Name: controllable ion channel expression through inducible transient transfection
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Bu eser (AP) İsrail Bilim Vakfı [Hibe 1721-1712, 1368-1312 ve 1444/16] tarafından desteklenmiştir. AP Brettler Merkezi ve David R. Bloom Center, Eczacılık Fakültesi, Kudüs İbrani Üniversitesi ile bağlanmıştır.

1. Vektör Baskılanabilir Site içine İlgi Gene bağlanması <ol><li> / TO gibi pcDNA5 / FRT / TO veya pcDNA4 olarak bir aşılanabilir vektör edinin. </li><li> Siliko DNA analiz yazılımı 4 ile aynı zamanda seçilen vektörünün çok sayıda klonlama bölgesi yer almaktadır genin ortasında potansiyel olarak duyarlı restriksiyon siteleri için ilgi konusu geni analiz edin. </li><li> Kullanma bindirici PCR teknikleri 4, (ilgili genin içinde bulunmayan) seçilen iki sınırlama enzimi tanıma mevkileri ile ilgili geni başlangıç kodonundan önce yerleştirilmiş birinci ve durdurma kodonundan sonra ikinci kanat. </li><li> vektör hem Digest ve öz önlemek için, sadece 30 dakika boyunca vektörü reaksiyonuna bir birim dana bağırsağı fosfatazı (CİP) ilave edilir, bir saat boyunca enzimlerin çalışma sıcaklığında, önceki (adım 1.2 seçilen) restriksiyon enzimleri ile ekleme ligasyon. </li><li>Bir% 1 agaroz jeli üzerine sindirilmiş DNA yükleyin ve elektroforez 9 parçalanabilen segmentleri ayırın. </li><li> UV ışığı ile, bir bıçak ile vektörün istenen bölümleri içeren jel parçaları kesilmiş ve lige edilmesi yerleştirin. </li><li> (Ticari mevcut DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak) agaroz jel parçalarından DNA parçalarını Özü ve 260 nm&#39;de spektrofotometre ile nihai konsantrasyonu ölçmek. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında T4 ligaz enzimi kullanılarak uyarılabilir seçilen vektör içine ilgili geni Arter. insertin 1 mol oranı l: vektör inserti vektörü ile bağlanması olasılığını artırmak amacıyla bir 3 kullanın. Kontrol için, sadece vektör içeren bir ligasyon reaksiyonu hazırlar. </li><li> Bakteriyel transformasyon için, 50 uL E.coli içine, tek başına vektör ve vektör + geni 10 ng ekleyin. 42 ° C&#39;de 45 saniye kuluçkaya bırakma takip 30 dakika boyunca buz üzerinde tüp inkübe edin. Hemen geri koyunİki dakika boyunca buz üzerinde ve 500 uL LB ortamında dönüştürülmüş bakteri aktarın. 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Başarılı bir şekilde transforme edilmiş bakterilerin seçimi için, uygun bir antibiyotiği içeren bir hazır LB agar plakası üzerinde (1.9 de tarif edildiği gibi), her bir reaksiyonun plakası 100 uL (örneğin, 100 ug / ml ampisilin pCDNA4 / TR kullanarak). </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca büyümeye olanak sağlar. Plakalar sıkıca plastik parafın film sarılarak iki haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> 10 uL ucunu kullanarak ayrı ayrı koloniler kaldırın ve 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de + Antibiyotik Orta 3 ml LB, gece boyunca büyümeye olanak sağlar. ilgi DNA Bakteriler dondurulabilir (-20 ° C) 11.000 xg&#39;de LB ve bakteri santrifüj ve süpernatant dışarı aspire kısa süreli depolama için. Uzun süreli depolama -80 ° C&#39;de gliserol stoklan halinde bakteri dondurma gerektirir. </li><li> throu DNA Özügh mini hazırlık ve 260 nm 5 de spektrofotometre ile nihai konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Saflaştırılmış yapı 4 sıralanmasıyla ilgi konusu genin başarıyla girilmesi kontrol edin. Seçenek olarak ise, bir kısıtlama