Name: rapid and specific immunomagnetic isolation of mouse primary oligodendrocytes
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes at JoVE.com

Bu çalışmada hibe Ulusal multipl skleroz Derneği (RG4591A1/2) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03NS06740402) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ivan Hernandez ve laboratuvar üyeleri laboratuvar alanı, ekipman ve tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Bu çalışmada kullanılan fareler için SUNY eyalet Tıp Merkezi bölümü, laboratuvar hayvan kaynakları (DLAR) protokol numarası 15-10492 kurallarına göre bakım.
Not: Birincil oligodendrocytes yenidoğan (P5-P7 vahşi tipli C57Bl/6N) izole edildi fareler. Bu aşamada, yüksek hücresel verim sağlamak kemirgen beyaz madde % 80'den fazla olgunlaşmamış OLs oluşturmaktadır. Tüm arabellek ve reaktif kompozisyon Malzemeler tablosonunda mevcuttur.
1. Coverslips hazırlık
Not: Poly-D-lizin (PDL) / kaplı laminin coverslips OL yalıtım önce hazırlanmış.
<ol><li>Yer #1 Alman cam coverslips 50 mL konik tüp içine ve %70 35 mL ekleyin alkol onları temizlemek için.</li>
	<li>Tüp kapatmak, bir nutating Mikser yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya. Coverslips gecede inkübe.</li>
	<li>% 70 alkol atın.</li>
	<li>Coverslips 3 kez deiyonize su ile yıkamak, su vakum aspirasyon ile her zaman kaldır.</li>
	<li>30-35 mL PDL 50 µg/mL coverslips kapsayacak şekilde 50 mL Tüp, yeterince coverslips için ekleyin.</li>
	<li>Coverslips bir nutating Mikser üzerinde içeren 50 mL tüp yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Coverslips vakum aspirasyon ile her zaman su kaldırma 3 kez deiyonize suyla yıkayın.</li>
	<li>Coverslips 60 mm Petri deiyonize su içeren yemekleri aktarın.</li>
	<li>P200 pipet ucu coverslips Petri kabına tüm yüzeyini örten bir katman olarak düzenlemek için kullanın.</li>
	<li>Dikkatle, su yemekleri vakum aspirasyon ile kaldırın.</li>
	<li>Coverslips etrafında su fazlalığı kaldırmak ve onlara gecede açık kapaklı ve UV mahallede ışığı altında kuru. Not: PDL kaplı cam coverslips steril Petri yemeklerinde 4 ° C'de üç aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Coverslips 24-şey levha, her şey, iyi forseps kullanarak bir tane yerleştirin.</li>
	<li>Coverslips de yapma kenarları kuyu duvarı dokunmayın emin merkezine hareket.</li>
	<li>B27NBMA içinde seyreltilmiş 10 µg/mL laminin 100 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek) her coverslip ortasında başlayan ve tüm alanı kapsayacak şekilde kenar kısımlara doğru dairesel şekilde hareket. Not: laminin OL bakım ilgilenmektedir ve farklılaşma olgun OLs içine teşvik, vitro kültür41,42,43,44için önemli bir OL hayatta kalma faktörü çünkü.</li>
	<li>Bir 37 ° C kuluçka OLs kaplama hazır olana veya en az 1 h için % 5 CO2 plaka kuluçkaya.</li>
</ol>2. fare beyin korteksi ayrılma
<ol><li>Doğum sonrası 5-7 günlük eski C57Bl/6N fare pups hızlı işten çıkarma tarafından daha önce % 70 etanol içinde temizlenmiş makas ile kurban. Not: serebral cortices 5-6 yenidoğan fare pups üzerinden her hazırlık için kullanılmıştır. Ortalama olarak, bir fare beyin 1-1.5 x 106 OLs verir.</li>
	<li>Kafa derisi deri orta çizgi boyunca küçük parçalara makasla kesme ve kafatası ortaya çıkarmak için geri çek.</li>
	<li>Kafatası dikkatle arkasında kafatasının ön alan beyin zarar görmesini önlemek için makasla yukarı kaldırarak doğru açılmasını başlayarak orta çizgi boyunca kesin. Sonra kafatasının arkasına açılış kullanarak her göz çukuru kafatasının boyunca doğru kesti.</li>
	<li>İyi forseps yavaşça orta uzak cortices alay ve B27NBMA 7 mL içeren 60 mm doku kültürü yemek için aktarmak için kullanın. 2.2 2.4 ile disseke cortices havuzu her beyin için yineleyin.</li>
	<li>Cortices 5 mL ayrılma arabellek de içeren yeni bir 60 mm doku kültürü tabak transfer (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain ve 2500 U DNaz ben).</li>
	<li>#15 neşter bıçak kullanarak yaklaşık 1 mm3 küçük parçalar halinde cortices zar ve 20 dk bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL sığır büyüme serum (BGS enzimatik reaksiyon durdurmak için) ekleyin.</li>
	<li>Cortices ayrışma media ile birlikte bir 15 mL konik tüp 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak aktarın.</li>
