכחיות מגבילות פיזית את הלכידה לכשלושה נפחי מוח לשנייה ב-40 מטוסים לנפח מוח בדג הזברה הזחלי ^1,23. מיקרוסקופיה קונפוקלית נחותה הן ברזולוציית העומק והן במהירות הלכידה ממיקרוסקופיה של שני פוטונים וגיליונות אור. למיקרוסקופיה קונפוקלית יש את היתרונות של נגישות נרחבת למעבדות ברחבי העולם והיכולת להשיג שחזורים מוחיים שלמים של פעילות עצבית באמצעות מדווחים על פעילות עצבית, כגון cFos ו-p-ERK⁹. יתר על כן, אם אזורי מוח קטנים ממוקדים, המיקרוסקופ הקונפוקלי יכול לספק רזולוציה זמנית נאותה של פעילות עצבית.

המאמר הנוכחי מתאר שיטה המשתמשת במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לתעד פעילות עצבית בדגי זברה טרנסגניים המבטאים GCaMP6s באופן פאן-עצבי. מספר פרוטוקולים דומים המשתמשים בזחלי דג הזברה פותחו כדי להבין את תפקודם של מסלולים עצביים 24,25,26,27,28,29. מאפיינים עיקריים של כמה מהפרוטוקולים הללו, כגון הדמיית זמן-lapse, אינדיקטורים פלואורסצנטיים של דינמיקת סידן והדמיה חיה, שולבו כדי למדוד פעילות עצבית באוכלוסייה קטנה של נוירונים במערכת העצבים המרכזית של דג הזברה בתגובה לאליל איזותיוציאנט (AITC), גירוי כימי מרתיע 11,26,27,29,30,31. AITC מעורר תגובה כלל-מוחית המתמקדת באזור המוח האחורי¹¹. לאשכול אחד של נוירונים הקשורים למוח האחורי יש תפקיד בתנועה ובתגובה ממושכת ל-AITC. תגובה זו מחזיקה מעמד מעבר להסרת הגירוי המרתיע³⁰. על ידי הגבלת שדה הראייה, הצלחנו לזהות פעילות עצבית באשכול עצבי זה כפי שהיא משתקפת בשינוי הקרינה בתאי עצב המבטאים GCaMP6s. אנו מספקים טכניקות, הנחיות ושיטות עבודה מומלצות להשגת רזולוציה מרחבית-זמנית מספקת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, אנו דנים במגבלות שיטת ההקלטה האופטית שלנו. למרות מגבלות אלה, השיטה אמורה לאפשר חקירה של מגוון תופעות נוירוביולוגיות, כולל זיכרון ועיבוד סנסומוטורי.

כל ההליכים המשתמשים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה סטייט, פולרטון (פרוטוקול # 2023-1310).

