Method Article
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.
Les larves de poisson-zèbre sont un système modèle de vertébré prometteur pour l’étude des mécanismes neuronaux du comportement. Leur translucidité et leurs circuits neuronaux relativement simples facilitent l’utilisation de techniques optogénétiques dans l’analyse cellulaire du comportement. Les indicateurs fluorescents de l’activité neuronale in vivo , tels que les GCaMP6, ont été largement utilisés pour étudier l’activité neuronale associée à des comportements simples chez les larves de poisson-zèbre. Ici, nous présentons un protocole de détection de l’activité induite par des capteurs chez des larves de poisson-zèbre semi-restreintes en utilisant la lignée transgénique Tg(elav3 :GCaMP6s). En particulier, nous utilisons l’agent chimique allyl isothiocyanate pour induire une réponse fluorescente robuste et reproductible dans une région du cerveau à la frontière du cerveau postérieur et de la moelle épinière. Nous discutons des utilisations potentielles des GCaMP6 pour la surveillance optique de l’activité neuronale au cours d’une gamme de paradigmes comportementaux et des limites de cette technique. Notre protocole décrit une approche accessible pour surveiller l’activité neuronale in vivo dynamique et liée au comportement dans le cerveau des larves de poisson-zèbre.
Le poisson-zèbre représente un modèle animal vertébré avec une traçabilité pour des études neurobiologiques cellulaires-moléculaires détaillées. Les larves de poisson-zèbre possèdent ~100 000 neurones à 5 jours après la fécondation (dpf), nettement moins que les cerveaux de mammifères. De plus, les poissons-zèbres sont relativement translucides, une propriété qui facilite les études optiques de la structure et de la fonction neuronales 1,2,3,4,5. Plusieurs outils optogénétiques ont été développés pour être utilisés chez le poisson zèbre, notamment des indicateurs de calcium haute fidélité6, des capteurs de tension 7,8 et des marqueurs dépendants de l’activité neuronale 9,10,11,12,13. Ces outils sont complémentaires à d’autres avantages possédés par ce modèle, tels que la facilité d’adaptation aux modifications génétiques 14,15,16,17 et la facilité avec laquelle les larves de poisson-zèbre absorbent les produits chimiques présents dans les solutions de bain 18,19,20,21.
Diverses méthodes sont utiles pour la physiologie optique du poisson-zèbre, en particulier la microscopie à deux photons, la microscopie à feuillet de lumière et la microscopie confocale. Chacune de ces technologies doit équilibrer deux problèmes de résolution connexes : l’accès optique, y compris la diffusion de la lumière par les tissus environnants, et la vitesse d’échantillonnage, en particulier pour capturer la cinétique du potentiel d’action à l’échelle inférieure à la milliseconde22. Des améliorations spectaculaires ont été observées dans l’imagerie calcique in vivo à l’aide de la microscopie à deux photons, mais cette méthode est souvent limitée à un champ de vision de <1mm2, et généralement, un seul plan de profondeur peut être acquis, limitant ainsi la capture de l’activité dans de grandes régions de circuits neuronaux22. Pour la microscopie à feuillet de lumière, la possibilité d’enregistrer l’activité de presque tous les neurones du cerveau résout la limitation du champ de vision de la microscopie à deux photons, mais les vitesses actuelles des caméras limitent physiquement la capture à environ trois volumes cérébraux par seconde à 40 plans par volume cérébral chez le poisson-zèbre larvaire 1,23. La microscopie confocale est inférieure en termes de résolution en profondeur et de vitesse de capture à la microscopie à deux photons et à feuillet de lumière. La microscopie confocale présente l’avantage d’être largement accessible aux laboratoires du monde entier et de pouvoir réaliser des reconstructions de l’activité neuronale sur l’ensemble du cerveau à l’aide de rapporteurs de l’activité neuronale, tels que cFos et p-ERK9. De plus, si de petites régions cérébrales sont ciblées, le microscope confocal peut fournir une résolution temporelle adéquate de l’activité neuronale.
Le présent article décrit une méthode qui utilise la microscopie confocale pour enregistrer l’activité neuronale chez le poisson-zèbre transgénique exprimant les GCaMP6 de manière panneuronale. Plusieurs protocoles similaires utilisant des larves de poisson-zèbre ont été développés pour comprendre la fonction des voies neuronales 24,25,26,27,28,29. Les principales caractéristiques de plusieurs de ces protocoles, telles que l’imagerie en accéléré, les indicateurs fluorescents de la dynamique du calcium et l’imagerie en direct, ont été combinées pour mesurer l’activité neuronale dans une petite population de neurones du système nerveux central du poisson-zèbre en réponse à l’isothiocyanate d’allyle (AITC), un irritant chimique aversif 11,26,27,29,30,31. L’AITC suscite une réponse à l’échelle du cerveau concentrée dans la zone du cerveau postérieur11. Un groupe de neurones juste caudaux au cerveau postérieur joue un rôle dans la locomotion et une réponse prolongée à l’AITC. Cette réponse dure plus longtemps que la suppression du stimulus aversif30. En restreignant le champ de vision, nous avons réussi à détecter une activité neuronale dans ce groupe neuronal comme en témoigne le changement de fluorescence dans les neurones exprimant GCaMP6s. Nous fournissons des techniques, des lignes directrices et les meilleures pratiques pour obtenir une résolution spatio-temporelle suffisante à l’aide de la microscopie confocale. De plus, nous discutons des limites de notre méthode d’enregistrement optique. Malgré ces limites, la méthode devrait permettre d’étudier une variété de phénomènes neurobiologiques, y compris la mémoire et le traitement sensorimoteur.
