이 비디오에 설명된 프로토콜은 확산 세포의 실물 크기 이미징및 분산되는 세포가 편견없고 자동화된 방식으로 역학을 전파하는 것을 정량화하는 계산 도구의 사용에 필요한 실험 적 절차를 정의합니다. 세포 확산 자산은 세포 확산 시 세포 가장자리 이동 및 형태학적 변화를 지속적으로 추적할 수 있으며, 이는 대부분의 기존 세포 확산 작용에서 누락된 기능입니다. 또한 이 프로토콜은 자동화된 컴퓨터 처리 및 분석을 구현하여 확산 셀의 세포 순환, 영역 및 돌출 회수 주기에 대한 정보를 제공합니다.
이러한 자동화된 처리는 데이터 분석의 바이어스를 줄이고 많은 수의 셀에 대한 세포 확산 역학을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 약물 치료 또는 유전자 과학 및 기술과 결합될 때, 이 프로토콜은 세포 돌출을 조절하는 분자 선수의 대규모 속도에 순종합니다. 주어진 프로토콜을 위해, 사용된 세포는 유전으로 플라즈마 막의 형광 태깅을 허용하는 PH-Akt-GFP를 인코딩하는 마우스 배아 섬유아세포입니다.
세포 확산 분석의 시작 에 앞서, 90 %의 수렴에 세포의 접시를 배양. 세포가 적절한 합류를 달성하면 22 by 22 밀리미터 커버 슬립을 화염화하여 35mm 세포 배양 접시에 넣습니다. PBS에서 희석된 섬유네틴으로 커버 슬립을 밀리리터당 2.5 마이크로그램의 농도로 코팅합니다.
커버 슬립으로 접시를 37도 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 1 시간 후 피펫 끝으로 커버 슬립을 만지지 않도록 섬유 네틴을 흡인. 커버 주위에 부드럽게 파이프를 돌리면 PBS로 접시를 2~3번 씻어냅니다.
세포 파종의 경우, 세포의 접시에서 세포 배양 배지를 흡입하여 시작합니다. 그 후 따뜻한 PBS로 접시를 씻으십시오. 접시에 트립신 EDTA 650 마이크로 리터를 추가하고 균등하게 효소를 배포하는 접시를 기울입니다.
트립신과 함께 접시를 인큐베이터에 1분간 넣습니다. 인큐베이션 후 먼저 원심분리기 튜브에 세포 배양 배지 10 밀리리터를 추가해야합니다. 다음으로 트립신을 담금질하기 위해 10 밀리리터의 미디어를 접시에 빠르게 추가합니다.
커버 슬립에 씨를 뿌릴 세포를 희석시키기 위해 접시 내용물의 1밀리리터를 원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브에서 파이펫 약 500 ~ 1, 000 마이크로 리터의 희석 된 세포가 커버 슬립으로 접시에 넣습니다. 커버 슬립이 밀리리터당 10%의 인플루언서 또는 50, 000세포에 있는지 확인하고 필요에 따라 희석된 세포의 부피를 조절합니다.
이러한 세포의 목적은 이미지 수집 중에 초점 평면을 설정하는 것입니다. 나머지 세포가 접시에 들어오면 세포의 5분의 1을 치료당 하나의 작은 접시로 통과시다. 이들은 역학을 퍼뜨리기 위해 분석될 세포일 것입니다.
통로 요리와 커버 슬립 접시를 인큐베이터에 8~24시간 동안 넣습니다. 세포 확산을 위한 Arp2/3의 중요성을 시험하기 위하여는, 먼저 대조군 및 처리 원심분리기 관에 세포 배양 매체의 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로 두 개의 큰 원심분리기 튜브각각에 페놀 레드가 부족한 20 밀리리터의 dmem을 추가합니다.
파이펫은 Arp2/3 복합체의 억제제 또는 DMSO와 같은 통제된 치료법인 약물 CK-666을 크고 큰 튜브로 한다. 세포의 약리학적 치료를 시작하려면 하룻밤 동안 배양된 통로 요리를 제거하십시오. 모든 접시에서 세포 배양 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS로 설거지를 씻으세요.
CK-666을 포함하는 작은 튜브를 가져 가거나 보충 된 미디어를 제어하고 관련 튜브의 내용을 각 통로 접시에 추가하십시오. 각 요리에 올바른 약물 치료로 라벨을 붙인 다음 1시간 동안 배양 한 시간 후에 추가 시간 동안 인큐베이터에 다시 접시를 넣고 각 요리에서 약물 보충 매체를 흡인시합니다. 다음으로, 나머지 페놀 레드 미디어를 모두 철저히 제거하기 위해 모든 요리에 따뜻한 PBS를 추가합니다.