1. בימוי דג זברה זחל באגרוז נקודת התכה נמוכה

1. לגדל בעלי חיים טרנסגניים בוגרים בעלי ביטוי כלל-עצבי Tg (elav3:GCaMP6s)⁶ עם שני זכרים לשתי נקבות בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים. בוגרים ממוקמים בתאי רבייה מיוחדים כך שביצים משוחררות נלכדות בתא תחתון עם תחתית מזויפת שאינה נגישה למבוגרים. באור ראשון או כאשר מסירים את מפריד ההפרדה, הנקבות משחררות ביצים, והזכרים מפרים ביצים שנלכדו בתחתית הכוזבת.
2. הסר בוגרים ואסוף ביציות מופרות באמצעות מסננת ביצים והניח בתווך עובר (E3) (5 מ"מ NaCl, 0.33 מ"מ MgSO4, 0.33 מ"מ CaCl2, 0.17 מ"מ KCl, 1 מ"מ HEPES, 0.00001% מתילן כחול, pH 7.0)³⁰ עם 14 שעות אור / 10 שעות חושך ב-28.5 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור
   הערה: למתכון E3 המשמש יש ריכוז נמוך של מתילן כחול שאינו משפיע על הקרינה או מוביל לאות פלואורסצנטי אוטומטי משמעותי. איננו דורשים שימוש ב-1-פניל 2-תיאוריאה (PTU) בגילאי ההתפתחות המפורטים בפרוטוקול בשל השקיפות הטבעית שמעניק הקו הטרנסגני GCaMP6s.
3. הר בעלי חיים 2-7 ימים לאחר ההפריה (dpf) באמצעות נקודת התכה נמוכה של 3% אגרוז מומס במדיום E3. החום הגיע לטמפרטורה שבה ניתן לתפעל את דג הזברה מבלי לפגוע באורגניזם. לפני שנקודת ההיתוך הנמוכה של האגרוז מתקררת ומתמצקת (<1 דקה), מקמו את הזחלים עם הצד הגבי כלפי מעלה בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית כך שהאזור במוח שנבדק יהיה קרוב ככל האפשר למטרה, כפי שמוצג באיור 1. בהתאם לניסוי, בדרך כלל, 8 עד 10 דגי זברה לקבוצת ניסוי מספיקים.
   הערה: בעלי חיים לא הורדמו בפרוטוקול זה.
4. לאחר שהאגרוז התייצב עם הזחל במקומו (כ -2 עד 3 דקות), הוסף 5 מ"ל של תמיסת E3. לאחר מכן, חותכים את האגרוז בעזרת אזמל כנדרש בפרוטוקול הניסוי.
   הערה: יש לחתוך חלקים שונים של האגר, תלוי אילו חלקים של דג הזברה צריכים להשתחרר מריסון ו/או לקבל סוג אחר של גירוי.
5. העבירו את צלחת הפטרי המכילה את דג הזברה לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי ואפשרו לדג להתאקלם למשך 20 דקות.