Toutes les procédures utilisant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care Use Committee de l’Université d’État de Californie, Fullerton (Protocole # 2023-1310).
1. Mise en scène des larves de poisson-zèbre dans l’agarose à bas point de fusion
2. Mise en place et imagerie en microscopie confocale avec application de stimulus
3. Analyse du signal GCaMP à l’aide de FIJI
L’administration d’isothiocyanate d’allyle provoque un signal neuronal associé au calcium chez les larves de poisson-zèbre
L’administration d’AITC (étape 2.6) provoque une augmentation généralisée de l’activité neuronale associée aux GCaMP6s dans le cerveau de la larve de poisson-zèbre11,30. Nous avons observé une augmentation du signal fluorescent dans une petite région du cerveau après l’application de l’AITC, comme le montre la figure 4.
Équilibrage de la résolution des signaux neuronaux associés au calcium, de la vitesse de capture et de la zone de capture
L’augmentation de la vitesse de capture réduit la résolution, qui doit être prise en compte dans la conception expérimentale. Nous présentons une variété de vitesses et leurs résolutions correspondantes en utilisant des embryons de poisson-zèbre à ~2,5 dpf dans la figure 5. Lors de l’enregistrement de l’activité neuronale, la vitesse de capture doit être suffisamment rapide pour enregistrer l’activité. Bien que les changements de tension dus à un potentiel d’action soient relativement rapides (1-2 ms), les interactions du calcium avec GCaMP prolongeront la durée du signal de potentiel d’action. GCaMP6s, la molécule utilisée ici, a une cinétique particulièrement lente. Des potentiels d’action unique utilisant des molécules de GCaMP peuvent être détectés et corrélés dans la culture cellulaire6, mais il n’est pas clair si cette précision de détection du signal pourrait se produire in vivo avec des larves de poisson-zèbre. Cependant, plus la vitesse de capture est élevée, plus il est probable que des informations temporelles liées à l’activité neuronale soient capturées, en supposant que la détection du signal n’est pas significativement réduite par les vitesses de capture plus élevées. De plus, la taille du champ d’observation influencera également les vitesses de capture avec un microscope confocal standard. En réduisant le champ de vision, on augmente la vitesse de capture mais on perd des informations sur l’activité neuronale dans d’autres zones du cerveau. Pour capturer les signaux GCaMP6, les applications utilisant la microscopie confocale doivent être limitées à une petite zone cérébrale (50-150 μm2). La vitesse de capture doit être plus rapide que le signal observé pour réduire le repliement. Cependant, les vitesses de capture de la microscopie confocale entraîneront inévitablement la perte de certaines informations sous forme de lumière émise. Ces coûts et avantages relatifs doivent toujours être pris en compte pour répondre efficacement à la question expérimentale souhaitée.
Figure 1 : Représentation de la position d’une larve de poisson-zèbre partiellement restreinte pour l’imagerie. La larve est nourrie dans une agarose à bas point de fusion et positionnée côté dorsal vers le haut. Les parties rostrale et caudale de l’agarose ont été retirées pour permettre l’exposition de la peau du poisson-zèbre à l’AITC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples d’images de différentes tailles qui peuvent être visualisées à différentes vitesses de capture. (A) Taille de l’image = 319,45 x 319,45 μm ; Vitesse de capture = 0,30 ips. (B) Taille du cadre = 106,48 x 106,48 μm ; Vitesse de capture = 7,67 ips. (C) Taille du cadre = 53,24 x 53,24 μm ; Vitesse de capture = 9,80 ips. Poisson-zèbre, ~2,5 dpf ; barre d’échelle 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Images confocales de la partie caudale du cerveau postérieur de deux larves de poisson-zèbre. (A) La larve (~2,5 dpf) est positionnée à un angle non idéal et trop profondément dans l’agarose, empêchant une imagerie nette des neurones. (B) Ici, la larve (~2,5 dpf) est correctement positionnée près de la surface de l’agarose. Barre d’échelle 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : L’AITC augmente l’intensité de fluorescence des neurones situés à la limite du cerveau du poisson zèbre et de la moelle épinière du cerveau du poisson-zèbre. (A) Images confocales représentatives des neurones du poisson-zèbre (7 dpf) lorsqu’ils sont exposés à l’AITC ou à l’E3. Images de neurones avant (A1) et après (A2) l’application de l’AITC comparées aux images (B) des neurones avant (B1) et après (B2) l’application de la solution de contrôle (E3). Barre d’échelle 10 μM. Traces de l’état fluorescent normalisé de plusieurs neurones situés dans le cerveau postérieur de poissons-zèbres embryonnaires exposés à l’AITC (A3) ou E3 (B3). Notez que les neurones ont montré une fluorescence accrue après l’application d’AITC dans le bain, alors qu’une augmentation de la fluorescence n’a pas été observée dans les neurones après l’application