	<li>Yavaşça yavaşça yukarı pipetting tarafından beyin dokusundan ayırmak başlar ve 10 mL serolojik damlalıklı 6 - 8 kez kullanarak aşağı kullanarak bakım baloncuklar en aza indirmek.</li>
	<li>2-3 dakika için yerleşmek ve süpernatant temiz bir tüp aktarmak doku parçaları izin.</li>
	<li>B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/2500 U DNaz ben doku için cips.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting sırasında beyin dokusundan ayırmak için 5 mL serolojik pipet kullanın 6 - 8 kez. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
	<li>Doku parçaları 2-3 dakika için yerleşmek izin verir.</li>
	<li>Süpernatant temiz bir tüp aktarın. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/DNaz ben doku için cips.</li>
	<li>Yavaşça P1000 damlalıklı bahşiş medya karışımı pipetting kullanarak beyin dokusu ayırmak ve beyin dokusu yukarı ve aşağı. Tekrar adımları 2,13 ve 2.14 doku yok büyük boyutta kalıncaya kadar veya B27NBMA kadar % 10 içeren BGS/DNaz yorgun, hangisi ilk olursa. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
	<li>Havuzu hücre süspansiyon ile önceki supernatants.</li>
	<li>50 mL tüp yer 70 µm hücre süzgeç. 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak, havuza alınan hücre süspansiyon yavaşça 70 µm hücre süzgeç geçmek.</li>
	<li>B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS/DNaz ben.</li>
	<li>Hücre süzgeç atmak. 30-%10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS/DNaz ben.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için iki 15 mL konik tüp aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Süpernatant hücre artıkları nedeniyle bulutlu olacak. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS Pelet için.</li>
	<li>Dikkatle P1000 damlalıklı kullanarak hücre Pelet ayırmak. %15 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir taze 40 µm hücre süzgeç geçmek.</li>
	<li>B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS. Hücre süzgeç atmak.</li>
	<li>%30 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için 2 x 15 mL konik tüpler aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Çoğu süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Hücre topakları buz soğuk manyetik hücre (MCS) arabellek sıralama 5 mL resuspend.</li>
</ol>3. hücre sayımı ve Viabilite tespiti
<ol><li>Hücre süspansiyon 100 µL Trypan mavi çözüm 400 µL 1:5 seyreltme %0,4 (w/v) elde etmek için bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ile sulandırmak.</li>
	<li>Bir cam bir hemasitometre odası ve dolgu üzerinde 10 µL P10 pipet kullanarak ve kaçınarak hücre seyreltme ile iki odaları bantlayın ortalayın. Çözüm kılcal eylem tarafından kapak cam altında geçecek.</li>
	<li>Hemasitometre mikroskop sahnesinde yerini ve 40 X büyütme kullanarak odağı ayarlayın. Not: Bir el karşı her beş kareler (dört köşe ve bir merkezi) kullanarak hücre sayısı kaydedilir. Yalnızca uygun olmayan hücreleri boya emer ve mavi, canlı iken görünür ve sağlıklı hücreler yuvarlak ve Refraktif görünür ve bırakmak mililitre başına uygulanabilir ve toplam hücre sayısı tayini için mavi renkli boya absorbe değil.</li>
</ol>4. yalıtım O4+ Oligodendrocytes
<ol><li>Hücre süspansiyon vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak.</li>
	<li>Pelet 90 µL MCS arabelleği başına 1 x 107 toplam hücreleri anti-O4 boncuk 1 x 107 hücre başına 10 µL eklenmesiyle takip resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve boncuk hafifçe parmak ile 15 mL konik tüp 4 - 5 kez flicking tarafından karıştırın.</li>
	<li>4-5 timesevery 15 mL konik tüp parmak ile flicking 4 ° C'de 15 dakika karışımı kuluçkaya 5 dak.</li>
	<li>Karışımı yavaşça tüp 2 mL 1 x 107 hücre başına MCS arabellek ekleyerek yıkayın. 200 x g 10 dk at mix santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant dikkatli vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak. Hücre Pelet MCS arabelleği her 1 x 107 hücreler için 500 µL resuspend.</li>
	<li>Manyetik ayırıcı bir manyetik ayırıcı standına bağlayın. Manyetik ayırıcı için bir seçim sütununu ekleyin ve bir 40 µm hücre süzgeç sütun üstüne yerleştirin. İki 15 mL veya bir 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak için ayırma sütununun altında yerleştirin.</li>
	<li>40-µm hücre süzgeç ve ayırma sütun MCS arabellek 3 mL ile ön durulama ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve boncuk hücre süzgeç ve seçim sütununu içine ekleyin.</li>
