Bu videoda açıklanan protokol, yayılan hücrelerin yaşam boyu görüntülenmesi ve dinamikleri yayan hücreleri tarafsız ve otomatik bir şekilde ölçen bir hesaplama aracının kullanımı için gerekli deneysel prosedürleri tanımlayacaktır. Hücre yayma varlığı, hücre yayılma sırasında hücre kenar hareketinin ve morfolojik değişikliklerin sürekli izlenmesini sağlar, bu da mevcut hücre yayılma testlerinin çoğunda eksik olan bir özelliktir. Ayrıca, bu protokol, hücre döngüselliği, alan ve yayılan hücrelerin çıkıntı geri çekme döngüleri hakkında bilgi sağlayarak otomatik bilgisayar işleme ve analizinin kullanımını uygular.
Bu tür otomatik işleme, veri analizindeki önyargıyı azaltır ve çok sayıda hücre için hücre yayma dinamiklerini analiz etmek için sağlam bir yöntem sağlar. İlaç tedavileri veya gen bilimi ve teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol hücre çıkıntılarını düzenleyen moleküler oyuncuların büyük ölçekli hızlarına açıktır. Verilen protokol için, Kullanılan hücreler, plazma zarının floresan etiketlenmesine izin veren PH-Akt-GFP'yi genetik olarak kodlayan fare embriyonik fibroblastlarıdır.
Test yayılan hücrenin başlangıcından önce, bir hücre çanağını% 90 izdiah eder. Hücreler uygun izdiah süresine ulaştıktan sonra, 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kayması alevlendir ve 35 milimetrelik bir hücre kültürü çanağı içine yerleştirin. Kapak kaymasını PBS'de seyreltilmiş fibronektin ile mililitre başına 2,5 mikrogram konsantrasyona kadar kaplayın.
Kapağı olan tabağı bir saat boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir saat sonra fibronektin, pipet ucuyla kapak kaymasına dokunmamaya dikkat ederim. Kapağın etrafına iki ila üç kez hafifçe pipetle vurarak yemeği PBS ile yıkayın.
Hücre tohumlama için, hücre kültürü medyasını hücre çanaktan aspire ederek başlayın. Daha sonra, yemeği ılık PBS ile yıkayın. Yemeğe 650 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve enzimi eşit olarak dağıtmak için kabı eğin.
Tripinli yemeği bir dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra önce bir santrifüj tüpüne 10 mililitre hücre kültürü ortamı eklemeniz gerekir. Daha sonra, tripsinleri söndürmek için yemeğe 10 mililitre daha medya ekleyin.
Kapak kayması üzerine tohumlanacak hücreleri seyreltmek için, yemeğin içeriğinin bir mililitresini santrifüj tüpüne pipetlayın. Tüpten pipet yaklaşık 500 ila 1.000 mikrolitre seyreltilmiş hücre kapak kayması ile kabın içine. Kapak kaymasının mililitre başına %10 veya 50.000 hücrede olduğundan emin olun ve seyreltilmiş hücrelerin hacmini gerektiği gibi ayarlayın.
Bu hücrelerin amacı, görüntü alımı sırasında bir odak düzlemi oluşturmaktır. Çanaktaki kalan hücrelerle, hücrelerin beşte birini tedavi başına küçük bir tabağa geçirin. Bunlar, yayılma dinamikleri için analiz edilecek hücreler olacaktır.
Pasaj tabaklarını ve kapak kayması kabını sekiz ila 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Arp2/3'ün hücre yayılımı için önemini test etmek için, önce bir kontrole ve bir tedavi santrifüj tüpüne beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra iki büyük santrifüj tüpünün her birine fenol kırmızısı olmayan 20 mililitre dmem ekleyin.
Pipet ya Arp2/3 kompleksinin inhibitörü olan CK-666 ilacı ya da küçük ve büyük tüplere DMSO gibi kontrollü tedavi. Hücrelerin farmakolojik tedavisine başlamak için, bir gecede kuluçkaya yatıran pasaj yemeklerini çıkarın. Tüm yemeklerden hücre kültürü medyasını epire edin ve bulaşıkları ılık PBS ile yıkayın.
CK-666 içeren küçük tüpleri alın veya takviyeli medyayı kontrol edin ve ilgili tüpün içeriğini pasaj yemeklerinin her birine ekleyin. Yemeklerin her birini doğru ilaç tedavisi ile etiketleyin ve ardından bulaşıkları bir saat daha inkübatöre yerleştirin Bir saatlik kuluçkadan sonra, her bir yemekten ilaç takviyeli medyayı aspire edin. Daha sonra, kalan tüm fenol kırmızı medyasını iyice çıkarmak için tüm yemeklere sıcak PBS ekleyin.
230 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve bulaşıkları bir dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Trypsinized yemekleri inkübatörden çıkarın ve B tüpü olarak belirlenmiş bir tüpe fenol kırmızısı olmayan ilaç takviyeli dmem'in beş mililitresini eklemeye devam edin.Daha sonra tripsinleri söndürmek için ilgili yemeğe aynı ortamın beş mililitresini daha ekleyin. Tüm hücreleri tabaktan ayırmak için medyayı birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.
