Das in diesem Video beschriebene Protokoll definiert die experimentellen Verfahren, die für die lebensgroße Bildgebung von Streuzellen und den Einsatz eines Rechenwerkzeugs erforderlich sind, das die Ausbreitungsdynamik von Zellen unvoreingenommen und automatisiert quantifiziert. Das Zellstreuungsvermögen ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung der Zellkantenbewegung und morphologische Veränderungen während der Zellstreuung, was ein Merkmal ist, das in den meisten vorhandenen Zellstreuungstests fehlt. Darüber hinaus implementiert dieses Protokoll den Einsatz automatisierter Computerverarbeitung und -analyse und liefert Informationen über Zellzirkularität, Fläche und Vorzugsrückziehzyklen von Streuzellen.
Eine solche automatisierte Verarbeitung reduziert Verzerrungen in der Datenanalyse und bietet eine robuste Methode zur Analyse der Zellstreudynamik für eine große Anzahl von Zellen. In Kombination mit medikamentösen Behandlungen oder Genwissenschaften und -techniken ist dieses Protokoll für große Geschwindigkeiten molekularer Akteure geeignet, die Zellvorsprünge regulieren. Für das gegebene Protokoll, Die verwendeten Zellen sind Maus embryonale Fibroblasten, die PH-Akt-GFP genetisch kodieren, die für die fluoreszierende Markierung der Plasmamembran ermöglicht.
Vor dem Beginn des Zellstreuungsassays, Kultur eine Schale von Zellen zu 90%Konfluenz. Sobald die Zellen die richtige Konfluenz erreicht haben, entflammen Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckel und legen Sie ihn in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale. Beschichten Sie den Deckelschlupf mit Fibronectin, das in PBS auf eine Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurde.
Legen Sie die Schale mit dem Deckel schlupfen in einen 37-Grad-Inkubator für eine Stunde. Nach einer Stunde das Fibronectin ansaugen, um sicherzustellen, dass der Deckelrutsch nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Waschen Sie die Schale mit PBS, indem Sie sanft um die Abdeckung rutschen zwei bis drei Mal.
Für die Zellaussaat beginnen Sie mit der Ansaugung der Zellkulturmedien aus dem Teller der Zellen. Danach die Schale mit warmen PBS waschen. Fügen Sie 650 Mikroliter Trypsin EDTA in die Schale und neigen Sie die Schale, um das Enzym gleichmäßig zu verteilen.
Legen Sie das Gericht mit dem Trypsin für eine Minute in den Inkubator. Nach der Inkubation müssen Sie zunächst 10 Milliliter Zellkulturmedien in ein Zentrifugenrohr geben. Als nächstes fügen Sie schnell weitere 10 Milliliter Medien in die Schale, um das Trypsin zu löschen.
Um die Zellen, die auf den Deckel ausgesät werden, zu verdünnen, pipette einen Milliliter des Inhalts der Schale in das Zentrifugenrohr. Aus dem Rohr, Pipette etwa 500 bis 1.000 Mikroliter verdünnte Zellen in die Schale mit dem Deckel schlupf. Stellen Sie sicher, dass der Abdeckschlupf bei einer Konfluenz von 10 % oder 50 000 Zellen pro Milliliter liegt, und passen Sie das Volumen der verdünnten Zellen nach Bedarf an.
Der Zweck dieser Zellen ist es, eine Ebene des Fokus während der Bildaufnahme zu etablieren. Mit den restlichen Zellen in der Schale, geben Sie ein Fünftel der Zellen in eine kleine Schale pro Behandlung. Dies sind die Zellen, die für die Verbreitung von Dynamik analysiert werden.
Legen Sie die Durchgangsschüssel und die Deckschale acht bis 24 Stunden lang in einen Inkubator. Um die Bedeutung von Arp2/3 für die Zellstreuung zu testen, fügen Sie zunächst fünf Milliliter Zellkulturmedien in ein Kontroll- und ein Behandlungszentrifugenrohr ein. Als nächstes fügen Sie 20 Milliliter dmem, die Phenol rot fehlt in jedem der beiden größeren Zentrifugenrohre fehlt.