트립신 EDTA 230 마이크로리터를 넣고 1분간 인큐베이터에 요리를 넣습니다. 인큐베이터에서 트립시네이징 된 접시를 제거하고 튜브 B로 지정된 튜브에 페놀 레드가 부족한 약물 보충 dmem의 5 밀리리터를 추가한 다음 트립신을 담금질하기 위해 동일한 미디어의 5 밀리리터를 관련 접시에 추가합니다. 접시에서 모든 세포를 분리하기 위해 미디어를 여러 번 위아래로 피펫합니다.
이미 튜브로 지정된 다른 튜브로 접시의 모든 내용을 전송 A.In 화상 진찰에 적합한 세포 희석을 준비하는 순서, 튜브 A에서 튜브 B.반복 각 치료에 대한 희석 단계를 모두 반복. 모든 튜브를 45분 동안 인큐베이터에 넣고 세포가 트립시화에서 회복할 수 있도록 합니다. 22 mm 22mm 커버 슬립을 수용 할 수있는 세포 자기 챔버의 모든 부분이 사용하기 전에 철저히 청소되었는지 확인하십시오.
인큐베이터에서 덮개 슬립으로 접시를 제거합니다. 세포 배양 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS로 커버 슬립을 씻으세요. 한 쌍의 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 커버를 자기 챔버의 하단 플레이트에 부드럽게 놓습니다.
그런 다음 실리콘 개스킷을 들고 덮개 슬립 위에 놓습니다. 자기 챔버의 본체를 하단 플레이트에 부착합니다. 자기 챔버에 관련 치료에 대응하는 페놀 레드가 부족한 dmem의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.
보풀이 없는 조직을 가지고 조심스럽게 누출을 확인하기 위해 본체와 하단 플레이트 사이의 인클로저를 두드려. 자기 챔버를 완료하려면 투명 커버를 본체에 낮춥춥시다. 마지막으로 물로 분사된 조직과 70%에탄올로 살포된 티슈로 커버 슬립의 바닥을 닦아냅니다.
공초점 현미경의 스테이지 탑 인큐베이터를 37도로 예열합니다. 자기 챔버를 목표 위에 놓습니다. 확산 역학을 획득하기 전에 녹색 형광 채널에서 이미 편광 된 세포에 초점을 설정합니다.
이렇게 하면 퍼지는 세포가 커버 슬립에 부착하면 초점이 맞춰집니다. 인큐베이터에서 제거된 튜브 B에서 자기 챔버 및 파이펫 500 마이크로리터의 투명 커버를 제거합니다. 투명 커버를 맨 위에 다시 놓습니다.
세포 확산 분석에 이상적인 세포를 식별하려면 아직 커버 슬립에 부착하지 않았거나 부착의 초기 단계에있는 세포를 나타내는 녹색 후광을 검색합니다. 이미지를 획득하고 파일을 저장합니다. 셀 확산의 이미지 수집을 완료 한 후, Spyder와 같은 호환 파이썬 IDE를 실행하여 시작합니다.
셀 확산 역학의 계산 분석을 위해 관련 스크립트 패키지에 제공된 GUI 파일을 확산하는 셀을 찾아 엽니다. 백그라운드에서 분석 GUI 패널을 여는 실행 버튼을 누릅니다. GUI에는 분석에 필요한 모든 설정이 있습니다.
셀 영역 및 순환을 분석하려면 셀 스프레드 영역 탭에서 획득 파일 및 필요한 설정을 입력합니다. 셀 유형 및 이미지 수집 매개 변수에 따라 조정해야 합니다. 실행을 누른 후 스크립트는 모든 확산 셀에 대한 셀 원형 및 영역 대 시간 플롯을 만듭니다.
kymograph 데이터의 경우 kymograph 생성기 및 분석 탭을 누릅니다. 이 분석을 위해서는 입력 파일을 단일 셀 이미지 스택을 잘라야 합니다. 모든 설정을 삽입하고 실행을 누른 후 스크립트는 지정된 셀에 대해 여러 kymographs를 생성합니다.
왼쪽에는 DMSO 및 CK-666 처리의 대표 셀이 제공되며 제공된 스크립트를 사용하여 자동으로 분할됩니다. 대조군 세포에 의해 입증된 등위및 고원형태와는 반대로, Arp2/3 억제된 세포는 감소된 순환을 나타낸다. 또한 자동으로 생성된 kymographs는 돌출의 역학을 이해하는 데 중요한 시간적 해상도를 제공합니다.
제어 셀은 거의 또는 전혀 후퇴없이 지속적으로 돌출. 대조적으로, Arp2/3 억제는 확산을 통해 후퇴 이벤트의 증가에 의해 표시된 돌출의 안정성을 방해합니다. 이 비디오는 세포를 올바르게 종자하고, 약리학적 치료를 수행하고, 세포 확산 역학의 정량화에 필요한 이미징 및 계산 도구를 준비하는 방법에 대한 이해를 제공해야합니다.
이 프로토콜은 세포 돌출을 지배하는 분자 플레이어를 확인하기 위해 세포 골격 형광 화상 진찰 및 이주 분석과 더 결합 될 수 있습니다. 당신의 실험으로 보고 행운을 주셔서 감사합니다.
