Questo protocollo consente un rilevamento rapido e semplice delle ciglia primarie nelle cellule coltivate, all'interno di una varietà di sforzi di ricerca. Il metodo potrebbe essere utilizzato in disordine che colpisce i corpi basali delle ciglia primarie. Questa procedura può essere applicata anche per la colorazione delle ciglia primarie nel tessuto incorporato di paraffina o per altri esperimenti in cui è necessaria la fluorescenza.
Inizia con l'autoclave di 22 per 22 millimetri scivola e prepara i materiali per l'esperimento. Scongelare FBS e streptomicina penicillina e riscaldare la coltura a temperatura media-ambiente. Passare le cellule con tripside EDTA e PBS.
Preparare la paraformaldeide fresca al 4%, il terreno di coltura e la soluzione di gelatina all'1%, secondo le indicazioni del manoscritto. Quindi pulire la cappa di flusso laminare con il 70% di etanolo e posizionare tutti i materiali necessari all'interno. La paraformaldeide è estremamente pericolosa.
I DPI adeguati devono essere indossati in ogni momento e dovrebbero essere maneggiati solo in una cappa chimica. Dopo aver fatto crescere le cellule desiderate al 70% di confluenza, rimuoverle dall'incubatrice e posizionarle nella cappa di flusso laminare. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le cellule due volte con PBS.
Aggiungere circa due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA al pallone da coltura e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare periodicamente le cellule sul microscopio invertito per monitorare il distacco. Quando le cellule si sono staccate delicatamente riutilizzandole in 10 millilitri di mezzo di coltura, pipettando attentamente per creare una singola sospensione cellulare.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugarla a 200 volte G'per cinque minuti. Decantare il supernatante quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura e rimescolare delicatamente il pellet. Prendi 20 microlitri della sospensione cellulare e mescolala con il blu tripano con un rapporto volume uno a uno.
Quindi contare le cellule usando l'emocitometria standard. Posizionare un coperchio scivolare all'interno di ogni pozzo di una piastra di sei pozza e rivestire il coperchio scivolare con due millilitri della soluzione di gelatina, che aiuterà le cellule attaccate al coperchio a scivolare. Rimuovere la gelatina e lasciare asciugare la piastra all'aria per alcuni minuti.
Seme 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungere due millilitri di mezzo di coltura. Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius, anidride carbonica al 5% e umidità relativa del 90%. Dopo l'incubazione trattare le cellule per indurre la ciliazione.
Riscaldare la paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente e preparare pipette da pascolo, ABS, un contenitore di rifiuti, tubi conici da 15 milliliter, micro pipette e punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e mettile sul banco del laboratorio. Rimuovere i supporti da ogni pozzo, lasciando il coperchio scivolare.
Lavare delicatamente le cellule tre volte con due millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri del 4%PFA in ogni pozzo per fissare le celle. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il PFA e ripetere i lavaggi con PBS.
Aggiungere due millilitri dello 0,5%Triton X-100 ad ogni pozzo e incubare la piastra per 15 minuti. Quindi lavare i pozzi quattro volte con PBS. Per creare la soluzione di blocco, scongelare un siero di capra per cinque minuti e diluirlo in PBS con un rapporto uno a 20.
Aggiungere 150 microlitri di questa soluzione a ogni slittamento del coperchio e incubare la piastra per 20 minuti. Scongelare gli anticorpi primari per cinque minuti e diluirli separatamente in PBS, come descritto nel manoscritto testuale. Rimuovere la soluzione di blocco dagli scivolamenti del coperchio e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali.
Quindi incubare la piastra per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare delicatamente il coperchio scivola tre volte con due millilitri di PBS. Diluire Cy3 Sheep Anti-Mouse e Alexa fluor 488 Goat anti-Rabbit in PBS, con un rapporto da uno a 300, e aggiungere 150 microlitri di entrambe le soluzioni anticorpali secondarie allo scivolo di copertura.
Preparare una soluzione DAPI funzionante diluendo 10 microlitri del materiale in 50 millilitri di PBS e aggiungere due millilitri di questa diluizione ai coperchi. Incubare il piatto per cinque minuti al buio, a temperatura ambiente. Prima di posizionare il coperchio scivola sulle diapositive, preparare due aghi, pinzette e supporti di montaggio ed etichettare tutte le diapositive.
Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzi e lavarli tre volte con PBS. Mettere una goccia di supporti di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente lo scivolamento del coperchio dal fondo del pozzo.
Quindi capovolgerlo e posizionarlo delicatamente sopra la goccia di supporti di montaggio utilizzando le pinzette. Rimuovere con cura eventuali bolle. Proteggere le diapositive dalla luce e conservarle durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno successivo utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con un alto ingrandimento per visualizzare le ciglia primarie. Questo protocollo è stato utilizzato per correggere l'immunosostenibile e l'immagine di varie linee cellulari che esprimono ciglia primarie. Quando i mioblasti di topo sono stati esposti a radiazioni ionizzanti a varie dosi, si è scoperto che dosi più elevate inducono la comparsa di più ciglia primarie.
Mentre basse dosi hanno portato alla comparsa di singole ciglia primarie. Allo stesso modo, quando i fibroblasti polmonari umani sono stati irradiati a bassa dose, singole ciglia primarie sono state rilevate dall'immunofluorescenza. Un aumento della ciglia primaria è stato osservato nei fibroblasti embrionali di topo che sono stati affamati, dimostrando che lo stress metabolico influisce sugli incidenti delle ciglia primarie.
Quando i fibroblasti cutanei sono stati trattati con 120 doxorubicina nanomolare, hanno espresso un singolo cilio primario. Dosi più elevate inducono la comparsa di ciglia primarie multiple. I fibroblasti trattati con 1,25 taxolo nanomolare hanno anche espresso un singolo cilio primario.
Ma ciglia multiple non sono state rilevate dopo il trattamento con dosi più elevate. Quando si apre questo protocollo assicurarsi di seguire tutte le normative DPI. Tieni presente le esigenze di coltura della tua linea cellulare preferita e scegli attentamente i tuoi anticorpi.
Questa procedura non può essere seguita direttamente da altre procedure, poiché le celle sono irrecuperabili. Al contrario, gli esperimenti paralleli dovrebbero essere programmati.