2. הגדרה והדמיה במיקרוסקופיה קונפוקלית עם יישום גירוי

1. לאחר תקופת ההתאקלמות, מרכז את הדגים מתחת ליעד הטבילה במים פי 40 (NA 1.0) בטמפרטורת החדר באמצעות שדה בהיר עם מקור אור (~475 ננומטר).
2. הגדרות רכישת מיקרוסקופ קונפוקלי יהיו תלויות באיכויות וברמת הביטוי של המולקולה הפלואורסצנטית, בעומק ובתכונות האופטיות של הרקמה, בגודל שדה הראייה ובמהירות ההקלטה. קבע הגדרות מתאימות באמצעות מחוון הטווח כדי להבטיח לכידה אופטימלית של האור הנפלט בהתאם לצרכי הניסוי.
3. ודא התאמה נכונה של עוצמת הלייזר ורווח המאסטר כדי ללכוד אור פלורסנט בטווח האופטימלי, ובכך למנוע אובדן מיותר של אות הקרינה התלוי ב-GCaMP6s. השתמש ברשימת ההגדרות והגורמים הקונפוקליים העיקריים המפורטים להלן כדי לקבוע את ההגדרות המתאימות.
   1. גודל חור סיכה: קבע זאת לפי המטרה המשמשת והגדר לקבל מישור מוקד יחיד תוך הגבלת מישורי מוקד אחרים. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בחור סיכה של 32 מיקרומטר.
   2. עוצמת לייזר ואורך גל: התאם את עוצמת הלייזר על סמך רמת הביטוי של המולקולה הפלואורסצנטית והעומק והתכונות האופטיות של הרקמה. השתמש במחוון הטווח כדי להבטיח שהלייזר אינו חורג מהטווח של גלאי הצילום. הגדר את אורך גל העירור לאורך הגל של האור שמעורר בצורה אופטימלית את המולקולה הפלואורסצנטית. לניסוי זה, מכיוון שהדגים היו הטרוזיגוטיים עבור הטרנסגן GCaMP6s ורמות הביטוי היו נמוכות, השתמשו בעוצמת לייזר של 5% באורך גל של 488 ננומטר, רווח מאסטר של 650. עם ביטוי טרנסגנים חזק, עוצמת הלייזר נעה בין 1.5% ל-3%, וזה בדרך כלל מספיק.
      הערה: אם עוצמת הלייזר מוגדרת נמוכה מדי, מידע (אור שזוהה על ידי צינור מכפיל הפוטו) יאבד. אם עוצמת הלייזר מוגדרת גבוהה מדי, האור הנפלט עלול לחרוג מטווח הגלאי או לפגוע בדגימה (פוטו-אקונומיקה).
   3. רווח מאסטר: הרווח הראשי קובע את הרגישות של גלאי הפוטו. השתמש במחוון הטווח כדי להבטיח שהרווח הראשי אינו מוגדר גבוה מדי, ובכך חורג מהטווח של גלאי הצילום. עבור ניסוי זה, הרווח הראשי מוגדר ל-650.
   4. שדה ראייה: ודא ששדה הראייה גדול מספיק כדי ללכוד את הרקמה המעניינת. זוהי מגבלה עיקרית עבור מיקרוסקופים קונפוקליים בדרך כלל מכיוון שגודל שדה הראייה יגביל את מהירות הלכידה, כפי שמוצג באיור 2. עבור הניסויים הכוללים AITC, הגדר את שדה הראייה ל-79.86 מיקרומטר².
   5. מהירות הלכידה: ככל שמהירות הלכידה גדלה, כמות האור שנלכדת על ידי גלאי הצילום תפחת. ככל שנלכד פחות אור, איכות התמונה תיפגע. ודא שמהירות הצילום מאזנת בין איכות התמונה לבין המהירות הנדרשת כדי ללכוד את האירוע הפיזיולוגי המעניין. כאן, מהירות הלכידה מוגדרת ל-1.20 f/s.
4. מרכז את שדה הראייה על אשכול עצבי זנב לקומיסורה אינפימה הלרי בחלק הרוסטרלי של חוט השדרה³⁰. אשכול זה קטן למדי ב-~2.5 dpf אך הוא גדול בהרבה בהמשך הפיתוח (7 dpf).
   הערה: אם הרכבת אגרוז בשלב 1 אינה אופטימלית, כלומר החיה ממוקמת בזווית או עמוק מדי באגרוז, איכות התמונה תושפע לרעה. תמונה של חוט השדרה של דג הזברה בחיה שממוקמת היטב ותמונה מנוגדת של חוט השדרה בדג זברה שממוקם בצורה לא אופטימלית מוצגות באיור 3.
5. בצע סריקת סדרות זמן באמצעות שדה ראייה של 79.86 מיקרומטר² ב-1.20 פריימים לשנייה (fps) עם רזולוציה מרחבית של 0.119 מיקרומטר² לפיקסל. התאם את גודל שדה הראייה ומהירות רכישת התמונה בהתאם ליישום הרצוי.
6. 2 דקות לאחר תחילת ההדמיה, הוסף 41.67 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של AITC (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר) או תמיסת E3 לצלחת עם פיפטה. המשך להקליט במשך ~30 שניות כדי לצפות בכל שינוי בפעילות GCaMP6s באזור העניין עם הדמיית זמן-lapse. לאחר השלמת ההקלטה, שחרר את החיה מהאגרוז והמתת חסד בהתאם להנחיות המוסד לטיפול בבעלי חיים.
   הערה: בזמן הקלטת פעילות GCaMP6s, האור הקונפוקלי עצמו יכול להוות גירוי. יש לקחת זאת בחשבון בניתוח תוצאות ההדמיה. זמן ההקלטה הוא פונקציה של מספר הפריימים וקצב הלכידה של כל פריים, אותו ניתן לכוונן לפי הצורך לזמן הרצוי.