	<li>40 µm hücre süzgeç MCS arabelleği 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süzgeç atın ve hücreleri, boncuk ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.</li>
	<li>3 kez ile 3 mL MCS arabellek ayırma sütun ve 1 saat OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile yıkayın.</li>
	<li>Ayrılık sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak, hızlı bir şekilde 15 mL konik tüp içine yerleştirin ve hemen OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya 5 mL ekleyin.</li>
	<li>Üstünde tepe-in belgili tanımlık sütun ve sıkıca bas 15 mL konik tüp etiketli hücrelere dışarı floş için lavabo pompası yerleştirin.</li>
	<li>Hücre sayımı ve canlılığı Trypan mavi ve hemasitometre madde 3 te belirtildiği şekilde kullanarak belirlemek için hücre süspansiyon, 100 µL kaldırın. Not: Hücre canlılığı % 80'i yukarıda OLs kültürü ile devam etmek için kabul edilebilir olarak kabul edilir, ancak canlılığı 90 %'den büyük en uygunudur.</li>
</ol>5. kaplama izole O4+ Oligodendrocytes
<ol><li>Hücre süspansiyon için yoğunluğu (coverslip başına 5 x 105 hücre) kaplama desire seyreltik OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya kullanımı. Not: devam etmeden önce bir doku kültürü mikroskop kullanarak uygun hücre yoğunluğu onaylanması bu yüzden yoğunluğu tohum OL çok önemlidir. Yoğunluk 10.000 hücre/coverslips aşağıda tohum zavallı hücre yaşam için neden olabilir. Yoğunluk için 10.000 25.000, OL, kaplama morfolojik farklılaşma yavaş45yaşında. Hücre hayatta kalmasını sağlamak için en az 50.000 hücreleri/coverslips tohum bir yoğunluk OLs plaka.</li>
	<li>Doku kültürü hood için kuluçka makinesi üzerinden laminin kaplanmış coverslips içeren 24-şey plaka taşımak.</li>
	<li>Laminin her coverslip kaldırın ve OL süspansiyon 100 µL ile değiştirin.</li>
	<li>37 °C/5% CO2 kuluçka en fazla OL yapışma sağlar coverslips tanıtmak için 45 dk OLs kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra 24-iyi tabaklar da kuluçka kaldırın. Her sel de, 500 µL OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile 24-şey plaka.</li>
	<li>OLs 37 °C/5% CO2 kuluçka ek 24 h için geri koyun.</li>
	<li>OLs, kaplama sonra 24 h nükleer silahların yayılmasına karşı medyayı çıkarın ve farklılaşma ikna etmek için OL farklılaşma medya ile yerine.</li>
	<li>OLs da kuluçka makinesine koyun ve hücreleri fiksasyon için hazır olana çıkarmak değil. Not: pH değişiklikleri OLs için zararlıdır ve hücre canlılığı azaltmak, bu nedenle gereksiz kuluçka makinesi OLs kültürler kaldırılması-meli var olmak kaçmak.</li>
</ol>6. ayirt boyama
<ol><li>Hücre tespiti için yüzey işaretleyicileri (NG2, O1 ve O4) kuyulardan medyayı çıkarın.</li>
	<li>Fare Hibridoma supernatants (saf) O113 ve O4 (saf)13 karşı birincil antikor içeren 250 µL ekleyin ve NG2 karşı poliklonal tavşan (1:150 B27NBMA içinde seyreltilmiş). Not: ticari olarak mevcut anti-O1 ve anti-O4 antikorları kullanılacak ise, üretici tarafından önerilen dilutions kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>45 dk 37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine maksimum için birincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>İle iki kez % 0.05 Ara-20/1 X PBS yıkayın. %4 paraformaldehyde ile hücreleri tamir (%4 PFA) Oda sıcaklığında 10 dakika için.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Alexa 488 Birleşik keçi Anti-fare IgM ya da anti-tavşan IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde oranında seyreltin.</li>
	<li>% 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Çift Kişilik iç işaretçileri (GFAP'nin) algılama için boyama için % 0.05 Ara-20/1 X PBS ve blok/permeabilize hücre bloğu/permeabilization arabellek oda sıcaklığında 15 dakika ile kaldırma. Aksi takdirde 6.17 adıma geçin.</li>
	<li>Blok/permeabilization arabellek kaldırın ve 250 µL tavuk anti-blok/permeabilization arabellekte seyreltilmiş GFAP'nin (1: 100) ekleyin.</li>
	<li>Anti-GFAP'nin oda sıcaklığında 1 h için hücrelerle kuluçkaya. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Alexa 594 Birleşik keçi Anti-tavuk IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde sulandırmak.</li>
	<li>% 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>4' ile 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain ve hücreleri DAPI içeren ortam takma antifade ile monte edin.</li>