Pipette entweder das Medikament CK-666, das ein Inhibitor des Arp2/3-Komplexes ist, oder die kontrollierte Behandlung wie DMSO in die kleinen und großen Schläuche. Um mit der pharmakologischen Behandlung der Zellen zu beginnen, entfernen Sie die Durchgangsgerichte, die über Nacht inkubiert wurden. Aspirieren Sie die Zellkulturmedien aus allen Gerichten und waschen Sie das Geschirr mit warmen PBS.
Nehmen Sie die kleinen Röhren, die entweder CK-666 enthalten oder zusätzliche Medien steuern, und fügen Sie den Inhalt der entsprechenden Röhre in jedes der Durchgangsgeschirre ein. Etikettieren Sie jedes der Gerichte mit der richtigen medikamentösen Behandlung und legen Sie die Gerichte dann wieder in den Brutkasten für eine zusätzliche Stunde Nach einer Stunde Inkubation, aspirieren Sie das Medikament ergänzt Medien von jedem der Gerichte. Als nächstes fügen Sie warme PBS zu allen Gerichten hinzu, um alle verbleibenden phenolroten Medien gründlich zu entfernen.
Fügen Sie 230 Mikroliter Trypsin EDTA hinzu und legen Sie das Geschirr für eine Minute in einen Brutkasten. Entfernen Sie die trypsinisierten Gerichte aus dem Inkubator und fahren Sie fort, fünf Milliliter des Medikaments ergänzt dmem, die Phenol rot in eine Röhre als Tube B bezeichnet fehlt hinzufügen. Dann fügen Sie weitere fünf Milliliter des gleichen Mediums in die entsprechende Schale, um das Trypsin zu löschen. Pipette die Medien auf und ab mehrmals, um alle Zellen von der Schale zu lösen.
Übertragen Sie den gesamten Inhalt der Schale in ein anderes Rohr, das bereits als Rohr bezeichnet wurde, A.In um eine zellgebende Zellverdünnung vorzubereiten, einen Milliliter Zellen aus Tube A in Tube B zu übertragen. Wiederholen Sie alle Verdünnungsschritte für jede Behandlung. Legen Sie alle Röhren für 45 Minuten in den Inkubator, damit sich die Zellen von der Trypsinisierung erholen können. Stellen Sie sicher, dass alle Teile einer Zellmagnetkammer, die einen 22 mal 22 Millimeter großen Abdeckschlupf aufnehmen kann, vor dem Gebrauch gründlich gereinigt wurden.
Entfernen Sie die Schale mit dem Deckelschlupf aus dem Inkubator. Die Zellkulturmedien ansaugen und den Deckelschlupf mit warmen PBS waschen. Entfernen Sie den Deckelschlupf mit einem Zangenpaar und legen Sie den Deckelschlupf vorsichtig auf die Bodenplatte der Magnetkammer.
Als nächstes nehmen Sie die Silikondichtung auf und legen Sie sie auf den Deckelschlupf. Befestigen Sie den Hauptkörper der Magnetkammer an der Bodenplatte. Fügen Sie einen Milliliter des dmem fehlt Phenolrot entsprechend der entsprechenden Behandlung der Magnetkammer.
Nehmen Sie ein fusselfreies Gewebe und tupferen Sie sorgfältig das Gehäuse zwischen dem Hauptkörper und der Bodenplatte, um auf Leckagen zu überprüfen. Um die magnetische Kammer zu vervollständigen, senken Sie die transparente Abdeckung auf den Hauptkörper. Wischen Sie schließlich den Boden des Deckels mit einem mit Wasser besprühten Gewebe und einem weiteren mit 70% Ethanol besprühten Gewebe ab.