kesim parçalarını ayırmak ve varlığını değerlendirmek için elektroforez ile enzim ve uzunluğu yapının tanısal sindirimi bu son 4 yararlanılabilir. </li></ol> TetR ifade 2. Kültürleme Hücre Hatları <ol><li> kendi genomik DNA içine dahil bir tet plazmid bir hücre kültürü hattı elde edilir. Burada protokol bir örnek olarak pcDNA6 / TR plazmid İnsan embriyonik böbrek 293T hücreleri (HEK-293T) kullanılarak yazılır. </li><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), 100 mm doku kültürü plakasında tohum hücreleri,% 10 FBS ile takviye edilmiş,% 1 Penisilin-Streptomisin, 2 mM L-glutamin, ve 25 mM HEPES (burada: Tam DMEM), pH 7.3 ve O inkübe 37 / N# 176; C ve% 5 CO 2. hücrelerle bütün çalışmalar, steril koşullar altında, bir biyolojik başlık yapılmalıdır. </li><li> Tet represör genin ifadesinin muhafaza ortamı aspire ve 5 mg / ml Blasticidin ile desteklenmiş tam DMEM ile değiştirmek için. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. </li><li> Hücreler 80 ulaştıklarında -% 90 oranında konfluent, orta aspire ve yavaşça (kalsiyum ve magnezyum içermeyen) DPBS ile iki kez yıkama hücreleri, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı. </li><li> yavaşça, mekanik zarar vermeden hücre asansör DMEM,% 0.05 tripsin içeren kültür inkübe etmek için 1.5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ısıtıldı. </li><li> Tam DMEM eşit hacimde tripsin eylemini bloke. Yavaşça yukarı pipet ve aşağı hücreleri kaldırın ve steril bir tüpe aktarmak için. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1 mL Tam DMEM ile değiştirin. Hiçbir kadar yukarı ve aşağı hücreleri ile çözüm pipetlehücre kümeleri görülebilir. Kont ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını hesaplamak. </li><li> Tohum 1-2 x 10 5 mg / ml Blasticidin 12 ml tam DMEM içeren 100 mm doku kültürü çanağı içinde 6 hücre. onlar% 90 confluency ulaşmak olarak haftada iki kez hücreleri bölün. </li></ol> 3. Hücreleri içinde ilgili plazmid transfekte <ol><li> 0.9 ml tam DMEM ile hazırlanan bir 12-çukurlu plaka içindeki yuvalara yukarıda transferi hücreleri tarif edildiği gibi ayırma hücrelerin aynı yöntemi kullanarak, yeterli% 50 konfluent (~ 200,000 hücre) yapmak ve bir CO2, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe etmek inkübatör. </li><li> pcDNA4 bir transfeksiyon karışımı hazırlayın / ilgili geni içeren inert bir plazmid nihai hacim 100 ul olmak için (gerekirse) 1 ug, 3 uL lipit transfeksiyon reaktifı ve DMEM toplam DNA miktarı getirmek. Farklı proteinler farklı etkinlik ifade olarak kullanılmak üzere plasmid DNA optimal miktarı çok değişkendir. Elektronik içinrophysiological deneyleri, başarılı bir şekilde transfeksiyon 4 geçiren hücreler görselleştirmek için transfeksiyon kokteyl memeli sentezleme plasmidi EGFP bulunmaktadır. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin. </li><li> 12 oyuklu plaka hücreler üzerine damla damla transfeksiyon karışımı pipetleme hücreleri transfekte DNA ve transfeksiyon reaktifi homojen bir dağılım sağlamak için kuvvetli bir şekilde plaka sallayın. Hücreler ~ transfeksiyon zamanı% 80 konfluent olmalıdır. </li><li> 37 ° C &#39;de transfekte edilmiş hücrelerin O / N inkübe ve% 5 CO2. </li><li> Hücreler başarıyla elektrofizyoloji performans ise ertesi sabah UV lamba altında EGFP floresan sinyalini gözlemleyerek transfekte olduğunu onaylayın. </li></ol> Poly-D-Lizin (PDL) 4. Kaplama Hücreler Lameller / Wells <ol><li> % 70 izopropil etanol çözeltisi ile dousing 12 mm lamelleri sterilize edin. Kuru ve tek coversl koyunelektrofizyolojik kayıt için 24 oyuklu bir plakanın her bir IP. </li><li> Bir kalsiyum görüntüleme odasının her lamel veya oyuk üzerine 0.2 mg / ml PDL çözeltisi - 0.1 bir çözelti pipetle. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bekletin. </li><li> Her yıkama arasında aspire, hücre kültürü dereceli çift damıtılmış su (DDW) ile üç kez yıkanır. Nihai yıkamayı takiben, iyice kurumasını ve oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Elektrofizyoloji, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı, 500 uL tam DMEM ile her bir içeren bir PDL kaplı lamel doldurun. </li><li> yukarıda tarif edildiği gibi transfekte edilmiş hücreleri bölme aynı yöntemi gerçekleştirmek. elektrofizyoloji kayıt için her PDL kaplı lamel merkezine tripsin tedavisi ve engelleme, transfer hücreleri (veya yaklaşık 30.000 hücreleri) 80 ul aşağıdaki hücrelerin resuspending sonra. Hücreler en az 1.5 saat için oturuşmaya veya% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe izin verin. </li><li> her bir PDL kaplı kalsiyum görüntüleme merkezine hücrelerinin kalsiyum görüntüleme transferi ve nokta 20 uL (yaklaşık 20.000 hücreleri) için. Hücrelerin en az 30 dakika süreyle yerleşmek ve her bir kuyu için 180 mcL tam DMEM eklemek için izin ver. </li></ol> 5. Endükleyen Gen İfadesi <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak DDW içinde 1 mg / mL&#39;lik bir doksisiklin stok çözelti hazırlayın. 3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş olarak stok solüsyonu tutun. Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de doksisiklin stok solüsyonu tutun. </li><li> Tam DMEM taze 2 ug / ml (elektrofizyoloji) ya da 3 | ig / ml (kalsiyum görüntüleme) doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C&#39;ye ısıtınız. </li><li> Elektrofizyolojik kayıtlar, pipet için her / ml doksisiklin solüsyon 2 ug 500 uL de 1 ug / ml doksisiklin bir son konsantrasyon yapmak. kalsiyum görüntüleme için, nihai konsantrasyonunun yapmak için her bir oyuğa 3 ug / ml doksisiklin çözeltisi 100 mcL1 mcg / ml doksisiklin yon. indüksiyon saat yazınız. </li><li> İstenen 37 ° C &#39;de indüksiyonu için süreyi ve% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> Protein İfade 6. Kalibre Timeline <ol><li> Kalsiyum Görüntüleme 5, 10 ile protein ifadesini kalibre <ol><li> Ringer çözeltisi (140 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 2 mM NaOH ile 7.4&#39;e ayarlanmıştır MgSO 4, 20 mM Hepes, pH) ve sıcak 37 ° C hazırlayın. </li><li> Ringer çözeltisi kanal agonistinin doyurucu konsantrasyonlarının hazırlayın. hücreler ve hücre dışı solüsyon içeren kalsiyum görüntüleme bölmelere ilave edildiğinde agonist miktarı seyreltilir için, agonist, istenen son konsantrasyona miktarını iki katına. Bu aynı zamanda kontrol etmek için her bir kritik banyo çözeltisinin miktarını sağlar. </li><li> D iyonik olmayan F-127 20% W / V bir çözelti hazırlayınMSO. iyonik olmayan, F-127 çözünene kadar 40 ° C çözelti ısıtılır. Oda sıcaklığında, iyonik olmayan, F-127 çözeltisi, depolama ve kullanma öncesi 40 ° C&#39;ye ısıtın. İyonik olmayan F-127 gibi Fura-2 sulu çözeltiler içinde floresan iyon göstergelerin asetoksimetil (AM) esterleri dağıtmak yardımcı olmak için kullanılır. </li><li> Kültür ortamı basınçla, Fura-2AM yükleme çözeltisi ile değiştirin (2 ile takviye edilmiş Ringer çözeltisi - 3 uM Fura-2AM, 0.02 mg / ml non-iyonik, F-127 ve 10 mM D-glukoz). </li><li> karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ringer + 10 mM D-glukoz solüsyonu ile aspire Fura-02:00 çözümü ve yıkama hücreleri dışı boya kaldırmak için. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> her bir 200 uL Ringer, 10 mM D-glikoz çözeltisi boş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> mikroskop burun parçasının üstünde sahnede odasına yerleştirin ve tutucu ile sabitleyin. </li><li> lamba, kamera ve mikroskop açın ve 510 nm wav de emisyon tespit etmek için Fura-2 filtre seçinelength. </li><li> İstenilen büyütme için ayarlayın ve seçilen alanda hücreleri odaklanır. </li><li> karanlıkta arka plan ışığı çıkarmak ve pozlama süresi ayarlayın. </li><li> 340 ve 380 nm dalga boylarında heyecanlı onlar tarafından Fura-2 yüklü hücreler istenilen hızı ve kayıt floresan tepkisi Set resim örnekleme. 340/380 sinyallerinin oranı TRPV1 faaliyeti dolayısıyla da bir hücre içi Ca2 + konsantrasyonu için gösterge ve olduğunu. </li><li> TRPV1 ifade seviyesini değerlendirmek için 1 uM kapsaisin nihai bir doyma konsantrasyonu oluşturmak için pipetleme 200 uL Ringer çözeltisi içinde 2 uM kapsaisin ekleyin. </li><li> indüksiyon zamana göre TRPV1 yanıtını Analiz ve ilgi protein için protokol belirler. </li></ol></li><li> Yama kelepçe tekniğiyle 4, 11, bütün hücre konfigürasyonu kullanılarak heterolog sistemlerde protein ifadesini ayarlanması. <ol><li> t hazırlayınO NaOH ile pH 7.4&#39;e ayarlandı (mM) 140 NaCl, 2.3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES ve 5 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), bir çözelti banyosu. </li><li> hücre dışı çözelti içinde kanal agonistinin doyurucu konsantrasyonlarının hazırlayın. </li><li> 4 MQ - 2 bir direnç bir iç çapı 1.10 mm (ID) ve yangın cila ile cam elektrotlar çekin. </li><li> (MM) 130 KCI, 4 NaCI, bir pipet çözeltisi hazırlayın MgSO 4 2, 0.5 CaCl2, 1, EGTA ve 10 HEPES, KOH ile pH 7.2 değerine ayarlanır. Kullanmadan önce pipet çözüm Filtre. Her deneyden önce, tek bir yangın parlatılmış cam pipet geri en az bir dakika pipet çözüm ucu daldırarak doldurulur ve daha sonra aynı pipet çözeltisi ile dolu bir şırınga ile erimiş ve gergin ucunu kullanarak doldurulur. </li><li> Yavaşça oda sıcaklığında yaklaşık 2 mL banyo çözeltisi ile doldurulmuş 35 mm plastik petri de kaplanan hücreler, tek bir PDL kaplı lamel kaldırın. Bir ep altında gözlemlemeki-floresan mikroskop. </li><li> epifluorescent mikroskop ile görüntülendi olarak hazırlanan lamel, bir EGFP pozitif hücre bulun ve görüntülenmiştir alanın merkezine taşıyın. </li><li> Mikromanipülatör pipet tutucu dolu pipet takın ve hücre içi pipet çözüm kirlenmesini önlemek için sisteme pozitif basınç küçük bir miktar enjekte edin. sadece GFP Yukarıda indirin - pozitif hücre, düzgün direnç kontrol. </li><li> Pipet hücre temas zamanda, bir cam pipet ve hücre membranı arasında bir GΩ mühür oluşturmak üzere negatif basıncın bir miktar uygulanır. </li><li> emme kısa keskin darbe ile, pipet hücrenin hücre içeriği ile temas sağlayan hücre zarı bölünürler. </li><li> sırasıyla, 5 kHz ve 0.5α - tüm hücreye amplifikatör moduna geçmek ve 1 ila Bessel filtre ve çıkış kazancını indirin. </li><li> doyurma için geçerli cevabı kaydedinGerilim rampaları veya boşluk serbest protokolünü kullanarak kanal agonist konsantrasyonları. </li><li> ifade verimlilikleri farklı proteinler arasında değiştiği için, farklı indüksiyon uzunluğu süreleri