	<li>Coverslips gecede karanlık oda sıcaklığında tedavi edelim.</li>
	<li>Lekeli hücreleri bir epifluorescence mikroskopla görüntü. Not: Bu protokol için tek tip çekim hızı kullanarak 40 X büyütme oranında hücreleri görüntüsü.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Bu iletişim, biz son derece saf olgunlaşmamış fare oligodendrocyte kültürler verimli yalıtım için bir yöntem mevcut. Daha önce yayımlanmış protokolleri39,40' a göre bu yöntem GFAP'nin pozitif astrocytes çok daha düşük düzeyde ve sigara ile karakterize diğer hücrelerin çok düşük bir yüzde ile daha yüksek bir saflık vermiştir. Bu olgunlaşmamış OLs zaten oligodendroglial soy kararlı olduğunu işaret etmek önemlidir. Böylece, bu hücreler farklılaşma erken aşamalarında çalışma için yararlı olmaz.
Dincman Protokolü40 değişiklikler temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) bizim nükleer silahların yayılmasına karşı ortamdan kaldırılması oldu. Bu bildirilmiştir o vitro, güçlü bir mitogenic faktör olarak rol bFGF sadece OPCs farklılaşma engeller ama aynı zamanda süreçleri46,47sayısını azaltır. Ayrıca, bFGF oligodendrocyte dedifferentiation ve oligodendroglial lineage 48pasajlı hücrelerinde yaygın artırır. Bu nedenle, akla yatkın bu O4 sınırlı sayıda+ hücreleri ve A2B5 artan sayıda+ ve NG2+ Dincman çalışma40 içinde gözlenen hücre kültüründe bFGF etkisi nedeniyle olabilir.
Hücreleri izole için yöntem olarak O4 bağlama kullanarak rağmen sadece %59 hücrelerin O4 olan+ , 1DIV. Bu sonuçlar niteliksel O4 bağlama için yalıtım kullanarak, hücreleri biraz daha az % 50 O4 idi bulan Dincman ve iş arkadaşlarınızla40 benzer+ , 1DIV. PDGF sonrası mitotik geliştirme tarafından gecikmeler gösterilmiştir geçici geri alma O4+GalC- ataları A2B5 için+O4 daha sonra bile devam eden PDGF varlığında- ön progenitor benzeri hücre 49. bu nedenle, ilk gün vitro yayılması işlemi sırasında bazı olgunlaşmamış OLs O4 üzerinden bir ters karşılaşabileceğiniz olası+NG2+ O4 için-NG2+hala kalan taahhüt ederken, oligodendrocyte soy. Bu hipotez O4 olan yalıtım yaklaşık % 80 hücrelerin hemen sonra Dincman'ın bulma40 tarafından desteklenen+.
3DIV bu iletişim kuralı daha biraz daha yüksek bir OL saflık üreten biz kendi yöntemleri ile kafa kafaya bir karşılaştırma yapmak değildi ama başkaları tarafından39,40 tanımladı. Dincman ve ark. protokolü için karşılaştırıldığında 40, GFAP'nin pozitif hücre kültürleri alt sayısı içinde nükleer silahların yayılmasına karşı medya FGF eksikliği nedeniyle olabilir. Emery ve Dugas iletişim kuralı39 ile kültür yemekleri arasında yer alan sıralı geçirilmesi kullanır; astrocytes ve kültür yemekleri50 ' ye kolayca ekleyebilir ve hücreler sıralı her geçiş sonra immunopanning iletişim kuralı sırasında taşınır. Sunulan Yöntem bizim arıtma kesir bulaşıcı astrocytes tanıtan risk değil.
Bizim değiştirilmiş yöntemi daha hızlı gerçekleştirmek için yaklaşık 4 h alarak diğer iki karşılaştırılır. Biz bu gereksiz adımları ve diğer iletişim kuralları tarafından dahil kimyasalları ortadan kaldırarak elde. Örneğin, 5-6 h alır, Dincman Protokolü40' a, göre biz hem sinir dokusu ayrılma bir seti kullanımı ve ölü hücreleri kaldırmak için fare Anti-fare IgM boncuk ile OL hücre süspansiyon kuluçka atlanmış. Bunun yerine, papain ve ölü hücreleri ile cortices düşük hızlı centrifugations (200 x g) gerçekleştirerek çıkarıldı fare beyin ayrılma gerçekleştirilen.
İmmunopanning seçiminizin kaldırılmasını ve Papain arabellek doku sırasında önceden equilibrate için kullanılan O2Co2 direkt gereksinimini kaldırma yaklaşık 9 h alır, Emery Protokolü39, önemli bir değişiklik yapıldı sindirim. Bunun yerine, biz immunomagnetic seçimi ve fare beyin cortices ve Papain tampon karışımı doğrudan kuluçka CO2 kuluçka makinesine kullanılır.
Doğrudan bu çalışmada test rağmen anti-O4 lastikteki OLs sıçan, fare insan ve transgenik beyin dokusundan izole etmek için de kullanılabilir. Bu araştırma laboratuvarları ile OLs fare dışındaki kaynaklardan çalışmak faydalanmak için birden fazla doku kaynağı OLs yalıtım potansiyeli ile kullanmak için teknik çok yönlülük vurgular.
Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan değiştirilmiş OPC yalıtım yöntemi myelination ve hastalık demiyelinizan çalışmalarda uygulanan olabilir birincil fare oligodendrocytes elde etmek için hızlı ve belirli bir alternatif sağlar.