de E3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : La vitesse de capture des GCaMP6 détermine la quantité de lumière capturée et la résolution résultante de l’image. (A) Les images des neurones capturées toutes les 10,13 s (0,10 fps) donnent une résolution relativement élevée des neurones du cerveau postérieur et de la moelle épinière. Avec une augmentation de la vitesse de capture, des informations temporelles sont obtenues, mais la résolution spatiale est perdue : (B) vitesse de capture = 0,79 ips, (C) vitesse de capture = 3,16 ips et (D) vitesse de capture = 7,67 ips. Poisson zèbre, 2 dpf ; barre d’échelle 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Nous avons montré que l’activité neuronale peut être enregistrée dans le cerveau des larves de poisson-zèbre à l’aide de GCaMP6 associés à la microscopie confocale ; les vitesses de capture plus faibles requises en raison de la cinétique plus lente des GCaMP peuvent être compensées par la réduction de la surface cérébrale observée6. Des rapporteurs avec une dynamique temporelle plus rapide (c’est-à-dire GCaMP6f) sont disponibles, mais la résolution temporelle supérieure se fait généralement au prix d’un signal de fluorescence réduit6. Le microscope confocal est limité à des vitesses d’enregistrement relativement plus lentes22, de sorte que les molécules rapporteures doivent être sélectionnées en tenant compte des limites temporelles de la microscopie confocale.
Le protocole est limité par deux caractéristiques clés : 1) la nécessité de placer l’animal dans de l’agarose pendant l’enregistrement et 2) la vitesse de capture relativement lente de la microscopie confocale. L’équilibre entre le champ de vision et les vitesses de capture est essentiel pour capturer l’activité neuronale avec une résolution suffisante pour une application donnée. Si l’activité induite par l’AITC est tronquée ou diminuée, cela pourrait indiquer que les larves de poisson-zèbre ne sont peut-être pas en mesure de détecter le stimulus ou que l’AITC n’est peut-être pas suffisamment puissante. Dans ce dernier cas, rafraîchir le bouillon et le maintenir congelé à -20 °C prolongera son efficacité. Si le poisson ne peut pas détecter le stimulus, il se peut que l’animal ait été implanté trop profondément dans la gélose. Une étape critique est le positionnement d’un poisson au cours de l’étape 1 du protocole, car cela est crucial pour un accès optique optimal lors de l’application du médicament.
En raison des vitesses de balayage relativement lentes de la microscopie confocale, les enregistrements du cerveau entier ne sont pas techniquement possibles. De manière significative, le protocole décrit ici peut être utilisé pour mesurer de petites zones cérébrales après identification avec des techniques complémentaires. En particulier, en utilisant des techniques qui exploitent des molécules qui marquent l’activité neuronale avec des rapporteurs dépendants de l’activité 9,11, l’expérimentateur peut cibler des zones cérébrales clés d’intérêt pour l’application des méthodes décrites dans cet article. Les zones cérébrales d’intérêt peuvent ensuite être référencées à l’atlas cérébral annoté du poisson-zèbre, z brain atlas11.
Avec des ajustements mineurs, les techniques et les directives discutées ici peuvent être utilisées pour étudier une gamme de fonctions cérébrales, y compris le traitement sensorimoteur, l’apprentissage et la mémoire, ainsi que la sensation et la perception.
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Ce travail a été soutenu par une subvention à l’ACR des National Institutes of Health (SC2GM1304854) et une subvention à la DLG de la National Science Foundation (2050850).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-100 | Diluted to 3% |
Allyl Isothiocyanate (AITC) | Sigma Aldrich | 377430 | Chemical stimulant |
E3 | N/A | N/A | Water-medium for zebrafish larvae |
Glass Bottom Dishes | Thermo Fisher Scientific | 12-567-400 | Used to hold zebrafish during imaging experiments |
Micropipette (10-100 uL) | Cole-Parmer | 21600-14 | Apparatus used for creating AITC dilutions |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Used to screen for phenotype |
Mirror Finish Forceps | DUMONT | 11251-23 | Used to orient zebrafish in agarose |
myTEMP Mini Digital Incubators | Benchmark | H2200-HC | Holding area for zebrafish; set to 28.5°C |
Nitrile Gloves | MedPRIDE | MPR-50504 | Basic PPE |
Petri Dishes | VWR | 89107-632 | Container for zebrafish |
Posi-Click Tubes | DENVILLE | C-2171 | Used for AITC dilution |
Samco Polyurethane Transfer Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 225 | Apparatus used to select animal/administer diluted bolus of AITC |
Stemi SV11 Apo Microscope | Zeiss | 1.25496E+11 | Used to stage zebrafish |
Transgenic Larval Zebrafish (2 to 7 DPF) | N/A | N/A | Animal test subjects; Tg(elav3:GCaMP6s) strain |
Zeiss Confocal Microscope (Model LSM9) | Zeiss | 3523004097 | Imaging of fish |
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