3. ניתוח אות GCaMP באמצעות פיג'י

1. לאחר ההקלטה, אם הפלט אינו בפורמט קובץ .tif לניתוח FIJI במורד הזרם, ייצא את קבצי התמונה כקבצי .tif מחבילת תוכנת המיקרוסקופ.
2. הורד את פיג'י לניתוח עקבות עצביים. פתח את FIJI, ייבא את קבצי ה-.czi לתוך התוכנית, וכאשר תתבקש, השתמש בהגדרות ברירת המחדל בתוסף BioFormats.
3. הדגש אזור/נוירון מעניין באמצעות הכלים Circle או Freehand על ידי לחיצה על הסמלים המתאימים שלהם. (ריחוף מעל הסמלים יהבהב את שם הכלי בתוכנית.)
   הערה: מכיוון שאזור העניין משתנה בגודלו, אזורים / עיגולים קבועים אינם אפשריים. תוכנה המאפשרת רישום של שינויים פלואורסצנטיים לאורך זמן כ-voxels, כגון חבילת Thunder³², יכולה לאפשר זיהוי של נוירונים בודדים; עם זאת, עבור ~20 נוירונים בניסוי הנוכחי, זיהוי גבולות הממברנה על ידי צופה עיוור עשוי להיות עדיף על מערכת זיהוי אוטומטית.
4. לאחר בחירת החזר ROI, בסרגל הכלים של FIJI, לחץ על Analyze > Tools > ROI Manager. לאחר מכן, לחץ על הוסף [t], והחזר ה-ROI שנבחר יתווסף לחלון מנהל ה-ROI.
5. בתוך מנהל ההחזר על ההשקעה, לחץ על עוד > Multi Measure. השאר את ההגדרות כברירת מחדל ולחץ על אישור. פיג'י תייצר נתונים גולמיים שניתן לתפעל כקובץ CSV באמצעות Python או כנתונים גולמיים בגיליון אלקטרוני.
6. כדי לנרמל את הנתונים הגולמיים ולייצג אותם כעקבות עצביים עבור אזור עניין נתון, ממוצע את ערכי ~30 השניות האחרונים של חלון 2 הדקות לפני הגירוי, ונרמל את כל הערכים שלאחר הגירוי לערך הבסיס הממוצע הזה:
   עוצמת הקרינה המנורמלת = (פלואורסצנציה מיידית של אזור עניין נתון לאחר הגירוי)/(פלואורסצנטיות ממוצעת של ~30 שניות של מרווח של 2 דקות לפני גירוי)
7. שרטט את הנתונים כעקבות עצביים, כפי שמוצג באיור 4.
   הערה: בסוגים מסוימים של מיקרוסקופיות, כגון מיקרוסקופיה של גיליון אור, שבה נרשם נפח של המוח, חפצי תנועה מטופלים באמצעות רישום מרחבי לאחר עיבוד לנפח מוח ייחוס ^1,11. עם זאת, מכיוון שאנו מקליטים רק ממישור אחד, לא ניתן לבצע התאמות עבור חפצי תנועה. לכן, עבור התוצאות המוצגות כאן, לא הוסרו מסגרות. עם זאת, אם חפצי תנועה ישנו באופן משמעותי את התוצאות, מערכות אוטומטיות יוכלו לזהות ולתקן מסגרות עם חפצי תנועה^{1, 11}, או צופה עיוור יכול להסיר מסגרות כאלה.

מתן אליל איזותיוציאנט גורם לאות עצבי הקשור לסידן בזחל דג הזברה
מתן AITC (שלב 2.6) גורם לעלייה נרחבת בפעילות העצבית הקשורה ל-GCaMP6s על פני המוח של דג הזברה הזחל^11,30. ראינו אות פלואורסצנטי מוגבר באזור קטן במוח אחרי יישום AITC, כפי שמוצג באיור 4.