Oligodendrocytes (OLs) merkezi sinir sistemi (MSS)1myelinating hücrelerdir. Yalıtım ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ortamda birincil oligodendrocytes kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra multipl skleroz2 gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç . Bu bir verimli ve sağlam oligodendrocyte yalıtım ve kültür Yöntem3gerektirir. Bu çalışmada, biz hızlı ve belirli bir değiştirilmiş yalıtım tekniği uygulamak için bir ayırt edici oligodendrocyte hücre yüzey marker ifadesi kullandı.
Dört farklı aşamaları oligodendrocyte olgunlaşma tespit edilmiştir, farklı hücre yüzey işaretleyicileri ifade her gelişim aşaması (Şekil 1) için her karakterize. Bu hücre yüzey işaretleyicileri belirli antikor4,5tarafından tanınır ve belirli aşamalarında OLs yalıtmak için kullanılabilir. İlk aşamada, oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) çoğalırlar, göç ve özellikle hızlı trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör (PDGF-Rα)6, gangliosid A2B5, proteoglikan NG27,8 kapasitesine sahiptir. , polysialic asit sinir hücre adezyon molekülü9 ve yağ asidi bağlayıcı protein 7 (FABP7)10. OPCs birkaç kısa işlemler sinirsel öncül hücreleri11karakteristik olan hücre vücudun karşıt direkleri yayılan iki kutuplu morfoloji var.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg"> Şekil 1: fare oligodendrocyte geliştirme sırasında hücre yüzey işaretlerinin ifade. A2B5, GalC (O1) NG2 O4 ve PDGF Rα özellikle oligodendrocytes belirli antikorları kullanarak belirli gelişimsel aşamada yalıtmak için kullanılabilir gibi OLs yüzey işaretleyicileri hücre.   <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
İkinci aşamada, OPCs preoligodendrocytes için ortaya çıkmasına ve hücre zarı hızlı sadece OPC işaretleri, aynı zamanda O4 antikor12,13ve GPR17 protein14, tarafından tanınan sulfatide (sülfürlü galactolipid) Hangi kadar olgunlaşmamış oligodendrocyte (OL) sahne devam ederse. Bu aşamada preoligodendrocytes multipolar kısa işlemler genişletir. Preoligodendrocytes büyük OL sahne olgunlaşmamış OLs15küçük bir nüfusa sahip fare ve fare serebral beyaz madde postnatal gün 2 (P2) bulunmaktadır.
Üçüncü aşamada, olgunlaşmamış OLs O4 hızlı, ifade A2B5 ve NG2 işaretlerinin kaybetmek ve galactocerebroside C16hızlı başlar devam ediyor. Bu aşamada OLs oligodendroglial soy işlenir ve uzun ramified dalları17,18ile sonrası Mitotik hücre olur. Olgunlaşmamış OL teşkil P7, kemirgen beyaz madde % 80'den fazla ve şu anda15,19,20,21ilk MBP+ hücreler gözlenir. Bu nedenle, izolasyon P7, OLs yüksek hücresel verim sağlamak.
OL geliştirme son ve dördüncü aşamada olgun OLs myelinating proteinler (miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), ilişkili miyelin glikoprotein (MAG) ve miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG)22,23 hızlı. ,24,25,26. Bu aşamada olgun OLs Membran Kaplamalar aksonlar çevresinde enwrapping bu formu kompakt genişletmek ve myelinate için edebiliyoruz. Bu fare ve fare beyninde MBP+ hücreleri P1419,20,21, giderek bol olmak gözlem ile örtüşmektedir.
Oligodendrocyte Fewster ve 196727meslektaşları tarafından ilk yalıtım beri kemirgen CNS OLs, izolasyon için çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere immunopanning28,29,30hayata geçirdik, floresans aktif hücre hücre yüzey özgü antijenlere28,31, farklı degrade Santrifüjü32,33,34,35 istismar (FACS) sıralama ve farklı CNS glia36,37fark bağlılık dayalı sallayarak yöntemi. Ancak, mevcut kültür yöntemleri kısıtlamaları, saflık, verim ve38yordamları gerçekleştirmek için gereken süre açısından özellikle bulunmaktadır. Bu nedenle, daha verimli izolasyon yöntemleri oligodendrocytes için gereklidir.
Bu yazıda, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Bu yöntem Emery vd tarafından bildirilen teknikleri bir değişiklik olduğunu 39 ve Dincman vd. 40 ve %80 4 h yukarıda bir oligodendrocyte hazırlık saflık sağlar.