Görüntüleme için uygun bir hücre seyreltmesi hazırlamak için çanağın tüm içeriğini tüp olarak belirlenmiş başka bir tüpe aktarın A.In A tüpünden bir mililitre hücreyi B tüpüne aktarın.Her tedavi için tüm seyreltme adımlarını tekrarlayın. Hücrelerin tripzyasyondan kurtulmasını sağlamak için tüm tüpleri 45 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. 22 ila 22 milimetrelik bir kapak fişini barındırabilen bir hücre manyetik odasının tüm parçalarının kullanımdan önce iyice temizlenmiş olduğundan emin olun.
Kabı inkübatörden kapak kayması ile çıkarın. Hücre kültürü medyasını epire edin ve kapak fişini sıcak PBS ile yıkayın. Bir çift tokmak kullanarak kapak fişini çıkarın ve kapak kaymasını yavaşça manyetik odanın alt plakasına koyun.
Sonra silikon contayı alın ve kapak fişinin üstüne yerleştirin. Manyetik odanın ana gövdesini alt plakaya takın. Manyetik odaya ilgili tedaviye karşılık gelen fenol kırmızısı olmayan dmem'in bir mililitresini ekleyin.
Tüy bırakmayan bir doku alın ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için muhafazayı ana gövde ile alt plaka arasında dikkatlice dab. Manyetik odayı tamamlamak için şeffaf kapağı ana gövdeye diri diri uzadı. Son olarak kapak fişinin altını su ile püskürtülen bir doku ve% 70 etanol ile püskürtülen bir başka mendille silin.
Konfokal mikroskobun sahne üstü inkübatörini 37 dereceye ısıtın. Manyetik odayı hedefin üstüne yerleştirin. Yayılma dinamiklerini elde etmeden önce, odağı yeşil floresan kanalındaki zaten polarize hücrelere ayarlayın.
Bu, yayılan hücrelerin kapak kaymasına tutturulurken odakta olmasını sağlar. Manyetik odanın şeffaf kapağını ve pipet 500 mikrolitreyi inkübatörden çıkarılan B tüpünden çıkarın. Şeffaf kapağı tekrar üste yerleştirin.
Hücre yayma analizi için ideal hücreleri tanımlamak için, kapak kaymasına henüz bağlanmamış veya ekin en erken aşamalarında olan hücreleri temsil eden yeşil haleler arayın. Görüntüleri alın ve dosyaları kaydedin. Hücre yaymanın görüntü alımını tamamladıktan sonra, Spyder gibi uyumlu bir Python IDE çalıştırarak başlayın.
Hücre yayma dinamiklerinin hesaplamalı analizi için, ilgili komut dosyası paketlerinde sağlanan hücre yayma GUI dosyasını bulun ve açın. Arka planda analiz GUI panelini açacak çalıştır düğmesine basın. GUI, analiz için gereken tüm ayarları barındırr.
Hücre alanını ve döngüselliği çözümlemek için, hücre yayılma alanı sekmesine edinme dosyasını ve gerekli ayarları girin. Ayarlamaların hücre türüne ve görüntü alma parametrelerine bağlı olarak yapılması gerekecektir. Çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası tüm yayılan hücreler için zaman çizimi ile karşı bir hücre döngüselliği ve alanı oluşturur.
Kimograf verileri için kimograf üreteci ve analiz sekmesine basın. Bu çözümleme, giriş dosyalarının tek hücreli görüntü yığınlarının kırpılmasını gerektirir. Tüm ayarları ekledikten ve çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası verilen hücre için birden çok kimograf oluşturur.
Solda, sağlanan komut dosyası kullanılarak otomatik olarak bölümlere ayrılmış DMSO ve CK-666 tedavilerinden temsili hücreler bulunur. Kontrol hücreleri tarafından gösterilen izotropik ve son derece dairesel morfolojinin aksine, Arp2/3 inhibe edilmiş hücreler döngüsellikte azalma gösterir. Ayrıca, otomatik olarak oluşturulan kimograflar, çıkıntıların dinamiklerini anlamak için kritik olan zamansal çözünürlük sağlar.
Kontrol hücreleri, çok az veya hiç geri çekme olmadan sürekli olarak çıkıntılır. Buna karşılık, Arp2/3 inhibisyonu, yayılma boyunca geri çekilme olaylarındaki artışın gösterdiği gibi çıkıntıların stabilitesini bozar. Bu videolar size hücrelerin nasıl düzgün bir şekilde tohumlanacağını, farmakolojik tedavilerin nasıl gerçekleştirildiğini ve hücre yayma dinamiklerinin nicelleştirilmesi için gerekli görüntüleme ve hesaplama araçlarını nasıl hazırlayacağınızı anlamanızı sağlamalıdır.
Bu protokol, hücre çıkıntılarını yöneten moleküler oyuncuları tanımlamak için sitoskeleton floresan görüntüleme ve göç tahlilleri ile daha da birleştirilebilir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
