يسمح هذا البروتوكول بالكشف السريع والسهل عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة، ضمن مجموعة متنوعة من المساعي البحثية. ويمكن استخدام هذه الطريقة في اضطراب التي تؤثر على الأجسام القاعدية من أهداب الأولية. ويمكن أيضاً تطبيق هذا الإجراء على تلطيخ الأهداب الأولية في الأنسجة المدمجة البارافين أو لتجارب أخرى حيث يلزم التألق.
تبدأ autoclaving 22 في 22 ملليمتر غطاء زلات ، وإعداد المواد اللازمة للتجربة. ذوبان FBS والبنسلين ستريبتوميسين، ودفء الثقافة المتوسطة لدرجة حرارة الغرفة. مرور الخلايا مع التربسين EDTA وPS.
إعداد 4٪ paraformaldehyde الطازجة، والثقافة المتوسطة، و 1٪ حل الجيلاتين، وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم تنظيف غطاء محرك تدفق الفاتن مع 70٪ الإيثانول، ووضع جميع المواد المطلوبة داخل. ما قبل الفورمالدلديهايد هو خطير للغاية.
يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات ، ويجب التعامل معها فقط في غطاء كيميائي. بعد تزايد الخلايا المطلوبة إلى التقاء 70٪ إزالتها من الحاضنة، ووضعها في غطاء محرك التدفق الفاتنة. إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
إضافة حوالي ملليلتر من 0.25٪ التربسين EDTA إلى قارورة الثقافة، واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحقق من الخلايا بشكل دوري على المجهر المقلوب لمراقبة الانفصال. عندما تكون الخلايا قد فصلت بلطف resuspend لهم في 10 ملليلتر من ثقافة المتوسطة، pipetting بعناية لخلق تعليق خلية واحدة.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر والطرد المركزي في 200 مرة G'لمدة خمس دقائق. decant المابير ثم إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة، وبلطف resuspend بيليه. خذ 20 ميكرولترات من تعليق الخلية ومزجها مع الأزرق trypan بنسبة حجم واحد إلى واحد.
ثم عد الخلايا باستخدام قياس الهيموسيت القياسي. وضع زلة غطاء داخل كل بئر من ستة صحن البئر، ومعطف زلة الغطاء مع مليلترين من الحل الجيلاتين، والتي سوف تساعد الخلايا تعلق على زلة الغطاء. إزالة الجيلاتين والسماح لوحة الهواء الجاف لبضع دقائق.
بذور 100،000 الخلايا الليفية في كل بئر وإضافة ملليلتر من الثقافة المتوسطة. ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة النسبية 90٪. بعد الحضانة علاج الخلايا للحث على ciliation.
ادفأ 4٪ من الـ paraformaldehyde إلى درجة حرارة الغرفة، واحضر ماصات المراعي، وABS، وحاوية نفايات، 15 ملليلتر أنابيب مخروطية، ماصات صغيرة، ونصائح. خذ الخلايا من الحاضنة، ووضعها على مقعد المختبر. إزالة الوسائط من كل بئر، وترك زلة الغطاء.
غسل الخلايا بلطف ثلاث مرات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. ثم أضف مليلترين من 4٪ PFA في كل بئر لإصلاح الخلايا. احتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة PFA، وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني.
إضافة ملليلترين من 0.5٪ تريتون X-100 إلى كل بئر، واحتضان لوحة لمدة 15 دقيقة. ثم غسل الآبار أربع مرات مع برنامج تلفزيوني. لجعل حل الحجب، ذوبان مصل الماعز لمدة خمس دقائق، وتمييع في برنامج تلفزيوني بنسبة 1-20.
إضافة 150 ميكرولترات من هذا الحل إلى كل زلة الغطاء، واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة. اذيب الأجسام المضادة الأولية لمدة خمس دقائق، وتمييعها بشكل منفصل في PBS، كما هو موضح في المخطوطة النص. قم بإزالة حل الحظر من قسائم الغطاء وأضف 150 ميكرولترات من كلا الحلين المضادين.
ثم احتضان لوحة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل بلطف زلات الغطاء ثلاث مرات مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. تمييع Cy3 الأغنام المضادة للماوس واليكسا فلور 488 الماعز المضادة الأرنب في برنامج تلفزيوني، بنسبة واحد إلى 300، وإضافة 150 ميكرولترات من كل من الحلول المضادة الثانوية لزلة الغطاء.
إعداد حل DAPI العمل عن طريق تخفيف 10 ميكرولترات من المخزون في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلترين من هذا التخفيف إلى زلات الغطاء. احتضان لوحة لمدة خمس دقائق في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. قبل وضع زلات الغطاء على الشرائح، قم بإعداد إبرتين، ملاقط، ووسائط متصاعدة، وتسمية جميع الشرائح.
إزالة حل DAPI من الآبار، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. وضع قطرة واحدة من وسائط متزايدة على كل شريحة. استخدم الإبرة لرفع زلة الغطاء بلطف من أسفل البئر.
ثم الوجه ووضعها بلطف على قطرة من تصاعد وسائل الإعلام باستخدام الملاقط. إزالة بعناية أي فقاعات. حماية الشرائح من الضوء وتخزينها بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي استخدام المجهر الفلورسنت أو confocal مع التكبير عالية لتصور أهداب الأولية. تم استخدام هذا البروتوكول لإصلاح مناعية، وصورة مختلف خطوط الخلية التعبير عن أهداب الأولية. عندما تعرضت الماوس myoblasts للإشعاع المؤين في جرعات مختلفة، وجد أن جرعات أعلى تحفز ظهور الإهداب الابتدائية متعددة.
في حين أن الجرعات المنخفضة أسفرت عن ظهور أهداب أولي واحد. وبالمثل، عندما كانت الخلايا الليفية الرئة البشرية تشع بجرعة منخفضة، تم الكشف عن أهداب أولي واحد عن طريق الفلوروس. لوحظت زيادة في الإهداب الأولية في الخلايا الليفية الجنينية الماوس التي كانت جائعة، مما يدل على أن الإجهاد الأيضي يؤثر على حوادث أهداب الأولية.
عندما تم علاج الخلايا الليفية الجلدية بـ 120 دوكسوروبيسين نانومولاري، أعربوا عن سيليوم أولي واحد. جرعات أعلى تحفز ظهور الإهداب الابتدائية المتعددة. الليفية تعامل مع 1.25 نانومولار تاكسول أعرب أيضا عن cilium الأولية واحدة.
ولكن لم يتم الكشف عن العديد من الأهداب بعد العلاج بجرعات أعلى. عند فتح هذا البروتوكول تأكد من اتباع جميع لوائح PPE. نضع في اعتبارنا احتياجات الثقافة من خط الخلية الخاصة بك من اختيار واختار الأجسام المضادة بعناية.
ولا يمكن اتباع هذا الإجراء مباشرة بإجراءات أخرى، لأن الخلايا لا يمكن استرجاعها. وبدلا من ذلك، ينبغي برمجة التجارب المتوازية.
