Name: inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX at JoVE.com

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.

1. İlgi Genleri Almak <ol><li> Sentetik genleri tasarla. <ol><li> E. coli ekspresyonu için bir gen dizilimi optimize edin. </li><li> Seksten herhangi bir problemli kısıtlama yerini (AvrII, NdeI, EcoRI ve XbaI) çıkarın. </li><li> Klonlama için kısıtlama alanlarını ekleyin; Bir 5&#39;-NdeI bölgesi ve bir 3&#39;-EcoRI bölgesi önerilmektedir. Gerekirse başka siteler de kullanılabilir; Seçilen plazmitin çoklu klonlama bölgesine ( Şekil S1- S4 ) bakın. İsterseniz, Western blot algılaması için 5 &#39;veya 3&#39; kodlama etiketi ekleyin. </li><li> Tasarlanan geni ticari olarak sipariş edin. </li><li> Ya üreticinin talimatlarına göre geni kör bir klonlama kiti kullanarak künt bir vektöre köreltin; Geni yükseltmek için primerleri tasarımlayın (ardından Adım 1.2.2&#39;ye geçin); Veya bir pMGX plazmidine direkt klonlama için ek 5 &#39;ve 3&#39; uçları ekleyin ve Adım 2&#39;ye geçin.Temsilci sonuçlar ilgi genlerini kör bir klonlamaya dayanır. </li></ol></li><li> İstenilen geni (tasarımlanmış ve optimize edilmiş sentetik gen veya istenen geni içeren şablon DNA&#39;dan) amplifiye edin 15 . <ol><li> Klonlama için kısıtlama alanları olan tasarım primerleri; Bir 5&#39;-NdeI bölgesi ve bir 3&#39;-EcoRI bölgesi önerilmektedir. Gerekirse başka siteler de kullanılabilir; Seçilen plazmitin çoklu klonlama bölgesine ( Şekil S1- S4 ) bakın. İsterseniz, Western blot algılaması için 5 &#39;veya 3&#39; kodlama etiketi ekleyin. </li><li> PCR istenen geni çoğaltın 15 . </li><li> PCR&#39;ı agaroz jel elektroforezi ile analiz edin 16 . </li><li> Belirgin olmayan bir amplifikasyon varsa, genleştirilen geni jel özütleme ile temizleyin. Değilse, bir enzim temizleme kiti kullanın. </li><li> Bir spektrofotometre kullanarak DNA&#39;yı absorbanc&#39;ı kontrol ederek ölçünE 260 nm&#39;de; Elüsyon tamponlu boş 17 . </li></ol></li></ol> 2. İlgi Genleri Bir Multigen Ekspresyon Sistemi Vektörüne Klonlama, pMGX 18 <ol><li> Kısıtlama, elde edilen geni ve istenen vektör olan pMGX&#39;yi NdeI ve EcoRI ile sindirir. NOT: Çok miktarda tekrar sirkülale edilmiş plazmid elde edilirse, EcoRI eklemeden önce NdeI reaksiyonunun 1 saat devam etmesine izin verin. <ol><li> 0.5-1.5 μg DNA ve uygun olan 10x tamponun 4 μL&#39;si ile her bir enzimden 1 uL içeren 40 uL&#39;lik bir sindirim reaksiyonu kullanın. </li><li> NdeI ve EcoRI sindirimi için EcoRI tamponu kullanın ve önce NdeI endonükleaz ekleyin. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca özümleyin. Ardından EcoRI endonükleaz ekleyin ve sindirimin bir saat daha ilerlemesine izin verin. NdeI, DNA&#39;nın sonuna yakın bölünmelere duyarlıdır, bu yüzden EcoRI&#39;nin ilk sindirimi NdeI&#39;nin etkili sindirimini önleyebilir. </li></ol></li><li> ElektrOphorese agaroz jel üzerindeki kısıtlama sindirimini (1 kb&#39;lik bir gen için, 55 dakika için 110 V&#39;da% 0,7 agaroz jel kullanın; farklı gen boyutları için agaroz jel yüzdesini seçmek için, referans 16&#39;ya bakın. </li><li> Temiz bir neşter veya bıçak bıçağı kullanarak ek parça ve vektör bantları tüketim yapın ve kesilen jel segmanını 1.5 mL tüp içine yerleştirin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı agaroz jelden ayıklayın. </li><li> İlgili geni pMGX vektörüne, 3: 1 insert-vektör oranı kullanarak ligate edin; Eklemesiz sindirilmiş pMGX negatif bir ligasyon ayarlayın. <ol><li> 1 μL T4 DNA ligaz, 0.15-0.5 μg vektör DNA&#39;sı (~ 5 μL) ve insertin uygun bir miktarda 3: 1 insert-to-vektör oranına ve boyutuna dayalı 20 μL ligasyon reaksiyonu oluşturun Gen eklenir; PMGX omurgaları boyutu 5,312 ile 5,504 bp arasındadır. Her şeyi içeren olumsuz bir kontrol reaksiyonu ekleyin.Gen eklendi. Vektör DNA miktarının negatif kontrol ligasyonunda ve vektör artı ligasyon reaksiyonlarında eşdeğer olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Ligasyon reaksiyonlarını, XL1-Blue kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerine ve ligandlı plazmidler pMGX- yfg1 (ilgi geni içeren), pMGX- yfg2 (ilgi geni içeren) ... pMGX- yfgn (ilgilenilen geni içeren n). Aseptik tekniği kullanın (biyogüvenlik kabininde veya alev altında). <ol><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde kimyasal olarak yetkili XL1-Blue E. coli 100 mcL alikotları çözülmüş ve sonra ligasyon reaksiyonları 5 mcL ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C&#39;de tutulan su banyosunda 45 saniye boyunca hücrelere ısı ile çarpın ve daha sonra 200 μL soğuk LB ekleyin. 2 dk buzda inkübe edin. </li><li> Hücreleri 1 saat boyunca 37 ° C, 220 rpm&#39;de çalkalayın ve daha sonra bir plakayı içeren bir LB-agar plakasına 100 ulPriate seçilebilir markeri (ya ampisilin ya da kanamisin). </li></ol></li><li> Pozitif transformantlar için klonları tarayın. <ol><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayılarını karşılaştırın. 1: 2&#39;den büyük bir koloni sayımı aralığı istenir. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 2.1&#39;e dönün ve notu gözden geçirin. </li><li> Tarama için eklenen farklı genlerin (1 n) her ligasyon tepkimesinden 4-8 bireysel koloni (negatif kontrol bağlı olarak: ligasyon oranı) seçin ve 4 mL LB ve uygun antibiyotik gece kültür / bireysel koloni inoküle edin. Gece boyunca 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de sallayarak kültürleri büyütün. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin. </li><li> 150-500 ng DNA ve her bir enzimden 1 uL uygun 10x tampon ile 2 μL içeren 20 uL NdeI + EcoRI sindirim reaksiyonu oluşturun. InciDurumda, ilgili genin sınırlama siteleri arasında olması için NdeI ve EcoRI&#39;yi ekleyin. Boş pMGX vektörü ile negatif bir kontrol önerilir. 37 ° C&#39;de 2 saat su banyosunda sindirin. </li></ol></li></ol> 3. Gen 2&#39;yi Gen 1 içeren pMGX Vektörüne Ekleme , pMGX- yfg1 <ol><li> Restriksiyon, pMGX-yfg1&#39;i AvrII ile sindirecek ve buzağı bağırsak fosfatazı (CIP) ile muamele edecektir . <ol><li> 0.5-1.5 μg vektör DNA&#39;sını (izole edilmiş DNA ~ 5-10 uL) ve uygun 10x tampon maddenin 4 uL&#39;si ile 1 μL AvrII içeren bir 40 μL sindirim reaksiyonu kullanın. 37 ° C&#39;de 1.5 saat sindirin ve sonra 1.5 μL CIP ekleyin. 30 dakika daha 37 ° C&#39;de bırakın. </li></ol></li><li> İlgili geni serbest bırakmak için AvrII ve Xbal ile kısıtlama pMGX-yfg2 sindirin . <ol><li> 0.5-1.5 μg DNA ve 1 μ içeren bir 40 μL sindirim reaksiyonu kullanın; Her bir enzimin L&#39;si, uygun 10x tamponun 4 uL&#39;si ile. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca özümleyin. </li></ol></li><li> Uygun bir yüzde (% 0.7) agaroz jeli üzerinde elektroforez kısıtlaması sindirilir ve temiz bir neşter / bıçak bıçağı kullanarak ekleme ve vektör bantlarını çıkarır (bkz. Adımlar 2.2-2.3). </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı ayıklayın ve DNA 17&#39;yi ölçün. </li><li> 3: 1 insert-vektör oranı kullanarak gen 2&#39;yi pMGX- yfgl&#39;e ligate edin . Sindirilmiş pMGX- yfg1&#39;in negatif bir bağlanmasını ilave ek olmadan yapın. Yukarıdaki gibi Adım 2.5&#39;te ayarlayın. </li><li> Bağlama reaksiyonlarının 5 μL&#39;sini XL1-Blue kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerine, ligandlı plazmidler pMGX- yfg1,2&#39;ye (ilgilenilen geni içeren 1 ve 2 geni) ve negatif pMGX- yfg1 kontrolüne, Adım 2.6&#39;da görüldüğü gibi çevirin . </li><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayısını karşılaştırın. Bir koloni sayı oranı gReaktan 1: 2&#39;den daha arzu edilir. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 3.1&#39;e dönün ve CIP tedavisini gözden geçirin. </li><li> Ligasyon reaksiyonundan 4-8 bireysel koloniyi (negatif kontrol: bağlanma oranına bağlı olarak) seçin ve bireysel koloni başına 4 mL LB artı uygun antibiyotik aşılayın ve gece boyunca 37 ° C ve 220 rpm&#39;de büyütün. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin ve DNA 17&#39;yi ölçün. </li><li> EcoRI ile pMGX- yfg1,2&#39;nin bir kısıtlama sindirimini uygulayarak ikinci genin etkili bir şekilde eklenmesini ekranlayın . <ol><li> 150-500 ng DNA ve 1 μL EcoRI enzim içeren 2 uL EcoRI 10x tampon içeren 20 uL sindirim reaksiyonu kullanın. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca özümleyin. </li></ol></li><li> Uygun bir yüzde agaroz jel üzerinde elektronforasyon kısıtlama sindirimi; Karşılık gelen bir grup arayınS gen 2 boyutuna (bkz. Adım 2.2). Bir gen vektör içine istenmeyen ters yönde yerleştirilebilir. </li></ol> 4. Genler 1 ve 2&#39;yi içeren pMGX Vektörüne Üçüncü Bir Genin Eklenmesi, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Restriksiyon sindirimi pMGX- yfg1,2 , AvrII ile gerçekleştirin ve Adım 3.1&#39;de görüldüğü gibi CIP ile işleme sokun . </li><li> Adım 3.2&#39;de görüldüğü gibi AvrII ve XbaI ile kısıtlama sindirimi pMGX- yfg3 . </li><li> Elektroforez, uygun bir yüzde agaroz jelinde kısıtlama sindirerek temiz bir neşter / bıçak bıçağı kullanarak ekleme ve vektör bantları tüketmek; Adımlar 2.2-2.3&#39;e bakın. </li><li> Jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı agaroz jelden ayıklayın ve DNA&#39;yı nicelleştirin 17 . </li><li> 3: 1 insert-vektör oranı kullanılarak gen 3&#39;ü pMGX-yfgl.2&#39;ye bağlayın ve Adım 3.5&#39;te görüldüğü gibi ilave bir ekleme olmadan sindirilmiş pMGX- yfg1,2&#39;nin negatif bir ligasyonu oluşturun. </li><li> Ligasyon reaksiyonlarının 5 μL&#39;sini XL&#39;ye çevirinAdım 2.6&#39;da görüldüğü gibi, 1-Mavi kimyasal olarak yetkili E. coli hücreleri, ligand plasmid pMGX- yfg1,2,3 (1, 2 ve 3 ilgi genleri içerir) ve negatif pMGX- yfg1,2 kontrolü. </li><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayısını karşılaştırın. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 4.1&#39;e dönün ve CIP tedavisini gözden geçirin. </li><li> Ligasyon reaksiyonundan 4-8 bireysel koloni seçin (negatif kontrol: bağlanma oranına bağlı olarak) ve her koloni için uygun antibiyotik artı 4 mL LB&#39;yi inoküle edin; Gece boyunca 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de büyür. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin. </li><li> Adım 3.10&#39;da görüldüğü gibi EcoRI ile pMGX- yfg1,2,3&#39;ün bir kısıtlama sindirimini uygulayarak üçüncü genin etkin şekilde eklenmesini ekranlayın . </li><li> Uygun bir yüzde agaroz jel üzerinde elektronforasyon kısıtlama sindirimi; bakGen 2 ve gen 3 boyutlarına karşılık gelen bantlar için (bkz. Adım 2.2). Not: gen 3 vektör içine istenmeyen, ters yönde yerleştirilebilir. Genler 2 ve 3 aynı büyüklükte ise, tarama için başka bir uygun kısıtlama sindirim bölgesi seçilmelidir. NOT: Her bir yeni gen için gerektiği gibi tekrarlayın. </li></ol> 5. Çok Boyutlu Bir İfade Sistemi Kullanarak Proteinlerin Üretilmesi ve Üretimin Batı Lekeleme ile Değerlendirilmesi <ol><li> İlgili tüm genleri içeren pozitif klon, kimyasal olarak yetkin, protein üreten E. coli&#39;ye , örneğin BL21- (λDE3) dönüştürülür. <ol><li> 5 dakika süreyle kimyasal olarak yetkili BL21- (λDE3) E. coli&#39;nin 100 uL&#39;lik kısımlarını çözündükten sonra pozitif klonlanmış plazmid DNA&#39;sının 1 uL&#39;ini ekleyin; Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Isı hücrelerini, 42 ° C&#39;de tutulan bir su banyosu içinde 45 s boyunca şoklayın ve daha sonra 200 μL soğuk LB&#39;yi ekleyin. Buz üzerinde 2 dakika inkübe edin. </li><li>Hücreleri 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de 1 saat boyunca çalkalayın ve daha sonra uygun seçilebilir işaretleyiciyi (ya ampisilin ya da kanamisin) içeren bir LB agar plakasına 100 ul plakaya yayın. </li></ol></li><li> Proteini, izopropil-β-D-l-tiogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu ile ifade