このビデオで説明するプロトコルは、広がる細胞の実物大イメージングに必要な実験手順と、偏りのない自動化された方法でダイナミクスを広げる細胞を定量化する計算ツールの使用を定義します。細胞拡散資産は、細胞の広がりの間に細胞エッジの動きと形態変化の連続的追跡を可能にし、これはほとんどの既存の細胞拡散アッセイに欠けている特徴である。また、このプロトコルは、自動コンピュータの処理と分析の使用を実装し、細胞の円形性、領域および突出の広がりの周期に関する情報を提供します。
このような自動処理は、データ分析におけるバイアスを低減し、多数の細胞の細胞拡散ダイナミクスを分析する堅牢な方法を提供します。薬物治療や遺伝子科学および技術と組み合わせると、このプロトコルは、細胞の突起を調節する分子プレーヤーの大規模な速度に適しています。特定のプロトコルについて、使用される細胞は、移植性膜の蛍光タグ付けを可能にするPH-Akt-GFPを遺伝的にコードするマウス胚性線維芽細胞である。
細胞拡散アッセイの開始前に、細胞の1皿を90%合流まで培養する。細胞が適切な合流度を達成したら、22 x 22ミリメートルのカバースリップを炎上し、それを35ミリメートルの細胞培養皿に入れます。PBSで希釈したフィブロネクチンでカバースリップを1ミリリットル当たり2.5マイクログラムの濃度にコーティングします。
カバースリップで皿を37度のインキュベーターに1時間置きます。1時間後にフィブロネクチンを吸引し、ピペットチップでカバースリップに触れないようにする。カバースリップを2~3回軽くピペットで洗浄して、PBSで皿を洗います。
細胞の播種の場合は、まず細胞の皿から細胞培養培地を吸引することから始める。その後、温かいPBSで皿を洗います。650マイクロリットルのトリプシンEDTAを皿に加え、皿を傾けて酵素を均等に分配します。
トリプシンと一緒に皿をインキュベーターに1分間入れます。インキュベーションの後、まず遠心分離チューブに10ミリリットルの細胞培養培地を加える必要があります。次に、トリプシンを急いでクエンクするために、さらに10ミリリットルのメディアを皿に素早く加えます。
カバースリップに播種される細胞を希釈するには、皿の内容物の1ミリリットルを遠心管にピペットします。チューブから、約500〜1,000マイクロリットルの希釈された細胞をカバースリップで皿にピペット。カバースリップが1ミリリットル当たり10%のコンフルエンシーまたは50,000細胞であることを確認し、必要に応じて希釈された細胞の体積を調整します。
これらの細胞の目的は、画像取得時に焦点面を確立することにある。皿の中の残りの細胞で、治療ごとに1つの小皿に細胞の5分の1を通過させる。これらは、ダイナミクスを広げるために分析される細胞になります。
パッセージ皿とカバースリップ皿をインキュベーターに8~24時間置きます。細胞拡散のためのArp2/3の重要性をテストするために、まず5ミリリットルの細胞培養培地をコントロールおよび処理遠心管に加えます。次に、フェノールレッドを欠いている20ミリリットルのdmemを2つの大きな遠心分離管のそれぞれに加えます。
ピペットは、Arp2/3複合体の阻害剤である薬物CK-666またはDMSOなどの制御された治療法を小さくて大きな管に入れた。細胞の薬理学的治療を開始するには、一晩インキュベートしていた通路の皿を取り除きます。すべての食器から細胞培養培地を吸引し、温かいPBSで皿を洗います。
CK-666または制御補充された媒体を含む小さな管を取り、各通路の皿に関連管の内容を追加します。各皿に適切な薬物処理のラベルを付け、1時間のインキュベーションの後、さらに1時間インキュベーターに戻し、各皿から薬物補充培地を吸引します。次に、残りのフェノールレッドメディアをすべて完全に除去するために、すべての料理に温かいPBSを加えます。
230マイクロリットルのトリプシンEDTAを加え、皿を1分間インキュベーターに入れる。インキュベーターからトリプシン化された皿を取り除き、チューブBとして指定されたチューブにフェノールレッドを欠いている薬物補充されたdmemの5ミリリットルを追加し、トリプシンをクエンチするために関連する皿に同じ培地の別の5ミリリットルを追加します。皿からすべての細胞を取り外すために何度かメディアを上下にピペット。