<table><tbody><tr><td>10ml serological pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10ml syringe Luer-Loc tip</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&amp;micro;m cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml serological pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60mm tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&amp;micro;m cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Growth Serum (BGS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Feather disposable scalpels</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antibody</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separator stand - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separator-MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&amp;micro;m filter unit</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media- Prolong Gold with DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Natural mouse laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca2&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; and Mg2&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selection column-LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Trace elements B</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodothyronine (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum</td></tr><tr><td>CNTF solution stock (10 &amp;micro;g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer&amp;rsquo;s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 &amp;deg;C.&lt;br/&gt; Working solution (10 &amp;micro;g/ml, 1000X)&lt;br/&gt; 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.&lt;br/&gt; 2. Dilute master stock aliquot to 10&amp;micro;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.&lt;br/&gt; 3. Aliquot (20&amp;micro;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.&lt;br/&gt; 4. Store aliquots at -80 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>d-Biotin stock solution (50 &amp;micro;g/ml; 5000X)</td><td></td><td></td><td>Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 &amp;micro;g/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37&amp;deg;C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10&amp;micro;g/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I stock solution</td><td></td><td></td><td>1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.&lt;br/&gt; 2. Filter sterilize on ice&lt;br/&gt; 3. Aliquot at 200 &amp;micro;l and freeze overnight at -20&amp;deg;C.&lt;br/&gt; 4. Store aliquots at -20 to -30&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+)</td><td></td><td></td><td>Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 &amp;micro;l) and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salts (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 &amp;deg;C) in a cylinder and stir gently.&lt;br/&gt; 2. Add the power and stir until dissolved.&lt;br/&gt; 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.&lt;br/&gt; 4. Add to the solution in step 2.&lt;br/&gt; 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.&lt;br/&gt; 6. Keep stirring until dissolved.&lt;br/&gt; 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.&lt;br/&gt; 8. Add additional water to bring the final volume to 1L.&lt;br/&gt; 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.&lt;br/&gt; 10. Store at 2-8 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Insulin stock solution (4000 &amp;micro;g/ml)</td><td></td><td></td><td>Thaw the bottle and aliquot 25 &amp;micro;l per microcentrifuge tube and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Laminin solution</td><td></td><td></td><td>Slowly thaw laminin in the cold (2&amp;deg;C to 8&amp;deg;C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5&amp;deg; C to -20&amp;deg; C in aliquots (e.g. 20 &amp;micro;l) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.</td></tr><tr><td>Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5&amp;micro;g/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 &amp;micro;m Millex filter. Store the buffer at 4&amp;deg;C until use</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 &amp;micro;l). Store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>NT3 stock solution (1 &amp;micro;g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Master stock:&lt;br/&gt; Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&amp;rsquo;s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80&amp;deg;C.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; Working stock (1&amp;micro;g/ml; 1000X):&lt;br/&gt; 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.&lt;br/&gt; 2. Dilute master stock aliquot to 1 &amp;micro;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.&lt;br/&gt; 3. Aliquot (e.g. 20&amp;micro;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.&lt;br/&gt; 4. Store aliquots at -80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>PDGF stock solution (10 &amp;micro;g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Master stock:&lt;br/&gt; Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer&amp;rsquo;s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80&amp;deg;C.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; Working stock (1&amp;micro;g/ml; 1000X):&lt;br/&gt; 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.&lt;br/&gt; 2. Dilute master stock aliquot to 1&amp;micro;g/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.&lt;br/&gt; 3. Aliquot (e.g. 20&amp;micro;l/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.&lt;br/&gt; 4. Store aliquots at -80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X)</td><td></td><td></td><td>Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100&amp;micro;l/tube). Store at -20&amp;deg;C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 &amp;micro;g/ml in sterile water.</td></tr><tr><td>Oligodendrocyte proliferation media</td><td></td><td></td><td>see &lt;a href=&quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;Supplementary Table 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oligodendrocyte differentiation media</td><td></td><td></td><td>see &lt;a href=&quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;Supplementary Table 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sato supplement (100X)</td><td></td><td></td><td>see &lt;a href=&quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx&quot;&gt;Supplementary Table 1&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. &amp;amp; Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. &amp;amp; Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and specific immunomagnetic isolation of mouse primary oligodendrocytes