edin. <ol><li> B21- (λDE3) transformasyon plakasından izole edilmiş bir koloni seçin ve 4 mL LB ve uygun antibiyotiği inoküle edin; Gece boyunca büyür, 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de çalkalama. </li><li> 100 mL&#39;lik bir LB&#39;yi ve 1 mL&#39;lik gece kültürü kullanılarak uygun antibiyotik kültürü inoküle edin. </li><li> 37 ° C&#39;de büyütün ve 220 rpm&#39;de çalkalayarak OD 600&#39;ü 0.6&#39;ya getirin. </li><li> Kültürü 100 uM IPTG ile indükleyin ve 25 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de 15 saat büyütün. </li><li> Kültür 1 ml çıkarın ve 1 dakika için 13.000 xg de santrifüj; Süpernatanı atın. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre lizis çözeltisini kullanarak hücreleri LyseVe tüm proteinlerin başarılı bir şekilde üretilip üretilmediğini belirlemek için çözünebilir hücre lizatı için bir Western leke hazırlayın 19 . </li></ol>

<ol>
	<li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+wave+of+synthetic+biology:+from+modules+to+systems.">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li><li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway.">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li><li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids.">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li><li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli.">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li><li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli.">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li><li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli.">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li><li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylneuraminic+Acid+Production+in+Escherichia+coli+Lacking+N-Acetylglucosamine+Catabolic+Machinery.">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li><li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts:+experimental+procedures,+database+tracking+and+case+studies.">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li><li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli.">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Kim, K. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes.">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li><li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li><li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector.">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016)</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016)</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birden fazla genin ortak ekspresyonu, özellikle karmaşık, multigenik metabolik yolları karakterize etme ve yeniden yapılandırmada 3 , 4 , 5 için giderek daha fazla önemlidir. PMGX sistemi E. coli rutininde 6 , 7 , 8 randevularında multijen ortak ekspresyonu yapar ve çeşitli araştırmacılar tarafından erişilebilir durumdadır. Bu çalışmada, ilgilenilen beş proteinin aynı anda pMGX-A kullanılarak tek bir plasmid sisteminden üretildiği gösterilmiştir. Halihazırda bulunan bir çok ekspresyon sistemi, pET Duet vektörleri 12 gibi bisistronik plazmidleri üreten iki genin eklenmesine izin verir. Biri daha fazla gen eklenmesini gerektiriyorsa, farklı seçilebilir markerlere sahip birden çok bicistronic vektör gerekir. Diğer multigen sentezleme sistemlerinin aksine, pMGX sistemi kolay klonlamaya izin verirBirden fazla genin bir plasmid içine yerleştirilmesi, farklı verici plazmidlere ihtiyaç duyulmaksızın kısıtlama bölgelerinin yeniden kullanılması veya genlerden alınan çoklu restriksiyon enzim yerlerinin çıkarılması için 13 , 14 . Bu protokolün kritik adımları, gen tasarımı, tekli sindirilmiş pMGX vektörlerinin arka plan sirkülerleşmesini önleme ve eklenen genin doğru yönlendirilmesi için polisistronik vektörlerin ekranlarını içerir. Bir polisistronik sistem oluşturmak için