Bu yöntem, araştırma veya endüstride uygulama için ilgi rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yardımcı olabilir. Ana avantajı rekombinant RNA kolayca ölçeklendirilebilir ucuz bir süreç içinde Escherichia coli üretilmektedir. Daha da önemlisi, RNA homojenliğe saflaştırmayı kolaylaştıran dairesel bir RNA iskelesi üzerinde üretilir.
DNA veya proteinlerin aksine, rna'lar biyofabrika sistemlerinde, böyle bir Escherichia coli kültüründe kolayca üretilmez. Yöntemimiz, son derece istikrarlı bir dairesel iskeleye yerleştirilen ilgirRRr'In ortak ifadesine ve RNA daireselleşmesine aracılık eden bir ligaz uygulanmasına dayanmaktadır. Dairesel RNA iskelesi patentli bir viroidden türeyen bir iskeledir.
Viroidler nispeten küçük, kıvrımsız, yüksek baz eşleştirilmiş dairesel RNA'lar bazı yüksek bitkilere bulaşıcıdır. Düzenli laboratuvar koşullarında bakteri kültürünün litre başına rekombinant RNA miligramonlarca üretebilir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi PCR tarafından cDNA'yı yükseltin.
Daha sonra, 0.5 mililitrelik bir tüp e plazmid pLELVd-BZB 100 nanogram ekleyin. Tip IIS restriksiyon enzimi BpiI 10 U ekleyin ve 20 mikrolitre reaksiyon oluşturmak için yeterli tampon G. Plazmidi sindirmek için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Bundan sonra, PCR ve sindirim ürünleri elektroforez ile TAE tampon yüzde bir agarose jel ayrı. 200 mililitre ethidium bromür mililitre başına 0,5 mikrogram konsantrasyonda sallayarak jel leke. UV transilluminator kullanarak, DNA'yı görselleştirin.
Güçlendirilmiş cDNA ve BpiI sindirilmiş plazmid karşılık gelen bantları kesmek için bir neşter kullanın. Silika jel sütunları kullanarak, jel parçaları NDAN NA'ları uzaklaştırın. DNA konsantrasyonunu spektrofotometrik analizle ölçün.
Güçlendirilmiş cDNA ve sindirilmiş plazmid kullanarak Gibson Montaj reaksiyonu ayarlayın. Bir saat liğine 50 derecede kuluçkaya yat. Sonra, reaksiyon arındırmak için bir silika jel sütun kullanın.
Yetkili E.coli DH5-Alfa Hücreleri elektroporating sonra, birkaç beyaz koloniler seçin ve sıvı LB orta aktarın. Kolonileri bir gecede 37 derecede büyütün. Daha sonra, plazmidleri arındırmak için bir miniprep kiti kullanın ve TAE tamponyüzde bir agarose jel elektroforez ile boyutlarını analiz.
İlk olarak, seçilen E.coli türünü, patlıcan tRNA ligazını birlikte ifade etmek için rdna'ya karşılık gelen cDNA'yı ve plazmid P15LTRNISM'i içeren pLELVd-BZB türevi ile birlikte elektroporate. Hücreleri kurtarmak için soc sıvı ortamını elektroporasyon cuvette'sine aktarın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram içeren LB katı ortamda bakteri plaka.
Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram içeren 250 mililitre sıvı TB ortamını bir litrelik şaşkın Erlenmeyer şişesine ekleyin. Kuluçkaya yatan E.Coli'yi alın ve sonra bir koloni seçin ve şişedeki ortamı aşılayın.
Bakterileri hasat etmeden önce 180 RPM'de 12 ila 16 saat boyunca güçlü bir şekilde sallayarak 37 derecede kuluçkaya yatırın. Hasat edilen E.Coli kültürünü 250 mililitrelik bir santimetre şişeye dökün ve 14,000 G'de hücreleri 10 dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant atın ve su 30 mililitre hücreleri resuspend.
Bu süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve önceki koşulları kullanarak hücreleri tekrar aşağı çevirin. Supernatant atın ve hücre pelet kromatografi tampon 10 mililitre ekleyin. Vortex arabellekteki hücreleri yeniden askıya almak için.
Fenol bir hacim ekleyin: kloroform ve girdap şiddetle hücreleri kırmak için. Sonra, 12, 000 G'de 10 dakika santrifüj. Sulu fazı geri kazanım, bir hacim kloroform ekleyin ve girdap şiddetle.