איזון הרזולוציה של אותות עצביים הקשורים לסידן, מהירות לכידה ואזור לכידה
הגדלת מהירות הלכידה מפחיתה את הרזולוציה, שיש לקחת בחשבון בתכנון ניסיוני. אנו מציגים מגוון מהירויות והרזולוציות המתאימות שלהן באמצעות עוברי דג זברה ב-~2.5 dpf באיור 5. בעת רישום פעילות עצבית, מהירות הלכידה צריכה להיות מהירה מספיק כדי לתעד את הפעילות. למרות ששינויי המתח עקב פוטנציאל פעולה הם מהירים יחסית (1-2 אלפיות השנייה), אינטראקציות סידן עם GCaMP יאריכו את משך אות פוטנציאל הפעולה. ל-GCaMP6s, המולקולה המשמשת כאן, יש קינטיקה איטית במיוחד. ניתן לזהות ולתאם פוטנציאל פעולה בודד באמצעות מולקולות GCaMP בתרבית תאים⁶, אך לא ברור אם דיוק זה של זיהוי אותות יכול להתרחש in vivo עם דג זברה זחל. עם זאת, ככל שמהירות הלכידה גבוהה יותר, כך גדל הסיכוי שמידע זמני הקשור לפעילות עצבית יילכד, בהנחה שזיהוי האותות אינו מצטמצם משמעותית על ידי מהירויות הלכידה הגבוהות יותר. יתר על כן, גודל שדה התצפית ישפיע גם על מהירויות הלכידה במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי. על ידי הפחתת שדה הראייה, אדם מגביר את מהירות הלכידה אך מאבד מידע על פעילות עצבית באזורי מוח אחרים. כדי ללכוד אותות GCaMP6, יישומים המשתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית חייבים להיות מוגבלים לאזור מוח קטן (50-150 מיקרומטר²). מהירות הלכידה צריכה להיות מהירה יותר מהאות שנצפה כדי להפחית את הכינוי. עם זאת, מהירויות הלכידה של מיקרוסקופיה קונפוקלית יגרמו בהכרח לאובדן מידע מסוים בצורה של אור נפלט. יש לקחת בחשבון תמיד את העלויות והתועלת היחסיות הללו כדי לענות על שאלת הניסוי הרצויה ביעילות.

איור 1: תיאור המיקום של דג זברה זחל מרוסן חלקית להדמיה. הזחל משובץ בנקודת התכה נמוכה וממוקם בצד הגב כלפי מעלה. חלקים רוסטרליים וזנביים של האגרוז הוסרו כדי לאפשר לעור דג הזברה להיחשף ל-AITC. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמאות לתמונות בגדלים שונים שניתן לצפות בהן במהירויות לכידה שונות. (A) גודל מסגרת = 319.45 x 319.45 מיקרומטר; מהירות לכידה = .30 פריימים לשנייה. (B) גודל מסגרת = 106.48 x 106.48 מיקרומטר; מהירות לכידה = 7.67 פריימים לשנייה. (C) גודל מסגרת = 53.24 x 53.24 מיקרומטר; מהירות לכידה = 9.80 פריימים לשנייה. דג זברה, ~2.5 dpf; סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תמונות קונפוקליות של החלק הזנבי של המוח האחורי של שני זחלי דג זברה. (A) הזחל (~2.5 dpf) ממוקם בזווית לא אידיאלית ועמוק מדי באגרוז, מה שמונע דימות חד של תאי העצב. (B) כאן, הזחל (~2.5 dpf) ממוקם כראוי ליד פני השטח של האגרוז. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: AITC מגביר את עוצמת הקרינה של תאי עצב הממוקמים בגבול המוח האחורי וחוט השדרה של מוח דג הזברה. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי עצב של דג הזברה (7 dpf) כאשר הם נחשפים ל-AITC או E3. תמונות של נוירונים לפני (A1) ואחרי (A2) יישום AITC בהשוואה ל-(B) תמונות של נוירונים לפני (B1) ואחרי (B2) יישום תמיסת הבקרה (E3). סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. עקבות של מצב פלואורסצנטי מנורמל של מספר נוירונים הממוקמים במוח האחורי של דג זברה עוברי שנחשף ל- AITC (A3) או E3 (B3). שימו לב שהנוירונים הפגינו פלואורסצנטיות מוגברת לאחר מריחת AITC על האמבטיה, בעוד שהפלואורסצנטיות המוגברת לא נצפתה בתאי העצב לאחר יישום E3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מהירות הלכידה של GCaMP6s קובעת את כמות האור שנלכדה ואת הרזולוציה המתקבלת של התמונה. (A) תמונות של תאי עצב שנלכדו כל 10.13 שניות (0.10 fps) נותנות רזולוציה גבוהה יחסית של נוירונים במוח האחורי ובחוט השדרה. עם עלייה במהירות הלכידה, מתקבל מידע זמני, אך הרזולוציה המרחבית הולכת לאיבוד: (B) מהירות לכידה = 0.79 fps, (C) מהירות לכידה = 3.16 fps, ו-(D) מהירות לכידה = 7.67 fps. דג זברה, 2 dpf; סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