klonlama stratejisini planlarken, ilgilenilen genlerin aşağı doğru klonlama için gerekli kısıtlama alanlarını içermediğinden emin olmanız önemlidir. Özellikle, bunlara, ilgi konusu ilk geni içeren pMGX vektörüne ikinci ve sonraki genlerin eklenmesi için gereken XbaI ve AvrII dahildir (3. ve 4. Adımlar). Ek olarak, g&#39;nin ilk klonlanması için kullanılacak olan kısıtlama alanlarının ortadan kaldırılması esastırPMGX&#39;ye ilgi (Adım 2). Tipik olarak bunlar, genin 5 &#39;ucunda NdeI veya NheI&#39;i ve genin 3&#39; ucunda BamHI veya EcoRI&#39;yi içerir, ancak gerektiğinde diğer kısıtlama alanları bu adım için de kullanılabilir. Fazla, istenmeyen kısıtlama alanlarının elimine edilmesi, gen sentezi aşamasında veya başka kaynaklardan klonlanmış genlerde, alan yönelimli mutajenez yoluyla eşanlamlı nükleotid ikameleri ile kolaylıkla gerçekleştirilebilir 20 . İlgi konusu geni içeren pMGX&#39;e sonraki ilgi genlerinin ilavesi, pMGX-yfgl&#39;in AvrII ile doğrusallaştırılmasını gerektirir (Adım 3.1; XbaI ile de lineerleştirilebilir). Bu doğrusallaştırılmış vektör, ikinci genin eklenmesi sırasında (Adım 3.5) hızlı bir şekilde religate olur ve bu da son derece yüksek sayıda arka plan klonuna yol açar. Bunu önlemek için doğrusallaştırılmış vektörü bir fosfataz ile işleme tabi tutarak 5&#39;in fosforilatlanması gereklidir2; Doğrusallaştırılmış vektörün uçları. Diğerleri mevcut olmasına rağmen, tipik olarak CIP kullanılır. Fosfataz ünitelerinin ve kuluçka süresinin optimizasyonu, sonraki genlerin doğrusal vektör içine bağlanmasını optimize etmek için gerekebilir. Son olarak, bir polisistronik sistem üretirken, ilgilenilen gen başlangıçta XbaI ve AvrII ile sindirim yoluyla eksize edilir ve genin 5 &#39;ve 3&#39; uçlarında tamamlayıcı kohezif uçlar oluşur (Adım 3.2 ve 4.2). Bu insert ileriye veya ters yönde doğrusal vektör içine bağlanabilir. Bütün kohezif uçlar aynı olduğu için, kohezif uçların tamamlayıcı tavlaması yoluyla herhangi bir yönelim uygulanmaz. Bu nedenle, sonuçta bulunan klonların ilgi geninin doğru ekleme yönü için taranması gereklidir. Bu, orijinal geni pMGX&#39;e klonlamak için kullanılan kısıtlama sitelerinden biriyle klonların taranmasıyla kolaylıkla yapılabilir (Adım 2). Tipik,EcoRI, kısıtlama alanı genin 3 &#39;ucunda olduğu için kullanılır ve dolayısıyla Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi yönlilik için tarama yapılması uygundur. Çoğu durumda, ilgilenilen geni içeren klonların% 50&#39;si doğru oryantasyona sahiptir ve% 50&#39;sinin zıt yöndeki geni vardır. Seyrek olarak (ligasyonların ~% 10&#39;u), belirli bir ligasyondaki tüm klonların ilgi geni tek yönde eklenebilir. Bu sonuç, sekansa bağımlıdır, çünkü bu belirli durumlarda çoğaltılabilir. Eğer bu olur ve ilgilenilen gen sürekli olarak ters yönde yerleştirilirse, istenen vektöre klonlama yönü değiştirilerek erişilebilir. Örneğin, yfg2&#39;yi pMGX- yfgl&#39;in AvrII sitesine klonlamak yerine, yfgl , pMGX-yfg2&#39;nin XbaI bölgesine klonlanabilir. Bunun, aynı son vektörü verdiğini unutmayınsistemi. Farklı klonlama stratejilerinden aynı sisteme erişimi sağlayan bu ek esneklik son derece avantajlıdır. Bu metodolojinin önemli bir kısıtlaması, polisistronik transkriptin 3 &#39;ucunda kodlanan proteinlerin, tipik olarak, transkriptin 5&#39; ucunda kodlanan proteinlerden daha düşük seviyelerde eksprese edilmesidir ve bu etki, transkriptin uzun süreyle . Bu, sentetik operonda ilgi konusu genlerin sırasının değiştirilmesinin, kodladığı proteinlerin göreceli ekspresyon seviyelerini etkileyebileceği ve göreli ekspresyon seviyelerinin hassas ayarlanmasına yönelik bir mekanizma sağladığı anlamına gelir. Özetle, pMGX sistemi, çeşitli sentetik biyoloji uygulamaları için ve biyokimyasal yol karakterizasyonu için kullanılabilen, E. coli&#39;deki tek bir plazmitten çoklu proteinlerin birlikte ekspresyonu için güvenilir bir yöntem sağlar.

