Mevcut cilia analizi yöntemleri emek yoğundur ve hataya ve önyargıya eğilimlidir. Yaklaşımımız, olası hataları azaltırken zaman ve çabayı kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu tekniğin sunduğu temel avantaj, artan titizlik ve tekrarlanabilirlik ve nicel görüntü analizidir.
Bu tür bir yaklaşım sadece cilia analizi ile ilgili değildir, aynı zamanda diğer organeller ve sitoskeletal proteinlerle ilgilenenler de dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik sorusuna geniş ölçüde uygulanabilir. Başlamak için, eğitim veri kümesini açın, menüden dosyayı seçin, dışa aktar'ı tıklatın ve dosya sırasından ND dosyası oluştur'u seçin. Eğitim veri kümesini içeren klasörü seçtiğinizde, dosya listesi iletişim penceresinin ortasında açılır.
Açılan menüde en az bir seçenek kullanarak dosyaların organizasyonunu el ile tanımlayın. Seçilen her seçeneğin altına karşılık gelen sayısal değerleri girin ve seçeneklerin seçilmediği her yerde hiçbiri'ni seçin. ND belgesini açmak için dönüştür'ü tıklatın.
Görüntüyü kalibre etmek için görüntünün sol alt köşesindeki ayarlanmamış seçeneğe sağ tıklayın. Belgeyi kalibre edin'i tıklatın, sonra piksel boyutunu tıklatın, değeri girin ve Tamam'ı tıklatın. Görünüm analizi denetimlerini seçin, ikili araç çubuğunu açın ve açılan tüm çerçevelerdeki tek tek siliary yapıları hassas bir şekilde izleyerek cilia'yı elle tanımlamak için nesneyi otomatik algıla veya çiz'i seçin.
Yapay zekayı eğitmek için nis'i seçin. ai, tren segmenti tıklayın. ai tren segmentini açmak için.
ve ardından eğitim için kullanılacak kaynak kanalı seçin. Yapay zekayı eğitmek için uygun GroundTruth ikili dosyalarını seçin. İkili boyuta ve dağıtıma bağlı olarak yapay zekayı eğitmek için gerekli yineleme sayısını seçin, ardından eğitilen AI dosyasını kaydetmek için hedef klasörü seçin ve yazılımı eğitmek için tren'i tıklatın. Bu işlem birkaç saat sürer.
Örneği dönüştürerek daha önce açıklandığı gibi cilia'nın deneysel konfokal görüntülerini açın. TIF dosyalarını ND2 dosyalarına. Açılır pencerede, ilk açılır menüden çok nokta seçin ve görüntülerin toplam sayısına karşılık gelen bir değer girin.
İkinci açılan kutuda dalga boylarını seçin ve değeri klasördeki kanalların toplam sayısına değiştirin. Yazılım, açılır pencerenin sağ alt kısmında bulunan bir dalga boyu seçim penceresinin kilidini otomatik olarak açar. Dalga boyu seçim penceresinde, her kanalın rengini seçmek için renk açılır menüsünü kullanın.
Her kanala ad sütunu altında farklı bir ad sağlayın. Tüm bilgiler güncelleştirildikten sonra dönüştür'ü tıklatın. Görüntüleri daha önce açıklandığı gibi kalibre edin.
Deneysel veri kümesinin piksel boyutunun eğitim veri kümesininkiyle tutarlı olduğundan emin olun. Önceki adımdaki eğitilmiş yapay zekayı kullanarak ilk kanalda cilia'yı tanımlayın. Niş'i açın.
menüden ai, segmenti seçin. ai, ardından kaynak kanallarda AC3'ü seçin. Ardından kaynak kanallarda MCHR1'i seçerek ikinci kanaldaki cilia'yı tanımlayın.
Yazılım etiketli cilia üzerinde ikili çizecektir. Daha sonra yanlış tanımlamalı ikili dosyalar için görüntüleri kontrol edin. Yanlış tanımlamalı ikili dosyaları el ile silmek için ikili araç çubuğunda nesneyi sil'i seçin.
Cilia belirlendikten ve segmentlere ayrıldığında, genel analiz üç aracını kullanarak uzunluklar ve yoğunluklar gibi farklı cilia parametrelerini analiz edin. Menüden görüntüyü seçin ve yeni GA3 tarifine tıklayın. Merkezde boş alan bulunan yeni bir pencere açılacaktır.