kullanarak kayıtları tekrarlayın. </li></ol></li><li> Tek kanallı kayıtları 4 için ideal bir indüksiyon süresi belirlenmesi. <ol><li> Bir pipet çözeltisi olarak, NaOH ile pH 7.4&#39;e ayarlandı (mm) 150, Na-glukonat, 15 NaCl, 5 EGTA, 10 HEPES, içeren bir çözelti hazırlayın. banyo çözüm için adım 6.2.1 den çözümü kullanın. </li><li> ID 0.86 mm cam pipetler 10 kadar direnç yangın cilalı kullanarak tüm hücre prosedürü tekrarlayın - 12 MQ ve mV -40 potansiyeli tutarak ayarlayın. </li><li> daha önce açıklanan ve membran rüptür olarak membran üzerinde bir mühür oluşturun. </li><li> Mikromanipülatör kullanarak, uzak hücreden membran yama ile pipet kaldırın. </li><li> membran yama içeren pipet doğrudan bir sonraki perfüzyon sistemi yerleştirin. </li><li> daha düşük Tsırasıyla, 5 kHz ve 10a skoru 2 - filtre ve çıkış kazancını Vladislav Tkachiev: Bessel. </li><li> Yama yanıtına göre, bir ya da daha fazla kanal içeriyorsa, membran yama üzerinde agonist doyurucu konsantrasyonlarının değerlendirilmesi serpmek. </li><li> başarıyla hücrelere uygulanan indüksiyon zamana karşı kaydedilen tek kanallı yamalar sayısını analiz edin. istenen sonuçlara göre endüksiyon süresini ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Transient+Expression+of+Membrane+Proteins+in+HEK-293+Cells+for+Functional+Characterization.">A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization.</a> Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li><li>Xu, X., Nagarajan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+sequence+of+the+Chinese+hamster+ovary+(CHO)-K1+cell+line.">The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).</li><li>Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pain+receptor+TRPV1+displays+agonist-dependent+activation+stoichiometry.">The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry.</a> Scientific reports. 5, 12278 (2015).</li><li>Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Residue+in+the+TRPV1+Vanilloid+Binding+Pocket+Regulates+Deactivation+Kinetics.">Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+induces+different+intracellular+calcium+signaling+in+CHO+K1+versus+HEK+293+cells.">Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells.</a> Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+tarantula+toxin+activates+the+capsaicin+receptor,+TRPV1,+by+targeting+the+outer+pore+domain.">A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain.</a> Cell. 141 (5), 834-845 (2010).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflu&#776;gers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+tetracycline-responsive+recombinant+protein+production+and+effect+on+cell+growth+and+ER+stress+in+mammalian+cells.">Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).</li><li>Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+potassium+channels.">High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels.</a> J Vis Exp. (71), e4209 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Transfeksiyon ifade tutarlılığı ve istikrarı geliştirmek için birçok farklı varyasyonları ile protein ekspresyonu ve araştırma için yaygın olarak kullanılan bir protokoldür. Geçici transfeksiyon ayıraçları kolay, basit bir ilgi hücre ve protein transfeksiyon zaman gecede saat içinde analiz edilebilir protokolünü kullanmak için sunuyoruz. Analiz modu gibi elektrofizyoloji 2 tek kanallı kayıtları gibi protein ifadesi, tutarlı bir düzeyde gerektirir Ne yazık ki bu yakl...