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, özellikle sentetik biyoloji uygulamalarında, birden fazla fonksiyonel modülün ifade edilmesi gerektiği durumlarda giderek önemlidir; Protein-protein kompleksleri üzerinde çalışırken, ekspresyon ve fonksiyonun sık sık birlikte ifade etmesini gerektirir 2 , 3 ; Ve patolojideki her bir genin 4 , 5 , 6 , 7 , 8 olarak ifade edilmesi gereken biyosentetik yolları karakterize etme ve harekete geçirme. Özellikle konakçı organizma Escherichia coli , laboratuvar rekombinant protein ekspresyonu için çalışma atında, birlikte ifade için bir takım sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, farklı seçilebilir işaretleyicilere sahip birden fazla plazmid, farklı ex miktarları kullanılarak bireysel proteinleri ifade etmek için kullanılabilir<html> Baskı vektörleri 10 , 11 . Çoklu protein ekspresyonu için tekli plazmid sistemleri, her bir gen 10 , 12&#39;nin ekspresyonunu kontrol etmek için çoklu promotörleri kullandı; Sentetik operanlar, burada birden fazla gen tek bir kopyada kodlanmıştır 2 , 13 ; Veya, bazı durumlarda, nihai olarak proteolitik olarak işlenmiş, ilgilenilen istenen proteinleri üreten bir polipeptidi kodlayan tek bir gen. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir polisistronik vektörün yapımını gösteren pMGX iş akışı. PMGX sistemi, indüklenebilir bir T7 promoterinin kontrolü altındaki sentetik operonların oluşturulması için esnek ve kullanımı kolay bir strateji sağlar.E-posta: e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimeraz ( Şekil 1 ) kontrolü altında multijene sentetik operonların inşası için oldukça etkili bir sistemin kullanımı açıklanmaktadır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Başlangıçta pKH22 olarak adlandırılan, 6 , 7 , 8 numaralı farklı uygulamalar için başarıyla kullanılan bir plazmid sistemini temel alır. Burada, bu plazmid seti, dört ilgili vektörü içerecek şekilde genişletilir: pMGX-A, herhangi bir C veya N-terminal etiketi içermeyen bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-hisA, bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-K, bir ifade vektörüC veya N-terminal etiketlerini ve kanamisin direnç işaretleyicisini ölçmek; Ve bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve kanamisin dirençli markör olan pMGX-hisK. Bu çalışmada, pMGX sistemi, özellikle pMGX-A kullanılarak beş gen ihtiva eden bir polisistronik vektör üretme yöntemi, her bir proteinin Escherichia coli&#39;de başarılı bir şekilde üretilmesi ile birlikte gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, sentetik biyoloji, protein-protein kompleksleri ve biyosentetik yolların belirlenmesi ve işlenmesi için gittikçe zorunludur. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimerazın kontrolü altında multigen sentetik operonların oluşturulması için oldukça etkili bir sistemin kullanımı anlatılmıştır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Burada, hem ampisilin hem de kanamisin direnci seçilebilir markeri (A ve K) olan ve ya bir N-terminal hekzahistidin&#39;e sahip olan ya da olmayan bir dizi dört ilgili vektör, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K ve pMGX-his Etiket (onun) ifşa edilmektedir. Bu vektör sistemi kullanılarak sentetik operonların inşası için ayrıntılı protokoller, beş gen ihtiva eden bir pMGX tabanlı sistemin Escherichia coli&#39;de beş şifrelenmiş proteinin her birinin üretilmesi için kolayca oluşturulabileceğini ve kullanılan olabileceğini gösteren karşılık gelen verilerle birlikte sağlanmaktadır. Bu sistEm ve protokolü, araştırmacıların E. coli&#39;deki karmaşık çok bileşenli modülleri ve yolakları rutin olarak ifade etmelerini sağlar.

