Bu protokol, çeşitli araştırma çalışmaları içinde, kültürlü hücrelerde birincil silya hızlı ve kolay tespit sağlar. Yöntem primer silya bazal organları etkileyen bozukluk kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda parafin gömülü dokuda primer silia boyama veya floresan gerekli diğer deneyler için uygulanabilir.
22'ye 22 milimetrelik kapak fişlerini otomatikleştirerek ve deney için malzeme hazırlayarak başlayın. Çözülme FBS ve penisilin streptomisin, ve oda sıcaklığına kültür orta Sıcak. Tripsin EDTA ve PBS ile hücreleri geçiş.
El yazması talimatlara göre taze %4 paraformaldehit, kültür ortamı ve %1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra laminar akış başlığı %70 etanol ile temizleyin ve gerekli tüm malzemeleri içine yerleştirin. Paraformaldehit son derece tehlikelidir.
Uygun PPE her zaman giyilmelidir, ve sadece kimyasal bir başlık ele alınmalıdır. İstenilen hücreleri %70'e çıkardıktan sonra kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve pbs ile hücreleri iki kez durula.
Kültür şişesine yaklaşık iki mililitre 0.25% tripsin EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Müfrezeyi izlemek için hücreleri ters mikroskopta periyodik olarak kontrol edin. Hücreler yavaşça kültür orta 10 mililitre onları resuspend ayırdı, tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için dikkatle pipetting.
Hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik konik bir tüp verin ve 5 dakika boyunca 200 kez G'santrifüj edin. Decant supernatant sonra kültür orta 10 mililitre ekleyin ve yavaşça pelet resuspend. Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini alın ve bire bir hacim oranında trypan mavisi ile karıştırın.
Sonra standart hemositometri kullanarak hücreleri saymak. Altı kuyu plakasının her kuyusunun içine bir kapak fişi yerleştirin ve kapak kaymasına bağlı hücrelere yardımcı olacak iki mililitre jelatin çözeltisi ile kapak fişini kaplayın. Jelatini çıkarın ve plakanın birkaç dakika kurumasına izin verin.
Tohum 100, 000 fibroblastlar her kuyuya ve kültür orta iki mililitre ekleyin. Sonra hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece, yüzde beş karbondioksit ve %90 bağıl nemde kuluçkaya yatırın. Kuluçka dan sonra siliasyon indüklemek için hücreleri tedavi.
Oda sıcaklığına % 4 paraformaldehit ısıtın ve bir mera pipetleri, ABS, bir atık konteyner, 15 mililitre konik tüpler, mikro pipetler ve ipuçları hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve laboratuar bankına yerleştirin. Her kuyudan ortamı çıkarın ve kapak fişini bırakarak.
Hücreleri iki mililitre PBS ile üç kez hafifçe yıkayın. Sonra hücreleri düzeltmek için her kuyuiçine% 4 PFA iki mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından PFA'yı çıkarın ve PBS ile yıkarları tekrarlayın.
Her kuyuya %0,5 Triton X-100'ün iki mililitresini ekleyin ve tabağı 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra pbs ile kuyuları dört kez yıkayın. Engelleme çözeltisi yapmak için, beş dakika boyunca bir keçi serumu eritin ve PBS bir ila 20 oranında seyreltin.
Her kapak kayma için bu çözeltinin 150 mikrolitre ekleyin ve 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları beş dakika boyunca eritin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi PBS'de ayrı ayrı seyreltin. Kapak fişlerinden bloke solüsyonu çıkarın ve her iki antikor çözeltisinden 150 mikrolitre ekleyin.
Sonra oda sıcaklığında 60 dakika boyunca plaka kuluçka. Birincil antikorları çıkarın ve iki mililitre PBS ile kapağı üç kez hafifçe yıkayın. Seyreltik Cy3 Koyun Anti-Mouse ve Alexa flor 488 Keçi anti-Rabbit PBS, bir ila 300 oranında, ve kapak kayma her iki ikincil antikor çözümleri 150 mikrolitre ekleyin.
PBS 50 mililitre stok 10 mikrolitre seyreltme tarafından çalışan bir DAPI çözeltisi hazırlayın ve kapak fişleri için bu seyreltme iki mililitre ekleyin. Tabağı karanlıkta, oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kapak fişlerini slaytlara yerleştirmeden önce, iki iğne, cımbız ve montaj ortamı hazırlayın ve tüm slaytları etiketlayın.
DAPI çözeltisini kuyulardan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın.
Sonra çevirin ve yavaşça cımbız kullanarak montaj ortamı damla üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın. Slaytları ışıktan koruyun ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın.
Ertesi gün primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bu protokol immünleke düzeltmek için kullanılmıştır, ve görüntü çeşitli hücre hatları birincil silya ifade. Fare miyoblastları çeşitli dozlarda iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldığında, daha yüksek dozlarda birden fazla primer silia görünümünü indüklediği bulunmuştur.
Düşük dozlarda tek primer silya görünümünü neden iken. Benzer şekilde, insan akciğer fibroblastları düşük dozda yayıldığında, immünoresans tarafından tek primer silya saptandı. Açlıktan ölen fare embriyonik fibroblastlarında primer silyada artış gözlendi ve metabolik stresin primer silya olaylarını etkilediğini gösterdi.
Deri fibroblastları 120 nanomolar doksorubisin ile tedavi edildiğinde, tek bir primer cilium ifade. Yüksek dozlarda birden fazla primer silya görünümünü indükler. Fibroblastlar 1.25 nanomolar Taxol ile tedavi de tek bir birincil cilium ifade.
Ama birden fazla silya yüksek dozlarda tedaviden sonra tespit edilmedi. Bu protokolü açarken tüm PPE yönetmeliklerine uyun. Seçtiğiniz hücre hattının kültür ihtiyaçlarını unutmayın ve antikorlarınızı dikkatle seçtiniz.
Hücreler geri alınamaz olduğundan, bu yordam doğrudan diğer yordamlar tarafından takip edilemez. Bunun yerine, paralel deneyler programlanmalıdır.