Heterolog sistemleri ifade hücresel fonksiyonları 1 çok sayıda çalışma için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Onların düşük endojen protein profili, asgari bakım gereksinimleri, güvenilir büyüme ve yabancı DNA&#39;yı almak ve ifade yeteneği, insan embriyonik böbrek (HEK293) ve biyolojik araştırmaların 2, 3 neredeyse temel Çin Hamster Yumurtalık (CHO) gibi hücre hatları yaptık. heterolog sistemler kullanılarak çalışma alanları zar proteinleri, hücre içi sinyal ve enzimatik aktivite içerir. Hücreye yabancı DNA&#39;nın transfeksiyonu takiben, analiz, birçok farklı formları elektrofizyoloji, rasyometrik kalsiyum görüntüleme, western blot, vb 4, 5 de dahil olmak üzere, yapılabilmektedir. heterolog sentezleme sistemleri için potansiyel uygulamalar geniş bir dizi için birçok differe nedeniylent reaktifler ve ürünleri bu hücreler ve nitelikleri 6 kullanmak için geliştirilmiştir. geçici veya kalıcı olarak eksojen proteini incelemek için hücre içine yabancı DNA&#39;yı entegre DNA verme sistemleri, biyolojik araştırmalar için en popüler ve kullanışlı araçlarından biri haline gelmiştir. Daha özel olarak ise, bir hücre içine geçici olarak transfekte DNA, yaygın olarak nispeten daha az bir zaman ve malzeme gerektiren, basit ve yalındır işlem olarak kullanılır. Ayrıca, transfeksiyon geçmesi hücrelerin başarı oranı 7 yüksektir. Bu teknik, aynı şekilde yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir işaretleyici gen ile birlikte ve örneğin kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyoloji 5 gibi birçok farklı teknikleri için kullanılabilir zaman çok güvenilirdir. Ne yazık ki, olsa da, geçici konakçı hücreler içine DNA ifade etmeyen hücre başına ekspresyon seviyesi güvenilmez olduğunu en az, bazı önemli tuzaklar ile birlikte geliyor. plazmid DNA kopya sayısı u alınmışhücre başına p böylece bireysel deneyler arasındaki ifade çok 2 değişebilir, kontrol edilemez. Ya fizyolojik koşulları çoğaltmak için çalışıyoruz, ya da kesin veri toplama tekniklerini yaparken bu sorun önemli hale gelir. Tek sağlanması ilgilenilen bir gen gibi bir tetrasiklin bastırıcı sentezleme sistemi gibi bir uyarımlı promotör, sıkı kontrol altında bir hücrenin genomu içine sokulabilir olan, kararlı transfeksiyon protokolleri tasarlanmıştır yukarıda bahsedilen komplikasyonların bir çözüm olarak, plazmidin kopyalama her bir hücrenin genomu içinde entegre olması ve yalnızca doksisiklinin varlığında, örneğin, transkripsiyon mekanizmasının indüksiyonundan sonra eksprese edilir. Bu tutarsızlık, protein sentezleme seviyeleri engeller çözer birlikte, bu yöntem, geçici transfeksiyonlar hızlı ve nispeten basit bir protokol uygun kaybeder. stabil bir hücre dizisi oluşturulması yüklenebileceğini en az bir kaç hafta sürerh bir protein ifadesini korumak ve vektör entegrasyonunu sağlamak ve ustaca seçin ve hücre kolonilerini büyümeye özel antibiyotik tarafından belirlenen bir öldürme eğrisini kalibre gerekir. Genel olarak bu alt başarı oranı 8 ile önemli ölçüde daha fazla zaman ve çaba gerektirir. Burada, herhangi bir uyarılabilir hücre hattında ifade seviyelerini kontrol etmek için basit ve etkili bir şekilde sağlamak için popüler transfeksiyon seçeneklerinin her ikisi de güçlü üzerine çekiyor bir ara protokol tanıtmak. indüklenebilir bir tet sistemi hücreleri muhafaza ederken, geçici olarak homolog represör sistemi ile kombine bir vektör içine lige ilgi Gen, geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1), transfekte. Bu şekilde, bir gen ifade etmek başlayan olmayan hücrelere dahil edilebilir. Sadece doksisiklin ilavesi ile gen protein İfade seviyelerini kalibre etmek bize izin verdiği ifade başlar yokFizyolojik koşullarda gözlenen teknik veya düzeylerine göre Ession. Bizim protokol, aynı zamanda, bir stabil şekilde eksprese eden hücre çizgisi üreten bağlantılı uzun komplikasyonlar önlenir. Biz kalsiyum görüntülemede TRPV1 aktivasyon değişen düzeylerde göstererek başlar un kaynaklı indüksiyon ve nasıl hücre içi kalsiyum seviyesinin yükselmesi ilişkilidir dört saat boyunca. Daha sonra indüksiyon süresinin artması ile artmaktadır akımını gösteren Patch kenetleme tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunda protokolü çoğaltmak. Son olarak, tek kanallı elektrofizyoloji kayıtların örnekler sunmakta ve proteinin tek tek birimler göre hassas veri toplama ararken bu teknik kontrollü sentezlenmesi için özellikle yararlı olduğu gösterilmiştir. böylece deneyler sağlamak ve mo arasındaki koşullarını kontrol etmek için bir yol sağlayarak, uzun hücre kültürü komplikasyonları kaçınırken bizim protokolü sayesinde, heterolog sistemlerde protein ifadesini kontrol etmek için uygun bir yol sunartekrarlanabilir sonuçlar yeniden.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&amp;trade;4/TO Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&amp;trade;5/TO Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&amp;trade;&amp;nbsp;MaxPro Thermal Cycler</td><td>Esco&amp;nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&amp;reg; TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin (Sodium), USP Grade</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone for microbiology</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD worldwide</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R Incubated Shaker</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&amp;reg;plasmid</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V Power Supply</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&amp;trade; EasyCast&amp;trade; B1A Mini Gel Electrophoresis System</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&amp;trade;-293 cell line</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), liquid (high glucose)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&amp;reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&amp;reg; Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&amp;trade;6/TR&amp;nbsp; Mammalian Expression Vector</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&amp;trade; 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&amp;trade; Class II Biological Safety Cabinet</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine S hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&amp;reg;-LT1 Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round</td><td>Knittel Glass</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&amp;trade; Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Water, Cell Culture Grade</td><td>Biological Industries</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM ester</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicin</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Wavelength Switcher</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Thin Walled Borosilicate Tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Standard Walled Borosilicate Tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank perfusion sysytem</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&amp;reg; 1440A Low-noise Data Acquisition System</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