Den Bühnen-Top-Inkubator eines konfokalen Mikroskops auf 37 Grad vorheizen. Platzieren Sie die magnetische Kammer auf dem Objektiv. Bevor Sie die Ausbreitungsdynamik erfassen, richten Sie den Fokus auf die bereits polarisierten Zellen im grünen Fluoreszenzkanal.
Dadurch wird sichergestellt, dass die Streuzellen im Fokus stehen, sobald sie sich am Deckbedeckungsschlupf anheften. Entfernen Sie die transparente Abdeckung der Magnetkammer und Pipette 500 Mikroliter aus Rohr B, das aus dem Inkubator entfernt wurde. Legen Sie die transparente Abdeckung wieder oben.
Um Zellen zu identifizieren, die ideal für die Zellstreuanalyse sind, suchen Sie nach grünen Halos, die Zellen darstellen, die sich noch nicht an den Deckbedeckungsbeleg anheften müssen oder sich in den frühesten Phasen der Befestigung befinden. Erfassen Sie Bilder und speichern Sie die Dateien. Nachdem Sie die Bildaufnahme der Zellverteilung abgeschlossen haben, führen Sie zunächst eine kompatible Python-IDE wie Spyder aus.
Für die Berechnungderanalyse der Zellstreudynamik, suchen und öffnen Sie die in den entsprechenden Skriptpaketen bereitgestellte GUI-Datei zum Verteilen von Zellen. Drücken Sie die Run-Taste, die das Analyse-GUI-Bedienfeld im Hintergrund öffnet. Die GUI enthält alle Einstellungen, die für die Analyse erforderlich sind.
Um den Zellbereich und die Zirkularität zu analysieren, geben Sie die Erfassungsdatei und die erforderlichen Einstellungen auf der Registerkarte Zellstreubereich ein. Je nach Zelltyp und Bildaufnahmeparametern müssen Anpassungen vorgenommen werden. Nach dem Drücken der Ausführung erstellt das Skript eine Zellzirkularität und ein Flächendiagramm im Vergleich zum Zeitdiagramm für alle sich ausbreitenden Zellen.
Für Kymographendaten drücken Sie den Kymographengenerator und die Registerkarte Analyse. Für diese Analyse müssen Eingabedateien zugeschnittene Einzelzellen-Bildstapel werden. Nach dem Einfügen aller Einstellungen und der Ausführung summiert sich das Skript mit mehreren Kymographen für die angegebene Zelle.
Auf der linken Seite befinden sich repräsentative Zellen der DMSO- und CK-666-Behandlungen, die automatisch mit dem bereitgestellten Skript segmentiert werden. Im Gegensatz zur isotropen und hochkreisförmigen Morphologie, die von Kontrollzellen nachgewiesen wird, weisen Arp2/3-hemmende Zellen eine verminderte Zirkularität auf. Darüber hinaus bieten die automatisch generierten Kymographen eine zeitliche Auflösung, die für das Verständnis der Dynamik von Vorsprüngen entscheidend ist.
Kontrollzellen ragen hartnäckig und ohne bis gar keine Rückzüge hervor. Im Gegensatz dazu stört die Arp2/3-Hemmung die Stabilität der Vorsprünge, wie die Zunahme der Rückzugsereignisse während der gesamten Ausbreitung zeigt. Diese Videos sollen Ihnen das Verständnis dafür vermitteln, wie Sie Zellen richtig aussät, pharmakologische Behandlungen durchführen und bildgebende und computergestützte Werkzeuge vorbereiten können, die für die Quantifizierung der Zellausbreitungsdynamik erforderlich sind.
Dieses Protokoll kann weiter mit zytoskelett-fluoreszierenden Bildgebungs- und Migrationstests kombiniert werden, um die molekularen Akteure zu identifizieren, die Zellvorsprünge bestimmen. Vielen Dank für Das Zuschauen und viel Glück mit Ihren Experimenten.