Verimli ve sağlam yalıtım ve birincil oligodendrocytes (OLs) kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra, multipl skleroz gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç ve Pelizaeus-Merzbacher-gibi hastalığı (PMLD). İşte, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Olgunlaşmamış OL teşkil beri fazla bu yalıtım Yöntem sadece sağlar yüksek hücresel verim % 80 Doğum sonrası gün 7, kemirgen-beyin beyaz maddenin (P7), aynı zamanda zaten oligodendroglial soy taahhüt OLs belirli yalıtım, azalan astrocytes gibi bulaşıcı hücreleri ve diğer hücrelerden fare beyin izole imkanı. Bu yöntem daha önce rapor teknikleri bir değişiklik olduğunu ve oligodendrocyte hazırlık saflık yaklaşık 4 h % 80 oranında yukarıda sağlar.

Bu çalışmada O4 için geliştirilmiş yalıtım yöntemini kurmak oldu+ hedef hücreleri en olası manipülasyon gerektiren birincil fare oligodendrocytes. Kaplama coverslips hücrelerinin tüm yordamına ötenazi ve yavrularını üzerinden yaklaşık 4 h alır ve burada gösterilen veriler üç bağımsız deneyler temsil eder. Doku ayrılma sonra ortalama 4.3 ± 0,46 x 107 hücre her bağımsız deneme için % 91'i ± %5,6 canlılığı ile izole edildi. Anti-O4 kullanarak immunomagnetic yalıtım manyetik lastikteki öğesini sonra ortalama 6.9 ± 0,38 x 106 OLs elde edilmiştir (1-1.5 x 10 fare6 ) olduğu %16,2 ± %1,6 Toplam hücre başlangıçta ayrışmış; canlılığı %96,3 ± % 3,5 yapıldı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig2.jpg"> Resim 2: Immunomagnetically izole OLs ifade olgunlaşmamış işaretleri, 1DIV. (A)OLs faz kontrast mikroskop Haritayı çift ve üç kişilikli morfoloji altında. OLs hızlı NG2 (B), O4 (C) ve O1 (D). Çok az astrocytes 1DIV mevcuttu (C, kırmızı), ölçek çubuğu 50 µm. = 3 bağımsız deneylerden toplanan verileri. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
İmmunomagnetically izole hücre antijenik fenotip incelemek için ayirt boyama gerçekleştirilen 24 s (1DIV) ve 72 h (3DIV) hücreleri kaplama sonra yapıldı. 1DIV, hücre bı - ya da tripolar (Şekil 2A-B), faz kontrast mikroskop altında olduğu ortaya çıktı bir karakteristik özelliği erken evre OLs (OPCs ve preoligodendrocytes) Proliferasyona. Bu hücrelerin % 66,1 ± 8.4 NG2 etiketli (Şekil 2B) ve hücrelerin % %58 ± 9.4 O4 etiketli (Şekil 2C) idi. O1 (GalC)-etiketleme, bir işaret oligodendrocyte soy daha olgun hücrelerinin çok daha az yaygın (%7,4 ± %6.0, Şekil 2B). Bu marker profil hücreleri çoğunluğu bu noktada öncesi oligodendrocytes daha küçük yüzdeleri olgunlaşmamış ve olgun oligos ve muhtemelen bazı oligodendrocyte progenitör hücreler (OPCs) ile olduğunu göstermektedir. Astrocytes, boyama, 0,57 ± %1,0 (Şekil 2C) oluşan GFAP'nin tarafından kanıtladığı gibi. Bu veriler değiştirilmiş tekniği ile izole oligodendrocytes yüksek oranda saflaştırılmış ve çoğunluk ifade deseninin bir işaretçi için tipik bir olgunlaşmamış oligodendrocytes göstermek öneririz.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig3.jpg"> Şekil 3: ifade 3DIV, Olgun OLs işaretlerinin. (A)OLs faz kontrast mikroskop göstermek daha karmaşık morfoloji altında. 3DIV, NG2 ifadesi, (B) azalır ölçüde, O4 (C) ve O1 (D) artış. Kaç astrocytes 3DIV görülebilir (C, kırmızı), ölçek çubuğu 50 µm. = 3 bağımsız deneylerden toplanan verileri. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Oligodendrocyte morfoloji 3DIV, 1DIV, hücreleri daha karmaşık ortaya çıktı (Şekil 3A). Zaman bu noktada, hücreleri için erken oligodendrocyte işaretçisi NG2 çok daha düşük karşılaştırıldığında 1DIV. NG2 etiketli hücreleri olumlu sıklığını 31.2 ± %17,1 oluşur (karşı 66,1 ± 8.4 oranında 1DIV, t-test p < 0,0001, Şekil 3B, Şekil 4A). Her ne kadar burada analiz değil, hücrelerdeki NG2 için pozitif olarak kabul boyama ortalama yoğunluğu 3DIV 1DIV için karşılaştırıldığında, düşürüldü. En hücreleri (%81.9 ± %4.884, Şekil 3 c) O4-1DIV daha yüksek olan etiketleme, gösterdi (%58 ± % 9.4, t-test p < 0.0001, Şekil 4B). Ayrıca, neredeyse yarım hücreleri (%47.2 ± % 16.4, şekil 3D) O1 için boyama gösterdi (GalC), bir işaretleyici hücreleri daha olgun bir fenotip ayırt düşündüren daha olgun oligodendrocyte soyundan. O1 artış+ 3DIV hücreleri de önemli 1DIV için göre (% %7,4 ± 6.0, t-test p < 0.0001, Şekil 4 c). Varlığı astrocytes bu kez son derece düşük kaldı noktası (% 0,8 ± %1,5, Şekil 3 c) ve 1DIV için karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı değildi (%0,57 ± % 1.0, önemli değil (ns), Şekil 4 d). Bu sonuçlar zaman içinde izole immunomagnetically oligodendrocytes olgunlaşma astrocytes gibi diğer hücre tiplerinin çok az kirlenme ile üç aşaması içine vitro ayırt etmek mümkün olduğunu gösteriyor.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig4.jpg"> Şekil 4: miktar ifade 1DIV ve 3DIV OL işaretlerinin (A-D). 1DIV %66 hücre NG2 idi+, hücrelerin % 58 olduğunu O4+, hücrelerin % 7 idi O1+ ve hücrelerin % 0.5 idi GFAP'nin+. 3DIV hücrelerin % 31'i NG2 vardı+, hücrelerin % 81'i edildi O4+, hücrelerin % 47 idi O1+ ve hücrelerin %0,7 GFAP'nin+. Ortalama değerleri ± SD burada, sunulan *** p gösterir < 0.0001, ns = önemli değil. Veri 3 bağımsız deneylerden toplanmıştır. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57543/57543fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes at JoVE.com