GA3, yapay zekaya göre uygun şekilde etiketlenmiş ikili dosyaları otomatik olarak algılar ve ilgili düğümü içerir. GA3 ayrıca görüntülerdeki kanalları otomatik olarak algılar ve sekmelerini kanalların altında görüntüler. Yapay zeka, çerçevedeki nesneler gibi tüm cilia'ları segmentlere ayıracak ve çerçevenin kenarları boyunca tamamlanmamış cilia'yı algılayacak.
Bunları kaldırmak için ikili işlemeyi seçin, nesneleri kaldırın ve sonra dokunan kenarlıklar düğümünü boş alana sürükleyin ve düğümü uygun ikili dosyalara bağlayın. Cilia uzunluğunu ölçmek için ölçüm nesnesi boyutunu ve ardından uzunluğu seçin. Parametreyi merkeze sürükleyip bırakın ve uygun ikili düğüme bağlanın.
Cilia yoğunluklarını ölçmek için bazı nesne yoğunluğu seçin. Parametreyi merkeze sürükleyip bırakın ve uygun ikili düğüme ve ilgi alanı kanalına bağlanın. Ölçüm menüsünde, nesne oranmetrisine gidin ve tek tek cilia içindeki iki kanalın çakışmasını ölçerek GA3'teki colocalization yolunu ayarlamak için Mander'in katsayısını seçin.
Mander'ın katsayı düğümünü boş alana sürükleyip bırakın ve uygun ikili ve kanallara bağlayın. Veri yönetimi menüsünü açarak ölçümleri ve tek tabloyu seçin. Temel kategoride, ApEn sütununu seçin ve sonra cilia'yı ölçmek için Şimdi çalıştır'ı tıklatın.
Tüm ölçümler tek bir çıktı tablosunda görünecektir. Temsili görüntüler, eğitimli yapay zekanın IMCD hücrelerinin, birincil hipotalamik kültürlerin ve hipokampal kültürlerin görüntülerinde cilia in vitro'yu doğru bir şekilde tanımladığını, ancak sitokintik köprüler gibi başka siliyer olmayan yapıların olmadığını göstermektedir. Cilia'nın uzunluğu IMCD hücrelerinde 0,5 ila 4,5 mikrometre, hipotalamik ve hipokampal kültürde ise iki ila 12 mikrometre arasında değişmektedir.
Yapay zeka, arcuate çekirdeğimiz, paraventriküler çekirdeğimiz ve cornu ammonis bir bölgemizin görüntülerinde AC3 etiketli cilia in vivo uzunluklarını ölçtü. Analize göre, hipotalamik cilia in vivo, beyaz ve kahverengi çubuklarda görüldüğü gibi bir ila 15 mikrometre arasında değişiyordu. Cilia ve cornu ammonis bölgesi gri çubuklarda görüldüğü gibi bir ila 10 mikrometre arasında değişmektedir.
İlginçtir ki, siliary MCHR1'in yoğunluğu paraventriküler çekirdekte, arcuate çekirdeğindekinden daha güçlüydü. MCHR1'in AC3'e karşı yoğunlukları çakışmalarını ölçmek için çizildi. Cilia'nın çoğunluğu her iki belirteç için de pozitifken, bazı cilialar AC3 veya MCHR1 için pozitifti.
MTHR1'in AC3 içindeki kolokalizasyonunu ölçmek için Mander'in örtüşme katsayısı ölçüldü ve paraventriküler çekirdekteki örtüşmede arcuate çekirdeğine göre önemli bir artış oldu. Cilia uzunluğu boyunca yoğunluğu ölçmek için, bazal gövde işaretleyicisi olarak Centrin2-GFP kullanılarak cilia polaritesi tanımlanmıştır. Bu, cilia tabanını ARL13B-M kiraz pozitif cilia'nın uçlarından ayırt etmeye izin etti.
Cilia uzunluğu boyunca ARL13B yoğunluğundaki değişiklikler, ARL13B yoğunluğunun tabanda, sağda görüldüğü gibi solda ve PVN'de görülen arcuate çekirdeğindeki ssiyumun ucundan daha yüksek olduğu gözlendi. Bu yaklaşımla verileri analiz ederken, deneysel veri kümesinin kalitesinin ve çözünürlüğünün yapay zekayı eğitmek için kullanılanlarla tutarlı olduğundan emin olmak önemlidir. Bu yaklaşımın ana faydası, cilia'yı yapay zeka tarafından algıladıktan sonra, kullanıcı yazılıma entegre analiz iş akışını özelleştirerek hangi özelliklerin analiz edildiği konusunda yaratıcı olabilir.