12,000 G'de 10 dakika santrifüj. Bundan sonra, RNA preparatını 45 mikrometreşırık filtresinden filtreleyin. Sıvı kromatografi sistemine bağlı bir mililitre likit etanol amin sütunu kullanarak RNA'yı arındırın.
Akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın ve kolonu 10 mililitre kromatografi tamponuyla dengeleyin. Daha sonra, örnek yük ve kromatografi tampon 10 mililitre ile sütun yıkayın. 20 mililitre elütion tamponu ile RNA elute ve bir mililitre aliquots toplamak.
İki boyutlu poliakrilamid jel elektroforez kullanarak dairesel RNA'ları doğrusal benzerlerinden ayırır. İlk olarak, TBE tampon yüzde beş poliakrilamid jel hazırlamak ve metin protokolünde belirtildiği gibi sekiz azı üre içeren. 20 mikrolitre RNA preparatını bir hacim yükleme tamponuyla karıştırın.
Bir ısıtma bloğunda 95 derecede 1,5 dakika kuluçkaya yat, sonra da buzüzerinde soğutun. Örnekleri poliakrilamid jeline yükleyin ve elektroforezi jel boyutu için uygun koşullarda çalıştırın. Bundan sonra, 15 dakika boyunca mililitre ethidium bromür başına 0,5 mikrogram jel leke.
Lekeli jeli suyla yıkayın ve Uv ışığı altında RNA'yı görselleştirin. Farklı cDNA'ların yerleştirildiği çeşitli rekombinant plazmidlerin elektroforetik analizi pLELVd-BZB ile karşılaştırıldığında farklı göçler göstermektedir. pLELVd-BZB'nin, ilginin RNA'sına karşılık gelen cDNA ile değiştirilen lacZ işaretçisini içerdiğini unutmayın, bu nedenle geçiş eklenen cDNA'nın boyutuna bağlı yken, rekombinant plazmidler genellikle kontrol plazmidinden daha hızlı göç eder.
Co-elektroporated bakteri kültürlerinde rekombinant RNA üretimi hücreleri kırma ve PAGE denatüre tarafından RNA analiz tarafından izlenir. Farklı RNA'ların yerleştirildiği boş ELVd ve şemerik ELVd formlarına karşılık gelen güçlü bantlar görülebilir. İlginçtir, rekombinant RNA önemli bir kısmını dairesel bir form olarak görülüyor.
Ana fraksiyonun daireselliği, yüksek ve düşük iyonik mukavemette denatüre koşullar altında iki PAGE kombinasyonu kullanılarak gözlenir. RNA preparatı, aniyon değişimi kromatografisi ile daha da saflaştırılabilir. Burada görüldüğü gibi, E.Coli RNA verimli düşük iyonik mukavemette tutulur, ve daha sonra yüksek iyonik mukavemette eluted, RNA çoğu kesirler iki ve üç toplanan ile.
Rekombinant RNA 2-B elektroforez ile homojenliğe daha da arındırılabilir. Bu protokol, escherichia coli'de büyük miktarlarda rekombinant RNA'nın kolay üretilmesine ve nihai ürünün daireselliği sayesinde homojenliğe saflaştırılmasına olanak sağlar. Bir bitki viroidinden elde edilen dairesel Bir RNA iskelesine gömülü rna faiz sonuçları olduğunu unutmayın.
Her iki moieties ayırmak istiyorsanız, küçük RNA büyük olanlardan daha yüksek miktarlarda üretilmesi muhtemeldir, bu protokolün verimi ilgi belirli RNA bağlıdır ribozymes, DNAzymes veya RNase H.The gibi standart bir strateji kullanmanız gerekir. Daha büyük ölçekli ifadeler için, bakterileri hasat etmek için en uygun zamanın E.Coli suşu, kültür ortamı ve yetiştirme koşulları gibi birçok faktöre bağlı olduğunu göz önünde bulundurun. Özel koşullarınızda en uygun üretim penceresini bulmak için bir ön zaman kursu tgelincesi öneririz.
Rekombinant RNA'ların bakteri hücrelerinde geçici olarak biriktiğini ve geç büyüme evresinde tamamen yok olduklarını unutmayın.