Bu çalışmada, amaç, tek bir plazmitten beş proteinin birlikte ekspresyonu yapmaktı. N-veya C-terminalli hekzahistidin etiketlerini kodlayan beş kodon optimize edilmiş sentetik gen fragmanları ticari olarak satın alınmıştır. Sentetik genler PCR ile amplifiye edildi ve ayrı ayrı bir PCR-künt vektör içine klonlandı ve sekanslandı. Polisistronik plasmid üretmek için, ilgilenilen beş gen uygun bir pMGX plazmidi, pMGX-A&#39;ya klonlandı. Şekil 2 , NdeI + EcoRI ile sindirilmiş pMGX-A&#39;ya ek olarak PCRBlunt- yfgl ve PCRBlunt- yfg2&#39;yi göstermektedir (bkz. Adım 2). İlk iki geni pMGX-A&#39;ya klonlamak için plazmid NdeI + EcoRI ile sindirildi ( Şekil 2 ). İlgilenen genlerin pMGX-A&#39;ya klonlanmasından sonra, pMGX- yfgl ve pMGX- yfg2 olarak adlandırılan yeni oluşturulmuş plasmidler, başarılı klonların elde edildiğini teyit etmek için AvrII + Xbal ile sindirilmiştir;Şekil 3&#39;te elde edilen 1.1-kb ve 1.3-kb bantlarında gösterilmiştir. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig2.jpg" /> Şekil 2: pMGX plazmidlerinin klonlanması. NdeI + EcoRI ile sindirildikten sonra yfgl ve yfg2&#39;yi içeren PCR-blunt plazmidlerin beklenen sonuçları,% 0.7 agaroz jelinde (110 V, 55 dak.) Gösterilmektedir. Lane 1, 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2, PCRBlunt- yfgl ; Şerit 3, PCRBlunt- yfg2 ; Şerit 4, pMGX-A kontrolü. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig3.jpg" /> Şekil 3: pMGX- yfgl ve pMGX- yfg2&#39;nin taranması. % 0.7 agaroz jeli (110 V, 55 dak.) Gösterir<html> AvrII + XbaI ile sindirim yapıldıktan sonra hem pMGX- yfgl hem de pMGX- yfg2 tarafından üretilen iki bant. Şerit 1, 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2, pMGX- yfgl ; Şerit 3, pMGX- yfg2 ; Şerit 4, pMGX-A kontrolü. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Her iki gen de uygun pMGX vektöründe polisistronik plazmid oluşturuldu. PMGX- yfgl.2 plasmidini üretmek için, pMGX- yfgl , Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi AvrII ile sindirildi. PMGX- yfg2 , AvrII + XbaI ile sindirildi ve fragmanı içeren 1.3 kb geni, pMGX- yfgl , 2 üreten doğrusallaştırılmış pMGX- yfgl&#39;in AvrII bölgesine bağlandı . PMGX- yfgl&#39;in , EcoRI ile sindirimi, istenen plazmitin başarılı bir şekilde klonlanmasını doğruladı ve&gt; Şekil 5. <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig4.jpg" /> Şekil 4: Biistronik plazmid pMGX- yfg1,2&#39;nin üretilmesi. % 0.7 agaroz jel elektroforezi, AvrII ile sindirilmiş pMGX- yfgl ve AvrII + Xbal ile sindirilmiş pMGX- yfg2&#39;yi (110 V, 55 dakika) verir. Şerit 1, 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2, AvrII ile sindirilmiş pMGX- yfg1 ; Şerit 3, AvrII + Xbal ile sindirilmiş pMGX- yfg2 ; Şerit 4, pMGX-A kontrolü. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig5.jpg" /> Şekil 5: pMGX- yfg1,2 klonlarının taranması . Ortaya çıkan% 0.7 agaroz jeli (110 V, 55 dakika) pMGX- yfEcoRI ile sindirilmiş g1,2 klon gösterilmiştir. Başarılı klonlar, biri takılmış gen yfg2 ve diğeri omurgaya + yfg1 ( pMGX-yfg1 ) karşılık gelen iki bant oluşturur. Lane 1, 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2, EcoRI, klon 1 ile sindirilmiş pMGX- yfgl.2 ; Şerit 3, EcoRI, klon 2 ile sindirilmiş pMGX- yfgl.2 ; Şerit 4, pMGX-A kontrolü. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> İki veya daha fazla gen içeren bir polisistronik plazmid üretilirken, AvrII bölgesine klonlanmış genin istenmeyen bir ters yerleştirilmesi ile karşılaşılabilir. Şekil 6 , ters yönde yerleştirilen bir gene kıyasla, doğru yönde yerleştirilmiş bir gen ile sindirilmiş bir plazmidin sonuçları arasındaki farkı vurgulayan bir jeldir. Eğer genBağlanmamış ve istenmeyen oryantasyonda klonlanmışsa, genin sonundaki EcoRI bölgesi, önceki genin EcoRI sitesinin hemen yanına eklenecektir. Bu, DNA jel elektroforezi (50 bp&#39;den daha düşük) tarafından neredeyse saptanamayan bir parçacık boyutu elde eder. Ek olarak, son yerleştirilen gen, omurga boyutunda beklenenden daha büyük olduğu için kolaylıkla tanımlanabilen omurgada görülecektir. Omurga boyutunun beklenen boyuttan farkı, son eklenen genin boyutunu gösterecektir. <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig6.jpg" /> Şekil 6: pMGX- yfgl-5 klonlarının taranması . EcoRI ile sindirilmiş pMGX- yfgl-1&#39;in sonuçlarını gösteren bir% 1.3 agaroz jeli (110 V, 65 dakika) gösterilmektedir. Başarılı klonlar (şerit 2) en son girilen gene karşılık gelen bir bant oluşturur (bu durumda yfg5 , 1.1 kb). Lan1, 1-kb DNA merdiveni; Şerit 2, EcoRI ile sindirilmiş pMGX- yfgl-5&#39;in pozitif klonu; Şerit 3, EcoRI ile sindirilmiş pMGX- yfgl-5&#39;in negatif klonu; Şerit 4, pMGX- yfgl- 4 kontrolü. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Beş genli polisistronik ifade vektörünü tamamlamak için geri kalan üç gen, pMGX- yfgl -5 oluşturmak için birbiri ardınca pMGX- yfg1,2&#39;ye klonlandı (bkz. Adım 5). Bu plazmid daha sonra BL21- (λDE3) &#39;e dönüştürüldü ve proteinlerin ekspresyonu, log-orta faz kültüründe IPTG eklenerek indüklendi. Şekil 7 , tek bir operanda çoklu gen içeren tek bir plazmitten beş proteinin tümünün eksprese edilebildiğini teyit eden hücre lizatlarının bir Batı lekesi olduğunu gösterir. PMGX- yfgl&#39;in (1 gen ihtiva eden) ekspresyonu,PMGX- yfgl , 2 (2 gen içeren) ve pMGX- yfgl- 5 (5 gen içeren) gösterilmektedir. <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig7.jpg" /> Şekil 7: pMGX sistemi kullanılarak çoklu gen ekspresyonunun Western blot analizi. Hem N- hem de C-terminal hekzahistidin etiketlerinin birleştirilmesi, protein ifadesinin Western leke bulgulamasını sağladı. Numuneler, önceden döküm% 4-20 gradyan gerilimsiz akrilamid jelleri (200 V, 35 dak, 10 cm x 8.5 cm) ve daha sonra bir nitroselüloz zara (0.45 um, 10 cm x 7 cm) uygulanmıştır. İkincil bir antikor gerektirmeyen HRP-eşlenimli anti-His monoklonal antikoru kullanıldı. Engelleme, transfer ve antikor seyreltme tamponları, antikor üreticisi tarafından tavsiye edildiği gibi hazırlandı. Tespit, Western Chemiluminescent HRP substratı ile imalatçının insleri izleyerektalimatların. Nihai membran, bir filtre olmadan bir görüntüleyiciyi kullanarak görselleştirildi. Şerit 1, ikili renk standardı zar üzerine aktarılır (kimyasal parlak değil); Şerit 2, His6pMGX- yfgl ; Şerit 3, His6pMGX- yfgl, 2 ; Şerit 4, His6pMGX- yfgl-5. Not: Yfg5 tarafından üretilen protein, yfgl tarafından üretilen (her ikisi de 36 kDa) protein ile aynı boyuttadır ve jel üzerinde ayrıştırılamaz. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/55187fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Göstergeler: <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55187/supplemental_figure_S1_jove.pdf">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX at JoVE.com

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli&#39;de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Görüntüleme.  University of Ottawa.  Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır. 

Video: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Genetik

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Biyokimya

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Biyomühendislik

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Biyoloji

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

İndüklenebilir Tet-On Düzenlenebilir Sistem Tabanlı In Vivo: Fare Modelinde Hedef Gen Transkripsiyon Aktivasyonu için Tetrasiklin Kaynaklı Bir Gen Ekspresyon Sistemi

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...