controllable ion channel expression through inducible transient transfection

Transfeksiyon, bir hücre içine yabancı nükleik asitlerin ulaştırılması protein araştırmaları güçlü bir araçtır. Bu yöntem sayesinde, iyon kanalları elektrofizyolojik analizi, biyokimyasal karakterizasyonu, mutasyon çalışmaları ve hücresel süreçlerin üzerindeki etkileri yoluyla incelenebilir. Geçici nakiller protein gün birkaç saat içinde analiz için kullanılabilir hale geldiği basit bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem nispeten basit ve etkili bir zaman protokolü sunulur, ancak önemli bir bileşendir analizi için uygun olan fizyolojik ilgili bu seviyeleri ilgi konusu genin ekspresyonunu kalibre edilir. Bu amaçla, söz konusu genin ekspresyonunu kontrol etmek olanağı sunan bir çok farklı yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Birkaç kararlı hücre transfeksiyon protokolleri kalıcı bir tetrasiklin kontrollü transkripsiyonu düzenlenmesi altında cep genomuna ilgilenilen geni tanıtmak için bir yol sağlartional aktivasyonu. Bu tekniğin güvenilir ifade seviyelerini üretirken, ilgi her gen bir öldürme eğrisi kalibrasyonu, hücre kolonilerinin seçimi ve genel olarak daha fazla kaynak da dahil olmak üzere vasıflı iş bir kaç hafta gerektirir. Burada iyon kanalı analizinde gerekli kontrollü bir şekilde bir proteini ifade etmek için etkili bir yol olarak indüklenebilir bir sistemde geçici reseptör potansiyel katyon kanalı alt ailesi V 1 (TRPV1) geninin geçici transfeksiyon kullanan bir protokol mevcut. Biz bu tekniği kullanarak, bir tek transfeksiyon ile veri toplama her türü için gerekli olan kontrollü kanal seviyeleri ile kalsiyum görüntüleme, tüm hücre ve tek kanallı analizi gerçekleştirmek mümkün olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu iyon kanalları yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir kopyalanabilir bir teknik sağlamaktadır.

Hızlı bir şekilde uyarılabilir ifade modeli oluşturmak için, biz tetrasiklin bastırıcı protein (TR) ifade eden HEK293 hücrelerine kullandı (örneğin, T-Rex-293) ve CMV promoter ve çoklu klonlama sitesi arasında tetrasiklin operatör dizileri (TETO) ihtiva vektörleri (örneğin, pcDNA4 / TO). TRex-293 hücreleri içine transfekte edilmiş zaman TR teto bağlanan gibi, pcDNA4 / TO daki genin ekspresyonu, bastırılır. orta doksisiklin eklenmesi, böylece t...

Watch this Scientific Journal Video about Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection at JoVE.com

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

9.3K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem (HUJI).  bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır. 

Video: Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Genetik

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biyoloji

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell enables the expression, or production, of proteins using the cells own machinery, whereas insertion of RNA into a cell is used to down-regulate the production of a specific protein by stopping translation. While the site of action for transfected RNA is the cytoplasm, DNA must be transported to the nucleus for effective transfection. There, the DNA can be transiently expressed for a short period of time, or become incorporated into the genomic DNA, where the change is passed on from cell to cell as it divides.
This video describes the basics behind chemical mediated transfections and introduces some of the most commonly-used reagents, including charged lipids, polymers, and calcium phosphate. Each step is described from the preparation of cells for transfection through analysis of transfection efficiency. Additionally, the applications section of this video-article describes the use of electroporation and a biolistic transfection as alternative methods for introducing nucleic acid into mammalian cells. It also describes an advanced use of transfection where co-transfection of interfering RNA and DNA are introduced as a way to down-regulate a naturally occurring protein while at the same time producing a mutant variant of it within the same cell.

Transfection: Inserting Genetic Materials into Mammalian Cells

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Education

JoVE Science Education

Temel Biyoloji

Hücresel ve Moleküler Biyolojide Temel Yöntemler

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...