يحدد البروتوكول الموصوف في هذا الفيديو الإجراءات التجريبية المطلوبة لتصوير الخلايا المنتشرة بالحجم الطبيعي واستخدام أداة حسابية تحدد كميا الخلايا التي تنشر الديناميكيات بطريقة غير متحيزة وآلية. تسمح أصول انتشار الخلية بالتتبع المستمر لحركة حافة الخلية والتغيرات المورفولوجية أثناء انتشار الخلايا ، وهي ميزة مفقودة في معظم المقايسات المنتشرة للخلايا الموجودة. كذلك، ينفذ هذا البروتوكول استخدام المعالجة الآلية للكمبيوتر وتحليله، وتوفير المعلومات عن تدوير الخلايا، ودورات تراجع المنطقة والنتوءات من الخلايا المنتشرة.
هذه المعالجة الآلية يقلل من التحيز في تحليل البيانات ويوفر طريقة قوية لتحليل ديناميات انتشار الخلايا لعدد كبير من الخلايا. عندما يقترن العلاجات الدوائية أو علم الجينات والتقنيات، وهذا البروتوكول قابلة لسرعات واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية تنظيم نتوءات الخلايا. بالنسبة للبروتوكول المحدد ، فإن الخلايا المستخدمة هي الخلايا الليفية الجنينية الماوس التي ترميز وراثيا PH-Akt-GFP، والذي يسمح لوضع علامات الفلورسنت من غشاء البلازما.
قبل بداية الخلية نشر المقايسة، والثقافة طبق من الخلايا إلى التقاء 90٪. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء السليم، لهب زلة غطاء 22 في 22 ملليمتر ووضعه في طبق ثقافة الخلية 35 ملليمتر. معطف زلة الغطاء مع فيبروكتين التي تم تخفيفها في برنامج تلفزيوني إلى تركيز 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.
ضع الطبق مع الغطاء زلة في حاضنة 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة تستنشق فيبروكتين التأكد من عدم لمس زلة الغطاء مع طرف ماصة. غسل الطبق مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting بلطف حول زلة الغطاء مرتين إلى ثلاث مرات.
لزرع الخلايا، تبدأ عن طريق التجسس وسائل الإعلام ثقافة الخلية من طبق من الخلايا. بعد ذلك، اغسل الطبق مع برنامج تلفزيوني دافئ. إضافة 650 ميكرولتر من التربسين EDTA إلى الطبق وإمالة الطبق لتوزيع بالتساوي الانزيم.
ضع الطبق مع التريبسين في الحاضنة لمدة دقيقة واحدة. بعد الحضانة ستحتاج أولا إلى إضافة 10 ملليلتر من وسائط ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك ، أضف بسرعة 10 ملليلترات أخرى من الوسائط إلى الطبق من أجل إخماد التريبسين.
لتمييع الخلايا التي سيتم بذرها على زلة الغطاء، ماصة ملليلتر واحد من محتويات الطبق في أنبوب الطرد المركزي. من الأنبوب، ماصة ما يقرب من 500 إلى 1، 000 ميكرولتر من الخلايا المخففة في الطبق مع زلة الغطاء. تأكد من أن زلة الغطاء تبلغ التقاء 10٪ أو 50,000 خلية لكل ملليلتر وضبط حجم الخلايا المخففة حسب الحاجة.
الغرض من هذه الخلايا هو إنشاء مستوى من التركيز أثناء الحصول على الصورة. مع الخلايا المتبقية في الطبق، مرور خمس الخلايا إلى طبق واحد صغير لكل علاج. هذه ستكون الخلايا التي سيتم تحليلها لنشر الديناميكيات.
ضع أطباق المرور وطبق زلة الغطاء في حاضنة لمدة ثماني إلى 24 ساعة. لاختبار أهمية Arp2/3 لانتشار الخلايا، أضف أولا خمسة ملليلترات من وسائط ثقافة الخلية إلى أنبوب تحكم ومطرد مركزي للعلاج. إضافة المقبل 20 ملليلتر من dmem التي تفتقر إلى فينول الأحمر في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي أكبر.
ماصة إما المخدرات CK-666 وهو مثبط للمجمع Arp2/3 أو العلاج الخاضعة للرقابة مثل DMSO في أنابيب صغيرة وكبيرة. لبدء العلاج الدوائي للخلايا ، قم بإزالة أطباق المرور التي كانت تحتضن بين عشية وضحاها. يستنشق وسائل الإعلام ثقافة الخلية من جميع الأطباق وغسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني دافئ.
خذ الأنابيب الصغيرة التي تحتوي على إما CK-666 أو التحكم في الوسائط التكميلية وإضافة محتويات الأنبوب ذي الصلة إلى كل من أطباق المرور. تسمية كل من الأطباق مع العلاج الدوائي الصحيح ومن ثم وضع الأطباق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعة إضافية بعد حضانة ساعة واحدة، يستنشق وسائل الإعلام المخدرات تكمل من كل من الأطباق. بعد ذلك ، أضف PBS الدافئ إلى جميع الأطباق من أجل إزالة جميع الوسائط الحمراء المتبقية من الفينول.
إضافة 230 ميكرولتر من EDTA تريبسين ووضع الأطباق في حاضنة لمدة دقيقة واحدة. إزالة الأطباق جربسينED من الحاضنة والمضي قدما لإضافة خمسة ملليلتر من المخدرات تكمل dmem التي تفتقر إلى فينول الأحمر في أنبوب المعينة كما أنبوب B.Then إضافة خمسة ملليلترات أخرى من نفس وسائل الإعلام في الطبق ذات الصلة لإرواء التريبسين. ماصة وسائل الإعلام صعودا وهبوطا عدة مرات من أجل فصل جميع الخلايا من الطبق.