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Görüntüleme.  State University of New York Downstate Medical Center. Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Video: Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Nörobilim

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Tüm CNS Yerleşik Hücre Tiplerinin Otoimmün Farelerden Aynı Anda İzole Edilmesi

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate the still unknown etiology of MS in order to develop new treatment strategies. The myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) EAE model reproduces a self-limiting monophasic disease course with ascending paralysis within 10 days after immunization. The mice are examined daily using a clinical scoring system. MS is driven by different pathomechanisms with a specific temporal pattern, thus the investigation of the role of central nervous system (CNS)-resident cell types during disease progression is of great interest. The unique feature of this protocol is the simultaneous isolation of all principal CNS-resident cell types (microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and neurons) applicable in adult EAE and healthy mice. The dissociation of the brain and the spinal cord from adult mice is followed by magnetic-activated cell sorting (MACS) to isolate microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and neurons. Flow cytometry was used to perform quality analyses of the purified single-cell suspensions confirming viability after cell isolation and indicating the purity of each cell type of approximately 90%. In conclusion, this protocol offers a precise and comprehensive way to analyze complex cellular networks in healthy and EAE mice. Moreover, required mice numbers can be substantially reduced as all four cell types are isolated from the same mice.

Yazar Spotlight: Tüm Ana CNS'de Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu Yoluyla Nöroinflamatuar Yolların İncelenmesi 

To date, protocols for the simultaneous isolation of all principal central nervous system-resident cell types from the same mouse are an unmet demand. The protocol shows a procedure applicable in na&#239;ve and experimental autoimmune encephalomyelitis mice to investigate complex cellular networks during neuroinflammation and simultaneously reduce the required mice numbers.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

İn Vitro Deneyler için MACS Kullanılarak Farelerden Hipotalamik Mikroglia İzolasyonu

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

Microglia, as the resident macrophages of the brain, are essential for maintaining brain homeostasis. They shape neuronal circuits during development, survey their environment for debris or dead cells, as well as respond to infection and injury in the brain, among many other functions. However, their important role in neurodevelopment and synaptic plasticity and pathophysiology has not been fully defined, highlighting the need for further investigation. To gain a more comprehensive understanding of the role of microglia in these processes, we need to isolate microglia and characterize them genetically, metabolically, and functionally. However, the isolation of microglia from adult mice, especially from small brain structures, is challenging as they represent a small percentage of the total brain cells, and the yield of isolated microglia is often too low. Here, the magnetic isolation of microglia using CD11b+ microbeads allows us to sort microglial cells from the hypothalamus of a freshly perfused adult mouse brain. The current method allows us to achieve relatively high purity and yield in a short period while maintaining cell viability.

Yazar Spotlight: Beslenmenin Fare Beyin Fonksiyonu ve Metabolik Bozukluklar Üzerindeki Etkisinin Araştırılması 

We describe a protocol for isolating microglial cells from the mouse hypothalamus (or equivalent small brain structures) using magnetically activated cell sorting (MACS), in a relatively short time. The MACS-sorted hypothalamic microglia can be used for ex vivo analysis and can be plated to perform in vitro assays.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Microglia, as the resident macrophages of the brain, are essential for maintaining brain homeostasis. They shape neuronal circuits during development, ...

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu