Le protocole décrit dans cette vidéo définira les procédures expérimentales requises pour l’imagerie grandeur nature des cellules de propagation et l’utilisation d’un outil informatique qui quantifie la dynamique de propagation des cellules d’une manière impartiale et automatisée. L’actif de propagation cellulaire permet le suivi continu du mouvement du bord cellulaire et des changements morphologiques lors de la propagation cellulaire, ce qui est une caractéristique qui manque dans la plupart des analyses de propagation cellulaire existantes. En outre, ce protocole met en œuvre l’utilisation du traitement et de l’analyse automatisés d’ordinateur, fournissant l’information sur la circularité cellulaire, les cycles de rétractation de secteur et de saillie des cellules de propagation.
Un tel traitement automatisé réduit les biais dans l’analyse des données et fournit une méthode robuste d’analyse de la dynamique de propagation cellulaire pour un grand nombre de cellules. Lorsqu’il est combiné avec des traitements médicamenteux ou des sciences et techniques génétiques, ce protocole est approprié à des vitesses à grande échelle des joueurs moléculaires régulant les saillies cellulaires. Pour le protocole donné, les cellules utilisées sont des fibroblastes embryonnaires de souris qui codent génétiquement PH-Akt-GFP, ce qui permet le marquage fluorescent de la membrane plasmatique.
Avant le début de l’essai de propagation cellulaire, la culture d’un plat de cellules à 90% confluency. Une fois que les cellules ont atteint la confluence appropriée, la flamme d’un glissement de couverture de 22 par 22 millimètres et le placer dans un plat de culture cellulaire de 35 millimètres. Enduire le glissement de couverture de fibronectine dilué dans le PBS à une concentration de 2,5 microgrammes par millilitre.
Placer le plat avec le couvercle glisser dans un incubateur de 37 degrés pendant une heure. Après une heure aspirer la fibronectine en s’assurant de ne pas toucher le bordereau de couverture avec la pointe pipette. Laver le plat avec du PBS en faisant glisser doucement autour du couvercle deux à trois fois.
Pour l’ensemencement cellulaire, commencez par aspirer les médias de culture cellulaire à partir du plat des cellules. Ensuite, laver le plat avec du PBS chaud. Ajouter 650 microlitres de trypsine EDTA au plat et incliner le plat pour répartir uniformément l’enzyme.
Placer le plat avec la trypsine dans l’incubateur pendant une minute. Après l’incubation, vous devrez d’abord ajouter 10 millilitres de médias de culture cellulaire dans un tube de centrifugeuse. Ensuite, ajoutez rapidement 10 millilitres de médias dans le plat afin d’étancher la trypsine.
Pour diluer les cellules qui seront ensemencées sur le bordereau de couverture, pipette un millilitre du contenu du plat dans le tube de centrifugeuse. Du tube, pipette environ 500 à 1000 microlitres de cellules diluées dans le plat avec le bordereau de couverture. Assurez-vous que le glissement de couverture est à une confluence de 10% ou 50.000 cellules par millilitre et ajuster le volume de cellules diluées au besoin.
Le but de ces cellules est d’établir un plan de concentration lors de l’acquisition d’images. Avec les cellules restantes dans le plat, passer un cinquième des cellules dans un petit plat par traitement. Ce seront les cellules qui seront analysées pour la dynamique de propagation.
Placer les plats de passage et le couvercle glisser le plat dans un incubateur pendant huit à 24 heures. Pour tester l’importance de l’Arp2/3 pour la propagation cellulaire, ajoutez d’abord cinq millilitres de médias de culture cellulaire dans un contrôle et un tube de centrifugeuse de traitement. Ajouter ensuite 20 millilitres de dmem qui manque de phénol rouge dans chacun des deux plus grands tubes de centrifugeuse.
Pipette soit le médicament CK-666 qui est un inhibiteur du complexe Arp2/3 ou le traitement contrôlé comme DMSO dans les petits et grands tubes. Pour commencer le traitement pharmacologique des cellules, enlever les plats de passage qui couvaient pendant la nuit. Aspirez les médias de culture cellulaire de tous les plats et lavez la vaisselle avec du PBS chaud.
Prenez les petits tubes contenant soit CK-666 ou contrôlez les supports complétés et ajoutez le contenu du tube pertinent dans chacun des plats de passage. Étiquetez chacun des plats avec le traitement médicamenteux correct, puis placez les plats dans l’incubateur pendant une heure supplémentaire Après une heure d’incubation, aspirez le médicament complété par les médias de chacun des plats. Ensuite, ajoutez du PBS chaud à tous les plats afin d’enlever complètement tous les supports rouges de phénol restants.
Ajouter 230 microlitres de trypsine EDTA et placer les plats dans un incubateur pendant une minute. Retirer les plats trypsinisés de l’incubateur et procéder à ajouter cinq millilitres de la drogue complétée dmem qui manque de phénol rouge dans un tube désigné comme tube B.Puis ajouter un autre cinq millilitres du même média dans le plat pertinent pour étancher la trypsine. Pipette les médias de haut en bas à plusieurs reprises afin de détacher toutes les cellules du plat.
Transférer tout le contenu du plat dans un autre tube qui a déjà été désigné comme tube A.In afin de préparer une dilution cellulaire qui est appropriée pour l’imagerie, transférer un millilitre de cellules du tube A dans le tube B.Répétez toutes les étapes de dilution pour chaque traitement. Placez tous les tubes dans l’incubateur pendant 45 minutes pour permettre aux cellules de se remettre de la trypsinisation. Assurez-vous que toutes les parties d’une chambre magnétique cellulaire pouvant accueillir un glissement de couvercle de 22 par 22 millimètres ont été soigneusement nettoyées avant utilisation.
Retirer le plat avec le couvercle de l’incubateur. Aspirez les supports de culture cellulaire et lavez le bordereau de couverture avec du PBS chaud. Retirer le bordereau de couverture à l’aide d’une paire de forceps et déposer délicatement le couvercle sur la plaque inférieure de la chambre magnétique.
Ensuite, prenez le joint en silicone et placez-le sur le dessus de la feuille de couverture. Fixez le corps principal de la chambre magnétique sur la plaque inférieure. Ajouter un millilitre du dmem sans rouge phénol correspondant au traitement pertinent à la chambre magnétique.
Prenez un tissu sans peluche et tamponnez soigneusement l’enceinte entre le corps principal et la plaque inférieure afin de vérifier les fuites. Pour compléter la chambre magnétique, abaissez le couvercle transparent sur le corps principal. Enfin essuyer le fond de la feuille de couverture avec un tissu pulvérisé avec de l’eau et un autre pulvérisé avec 70% d’éthanol.
Préchauffer l’incubateur supérieur d’étape d’un microscope confocal à 37 degrés. Placez la chambre magnétique sur l’objectif. Avant d’acquérir une dynamique de propagation, concentrez-vous sur les cellules déjà polarisées du canal fluorescent vert.
Cela garantit que les cellules de propagation seront au point une fois qu’elles se fixent à la feuille de couverture. Retirez le couvercle transparent de la chambre magnétique et pipette 500 microlitres du tube B qui a été retiré de l’incubateur. Remettre le couvercle transparent sur le dessus.
Pour identifier les cellules idéales pour l’analyse de propagation cellulaire, recherchez des halos verts qui représentent des cellules qui n’ont pas encore été attachées au glissement de couverture ou qui en sont aux premiers stades de l’attachement. Acquérez des images et enregistrez les fichiers. Après avoir terminé l’acquisition d’images de diffusion cellulaire, commencez par exécuter un Python IDE compatible tel que Spyder.
Pour l’analyse computationnelle de la dynamique de propagation cellulaire, localisez et ouvrez le fichier GUI de diffusion cellulaire fourni dans les paquets de scripts pertinents. Appuyez sur le bouton d’exécuteur qui ouvrira le panneau d’analyse GUI en arrière-plan. L’interface graphique abrite tous les paramètres nécessaires à l’analyse.
Pour analyser la zone cellulaire et la circularité, entrez le fichier d’acquisition et les paramètres nécessaires dans l’onglet zone de propagation cellulaire. Des ajustements devront être effectués en fonction du type de cellule et des paramètres d’acquisition d’image. Après avoir appuyé sur exécuter, le script va créer une circularité cellulaire et zone versus parcelle de temps pour toutes les cellules de propagation.
Pour les données kymographiques, appuyez sur le générateur de kymograph et l’onglet analyse. Cette analyse nécessite que les fichiers d’entrée soient recadrés piles d’images à cellule unique. Après avoir inséré tous les paramètres et appuyé sur exécuter, le script va créer plusieurs kymographs pour la cellule donnée.
Sur la gauche se trouvent des cellules représentatives des traitements DMSO et CK-666, automatiquement segmentées à l’aide du script fourni. Contrairement à la morphologie isotropique et hautement circulaire démontrée par les cellules de contrôle, les cellules inhibées Arp2/3 présentent une circularité diminuée. En outre, les kymographes générés automatiquement fournissent une résolution temporelle essentielle à la compréhension de la dynamique des saillies.
Les cellules de contrôle dépassent constamment avec peu ou pas de rétractations. En revanche, l’inhibition arp2/3 perturbe la stabilité des saillies comme l’indique l’augmentation des événements de rétractation tout au long de la propagation. Ces vidéos devraient vous fournir la compréhension de la façon de bien semer les cellules, effectuer des traitements pharmacologiques et préparer l’imagerie et les outils informatiques nécessaires à la quantification de la dynamique de propagation cellulaire.
Ce protocole peut être combiné avec l’imagerie fluorescente de cytosquelette et les analyses de migration pour identifier les joueurs moléculaires régissant des saillies cellulaires. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
