Este protocolo permite a detecção rápida e fácil de cilias primárias em células cultivadas, dentro de uma variedade de esforços de pesquisa. O método poderia ser utilizado em desordem que afeta os corpos basais de cílios primários. Este procedimento também pode ser aplicado para coloração de cílios primários em tecido incorporado parafina ou para outros experimentos onde a fluorescência é necessária.
Comece autoclaving 22 por 22 milímetros de cobertura e preparando materiais para o experimento. Descongele fbs e estreptomicina de penicilina, e aqueça a cultura temperatura média a ambiente. Passagem pelas células com trippsina EDTA e PBS.
Prepare a solução fresca de 4% paraformaldeído, cultura média e 1%, de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, limpe a capa de fluxo laminar com 70% de etanol, e coloque todos os materiais necessários dentro. Paraformaldeído é extremamente perigoso.
O EPI adequado deve ser usado o tempo todo, e só deve ser manuseado em um capuz químico. Depois de crescer as células desejadas para 70% de confluência, remova-as da incubadora e as coloque na coifa de fluxo laminar. Remova o meio de cultura e enxágue as células duas vezes com PBS.
Adicione cerca de dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA ao frasco de cultura, e incuba-o a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique periodicamente as células no microscópio invertido para monitorar o desprendimento. Quando as células se separarem suavemente resususpensá-las em 10 mililitros de meio de cultura, pipetting cuidadosamente para criar uma única suspensão celular.
Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga-a a 200 vezes g'por cinco minutos. Decante o supernascedor, em seguida, adicione 10 mililitros de cultura média, e levemente resuspend a pelota. Pegue 20 microliters da suspensão da célula e misture-a com o azul trypan em uma proporção de volume de um para um.
Em seguida, conte as células usando hemocittometria padrão. Coloque um deslizamento de tampa dentro de cada poço de uma placa de seis poços, e cubra o deslizamento da tampa com dois mililitros da solução de gelatina, o que ajudará as células presas ao deslizamento da tampa. Retire a gelatina e deixe a placa secar por alguns minutos.
Sementes 100.000 fibroblastos em cada poço e adicionar dois mililitros de cultura média. Em seguida, incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 90% de umidade relativa. Após a incubação, trate as células para induzir a ciliação.
Aqueça o paraformaldeído de 4% à temperatura ambiente, e prepare uma pipeta de pastagem, ABS, um recipiente de resíduos, tubos cônicos de 15 mililitros, micro pipetas e pontas. Pegue as células da incubadora e coloque-as no banco do laboratório. Remova a mídia de cada poço, deixando o deslizamento da tampa.
Lave suavemente as células três vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione dois mililitros do PFA de 4%em cada poço para corrigir as células. Incubar a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, depois retire o PFA e repita as lavagens com PBS.
Adicione dois mililitros de 0,5% Triton X-100 a cada poço, e incubar a placa por 15 minutos. Em seguida, lave os poços quatro vezes com PBS. Para fazer a solução de bloqueio, descongele um soro de cabra por cinco minutos e dilua-o em PBS a uma proporção de um a 20.
Adicione 150 microliters desta solução a cada deslizamento de cobertura e incubar a placa por 20 minutos. Descongele os anticorpos primários por cinco minutos, e dilui-os separadamente na PBS, como descrito no manuscrito do texto. Remova a solução de bloqueio dos deslizamentos de cobertura e adicione 150 microliters de ambas as soluções de anticorpos.
Em seguida, incubar a placa por 60 minutos em temperatura ambiente. Remova os anticorpos primários e lave suavemente os deslizamentos de cobertura três vezes com dois mililitros de PBS. Diluir Cy3 Sheep Anti-Mouse e Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit na PBS, em uma proporção de um a 300, e adicionar 150 microliters de ambas as soluções de anticorpos secundários ao deslizamento de cobertura.
Prepare uma solução DAPI de trabalho diluindo 10 microliters do estoque em 50 mililitros de PBS, e adicione dois mililitros desta diluição aos deslizamentos de cobertura. Incubar a placa por cinco minutos no escuro, em temperatura ambiente. Antes de colocar os deslizes de tampa nos slides, prepare duas agulhas, pinças e mídia de montagem, e rotule todos os slides.
Remova a solução DAPI dos poços e lave-as três vezes com PBS. Coloque uma gota de mídia de montagem em cada slide. Use a agulha para levantar suavemente o deslizamento da tampa do fundo do poço.
Em seguida, vire-o e coloque-o suavemente sobre a gota de mídia de montagem usando a pinça. Remova cuidadosamente todas as bolhas. Proteja os slides da luz e armazene-os durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte use um microscópio fluorescente ou confocal com uma alta ampliação para visualizar o cílio primário. Este protocolo foi usado para corrigir imunostain, e imagem várias linhas de células expressando cílios primários. Quando os míbios do rato foram expostos à radiação ionizante em várias doses, descobriu-se que doses mais altas induzem o aparecimento de múltiplas cílias primárias.
Enquanto doses baixas resultaram no aparecimento de cílios primários únicos. Da mesma forma, quando os fibroblastos pulmonares humanos foram irradiados em baixa dose, a ília primária única foi detectada por imunofluorescência. Observou-se aumento da cília primária em fibroblastos embrionários de camundongos que estavam famintos, demonstrando que o estresse metabólico afeta os incidentes de ília primária.
Quando os fibroblastos de pele foram tratados com 120 doxorubicina nanomolar, eles expressaram um único cílio primário. Doses mais altas induzem o aparecimento de múltiplas cílias primárias. Os fibroblastos tratados com 1,25 nanomolar Taxol também expressaram um único cílio primário.
Mas várias cílias não foram detectadas após o tratamento com doses mais altas. Ao abrir este protocolo, certifique-se de seguir todos os regulamentos de EPI. Tenha em mente as necessidades culturais de sua linha de escolha celular e escolha seus anticorpos cuidadosamente.
Este procedimento não pode ser seguido diretamente por outros procedimentos, uma vez que as células são irrecuperáveis. Em vez disso, experimentos paralelos devem ser programados.