نقل جميع محتويات الطبق إلى أنبوب آخر تم تعيينه بالفعل أنبوب A.In من أجل إعداد تخفيف الخلية التي هي مناسبة للتصوير، ونقل ملليلتر واحد من الخلايا من أنبوب A إلى أنبوب B.Repeat كل من خطوات التخفيف لكل علاج. ضع جميع الأنابيب في الحاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي من التربسين. تأكد من أن جميع أجزاء الغرفة المغناطيسية للخلايا التي يمكن أن تستوعب زلة غطاء 22 في 22 ملليمتر قد تم تنظيفها جيدا قبل الاستخدام.
إزالة الطبق مع زلة الغطاء من الحاضنة. يستنشق وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل زلة الغطاء مع برنامج تلفزيوني دافئ. إزالة زلة الغطاء باستخدام زوج من ملقط ووضع بلطف زلة الغطاء على لوحة أسفل الغرفة المغناطيسية.
المقبل التقاط طوقا السيليكون ووضعه على رأس زلة الغطاء. إرفاق الجسم الرئيسي للغرفة المغناطيسية على لوحة أسفل. إضافة ملليلتر واحد من dmem تفتقر إلى فينول الأحمر المقابلة للعلاج ذات الصلة إلى الغرفة المغناطيسية.
خذ أنسجة خالية من الوبر وداب بعناية الضميمة بين الجسم الرئيسي ولوحة أسفل من أجل التحقق من أي تسرب. لإكمال الغرفة المغناطيسية، خفض الغطاء الشفاف على الجسم الرئيسي. وأخيرا مسح الجزء السفلي من زلة الغطاء مع نسيج رش بالماء وآخر رش مع الإيثانول 70٪.
سخني الحاضنة العليا للمرحلة من المجهر الكونفوجال إلى 37 درجة. ضع الغرفة المغناطيسية فوق الهدف. قبل اكتساب ديناميات الانتشار، قم بتعيين التركيز على الخلايا المستقطبة بالفعل في قناة الفلورسنت الخضراء.
وهذا يضمن أن الخلايا المنتشرة ستكون في بؤرة التركيز بمجرد إرفاقها بزلة الغطاء. إزالة الغطاء الشفاف للغرفة المغناطيسية وماصة 500 ميكرولتر من الأنبوب B الذي تمت إزالته من الحاضنة. ضع الغطاء الشفاف مرة أخرى في الأعلى.
لتحديد الخلايا المثالية لنشر الخلية تحليل البحث عن الهالات الخضراء التي تمثل الخلايا التي لم تعلق بعد على زلة الغطاء أو هي في المراحل الأولى من المرفق. الحصول على الصور وحفظ الملفات. بعد الانتهاء من الحصول على صورة من انتشار الخلية، تبدأ بتشغيل IDE بيثون متوافق مثل سبايدر.
للتحليل الحسابي لديناميات انتشار الخلية، حدد موقع وفتح الخلية نشر ملف واجهة المستخدم الرسومية المقدمة في حزم البرنامج النصي ذات الصلة. اضغط على زر التشغيل الذي سيفتح لوحة واجهة المستخدم الرسومية للتحليل في الخلفية. واجهة المستخدم الرسومية تضم جميع الإعدادات اللازمة للتحليل.
لتحليل مساحة الخلية والتعميم، أدخل ملف الامتلاك والإعدادات الضرورية في علامة التبويب منطقة انتشار الخلية. يجب إجراء التعديلات اعتمادا على نوع الخلية ومعلمات الحصول على الصورة. بعد الضغط على التشغيل، سيقوم البرنامج النصي بإنشاء دائرية الخلية والمنطقة مقابل رسم الوقت لجميع الخلايا المنتشرة.
للحصول على بيانات كيموغراف، اضغط على مولد الكيموغراف وعلامة التبويب التحليل. يتطلب هذا التحليل إدخال الملفات إلى اقتصاص مكدسات صورة الخلية المفردة. بعد إدراج كافة الإعدادات والضغط على التشغيل، سيقوم البرنامج النصي بإنشاء عدة kymographs للخلية المحددة.
على اليسار توجد خلايا تمثيلية من علاجات DMSO و CK-666 ، مجزأة تلقائيا باستخدام البرنامج النصي المقدم. على عكس المورفولوجيا الأيزوتروبيكية والتعميمية للغاية التي أظهرتها خلايا التحكم ، تظهر الخلايا المثبطة Arp2/3 دائرية انخفضت. بالإضافة إلى ذلك ، توفر kymographs التي تم إنشاؤها تلقائيا دقة زمنية حاسمة لفهم ديناميكيات النتوءات.
تبرز خلايا التحكم باستمرار مع تراجعات قليلة أو معدومة. في المقابل، Arp2/3 تثبيط يعطل استقرار نتوءات كما هو مبين من خلال الزيادة في أحداث التراجع في جميع أنحاء انتشار. يجب أن توفر لك مقاطع الفيديو هذه فهما لكيفية زرع الخلايا بشكل صحيح ، وإجراء العلاجات الدوائية وإعداد أدوات التصوير والحساب اللازمة للقياس الكمي لديناميكيات انتشار الخلايا.
يمكن دمج هذا البروتوكول بشكل أكبر مع التصوير الفلوري للهيكل الخلوي ومقاايسات الهجرة لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين يحكمون نتوءات الخلايا. شكرا لكم على مشاهدة وحظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.