画像処理に適した細胞希釈 A.In を調製するために、既にチューブとして指定されている別のチューブに皿のすべての内容物を移し、チューブAからチューブBに1ミリリットルの細胞を移管B.各治療のための希釈ステップのすべてを繰り返します。細胞がトリプシン化から回復できるように、すべてのチューブをインキュベーターに45分間入れます。22 x 22ミリメートルのカバースリップを収容できるセル磁気チャンバのすべての部品が、使用前に完全に洗浄されていることを確認します。
インキュベーターからカバースリップで皿を取り除きます。細胞培養培地を吸引し、カバースリップを温かいPBSで洗浄する。鉗子のペアを使用してカバースリップを取り外し、カバースリップを磁気チャンバの底板にそっと置きます。
次に、シリコーンガスケットを取り出し、カバースリップの上に置きます。磁気チャンバの本体を底板に取り付けます。磁性チャンバに関連する処理に対応するフェノールレッドを欠いているdmemの1ミリリットルを加える。
糸くずのないティッシュを取り、漏れを確認するために本体と底板の間にエンクロージャを慎重にダブる。磁気チャンバを完成させるために、透明カバーを本体に下げます。最後に、カバースリップの底部を水を吹き付けたティッシュで拭き取り、もう1つは70%エタノールを吹き付けます。
共焦点顕微鏡のステージトップインキュベーターを37度に予熱します。目的の上に磁気チャンバーを置きます。拡散ダイナミクスを取得する前に、緑色蛍光チャネル内の既に偏光した細胞に焦点を当てます。
これにより、カバースリップに取り付けると、広がる細胞が焦点を合わせられます。インキュベーターから取り外したチューブBから、磁気チャンバとピペット500マイクロリットルの透明カバーを取り外します。透明なカバーを上に戻します。
細胞拡散解析に最適な細胞を同定するために、カバースリップにまだ付着していないか、または最も早い結合段階にある細胞を表す緑色のハローを検索します。画像を取得し、ファイルを保存します。セル拡散の画像取得を完了した後、スパイダーなどの互換性のあるPython IDEを実行して開始します。
セル拡散ダイナミクスの計算解析では、関連するスクリプトパッケージに用意されているセル拡散GUIファイルを見つけて開きます。バックグラウンドで分析GUIパネルを開く実行ボタンを押します。GUI には、分析に必要なすべての設定が含まれています。
セル領域と円形を解析するには、取得ファイルと必要な設定をセルスプレッド領域タブに入力します。セルタイプと画像取得パラメータに応じて調整する必要があります。実行を押すと、スクリプトは、すべての広がるセルのセルの円形度と面積対時間プロットを作成します。
キモグラフデータの場合は、キモグラフジェネレータと解析タブを押します。この分析では、入力ファイルを単一セルのイメージ スタックをトリミングする必要があります。すべての設定を挿入し、実行を押すと、スクリプトは指定されたセルに複数のカイモグラフを作成します。
左側にはDMSOおよびCK-666処理の代表細胞があり、提供されたスクリプトを使用して自動的にセグメント化されます。コントロール細胞によって示される等方性および高度に円形の形態とは対照的に、Arp2/3阻害細胞は円形性の低下を示す。さらに、自動生成されたカイモグラフは、突起のダイナミクスを理解するために重要な時間的解像度を提供します。
コントロール細胞は、引き込みがほとんどない、または全く引き込みなしで持続的に突き出ています。これに対し、Arp2/3阻害は、拡散中の引き込みイベントの増加によって示されるように、突起の安定性を破壊する。このビデオでは、細胞を適切に播種し、薬理学的治療を行い、細胞拡散ダイナミクスの定量化に必要なイメージングおよび計算ツールを準備する方法を理解する必要があります。
このプロトコルは細胞骨格蛍光イメージングおよびマイグレーションアッセイとさらに組み合わせて、細胞突起を支配する分子プレーヤーを同定することができる。あなたの実験を見て、幸運をありがとう。