הראינו שניתן לרשום פעילות עצבית במוחם של זחלי דג הזברה באמצעות GCaMP6s יחד עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; ניתן לפצות על מהירויות הלכידה הנמוכות יותר הנדרשות עקב הקינטיקה האיטית יותר של GCaMPs על ידי הפחתת אזור המוח שנצפה⁶. מדווחים עם דינמיקה זמנית מהירה יותר (כלומר, GCaMP6f) זמינים, אך הרזולוציה הזמנית המעולה באה בדרך כלל במחיר של אות פלואורסצנטי מופחת⁶. המיקרוסקופ הקונפוקלי מוגבל למהירויות הקלטה איטיות יחסית²², ולכן יש לבחור מולקולות מדווחות תוך התחשבות במגבלות הזמן של מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הפרוטוקול מוגבל על ידי שני מאפיינים עיקריים: 1) הדרישה למקם את החיה באגרוז במהלך ההקלטה ו-2) מהירות הלכידה האיטית יחסית של מיקרוסקופיה קונפוקלית. איזון שדה הראייה ומהירויות הלכידה הוא המפתח ללכידת פעילות עצבית ברזולוציה מספקת עבור יישום נתון. אם הפעילות הנגרמת על ידי AITC נחתכת או פוחתת, זה יכול להצביע על כך שייתכן שדג הזברה הזחל לא יוכל לזהות את הגירוי או שה-AITC עשוי להיות לא חזק מספיק. במקרה האחרון, רענון הציר ושמירתו קפואה ב-20 מעלות צלזיוס יאריך את יעילותו. אם הדג אינו יכול לזהות את הגירוי, ייתכן שהחיה הושתלה עמוק מדי באגר. שלב קריטי הוא מיקום הדג במהלך שלב 1 של הפרוטוקול, מכיוון שהוא חיוני לגישה אופטית אופטית במהלך יישום התרופה.

בשל מהירויות הסריקה האיטיות יחסית של המיקרוסקופיה הקונפוקלית, הקלטות של כל המוח אינן אפשריות מבחינה טכנית. באופן משמעותי, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש למדידת אזורים קטנים במוח לאחר זיהוי בטכניקות משלימות. בפרט, על ידי שימוש בטכניקות הממנפות מולקולות המסמנות פעילות עצבית עם מדווחים תלויי פעילות ^9,11, הנסיין יכול להתמקד בתחומי עניין מרכזיים במוח ליישום השיטות המתוארות במאמר זה. לאחר מכן ניתן להתייחס לתחומי עניין במוח לאטלס המוח המבואר של דג הזברה, z אטלס מוח¹¹.

עם התאמות קלות, ניתן להשתמש בטכניקות ובהנחיות שנדונו כאן כדי לחקור מגוון של תפקודי מוח, כולל עיבוד סנסומוטורי, למידה וזיכרון, ותחושה ותפיסה.

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ל-ACR מהמכונים הלאומיים לבריאות (SC2GM1304854) ומענק ל-DLG מהקרן הלאומית למדע (2050850).