Name: inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
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この研究は、カナダの自然科学および工学研究評議会によって支持された。

1.興味のある遺伝子を得る<ol><li> 合成遺伝子を設計する。 <ol><li> 大腸菌発現のための遺伝子配列を最適化する。 </li><li>配列（AvrII、NdeI、EcoRIおよびXbaI）から問題のある制限部位を除去する。 </li><li>クローニングのための制限部位を組み込む。 5&#39;-NdeI部位および3&#39;-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 &#39;または3&#39;エンコードタグを含めます。 </li><li>設計された遺伝子を商業的に注文する。 </li><li>製造者の指示に従って、平滑化クローニングキットを用いて平滑化ベクターに遺伝子を平滑化する;遺伝子を増幅するためのプライマーを設計する（ステップ1.2.2に進む）。またはさらに5 &#39;および3&#39;末端を加えてpMGXプラスミドに直接クローニングし、ステップ2に進む。ここで、th代表的な結果は、関心のある遺伝子を無作為にクローニングすることによる。 </li></ol></li><li> 所望の遺伝子を増幅する（設計および最適化された合成遺伝子または所望の遺伝子を含む鋳型DNAから） 15 。 <ol><li>クローニングのための制限部位を有するプライマーを設計する; 5&#39;-NdeI部位および3&#39;-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 &#39;または3&#39;エンコードタグを含める。 </li><li>所望の遺伝子をPCR増幅する15 。 </li><li>アガロースゲル電気泳動によるPCRの解析16 。 </li><li>非特異的な増幅がある場合、ゲル抽出によって増幅された遺伝子を浄化する。そうでない場合は、酵素クリーンアップキットを使用してください。 </li><li>分光光度計を使用してDNAを定量する。260nmにおけるe。溶出緩衝液を含むブランク17 。 </li></ol></li></ol> 2.マルチ遺伝子発現系ベクターpMGX 18への関心対象遺伝子のクローニング<ol><li> 制限は、得られた目的の遺伝子および所望のベクターpMGXをNdeIおよびEcoRIで消化する。 注：大量の再環状化プラスミドが得られた場合、EcoRIを添加する前にNdeI反応を1時間進行させます。 <ol><li> 0.5-1.5μgのDNAと1μLの各酵素と4μLの適切な10倍緩衝液を含む40μLの消化反応物を使用する。 </li><li> NdeIおよびEcoRI消化物については、EcoRI緩衝液を使用し、最初にNdeIエンドヌクレアーゼを添加する。 37℃で1時間消化する。次に、EcoRIエンドヌクレアーゼを添加し、ダイジェストをさらに1時間進行させる。 NdeIはDNAの末端近くの切断に敏感であるため、EcoRIによる初期消化はNdeIによる効果的な消化を妨げる可能性があります。 </li></ol></li><li>電気アガロースゲル上で制限消化物を発色させる（1kb遺伝子については、110Vで0.7％アガロースゲルを55分間使用する;異なる遺伝子サイズに対するアガロースゲルのパーセントを選択するには、参考文献16を参照のこと）。 </li><li>きれいなメスまたはカミソリの刃を使用して挿入バンドとベクターバンドを切り出し、切除したゲルセグメントを1.5mLチューブに入れる。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを製造元のプロトコールに従って抽出する。 </li><li> 3：1インサート - ベクター比を用いて目的の遺伝子をpMGXベクターにライゲートする。インサートなしで消化したpMGXのネガティブライゲーションを設定する。 <ol><li> T4 DNAリガーゼ1μL、ベクターDNA（〜5μL）0.15〜0.5μg、および3：1インサート対ベクター比に基づいて適切な量のインサートを含む20μL連結反応をセットアップし、挿入されている遺伝子; pMGXバックボーンは、5,312〜5,504bpのサイズである。すべてのbuを含むネガティブコントロール反応を含める挿入されている遺伝子。ベクターDNAの量が、陰性対照ライゲーションおよびベクタープラス挿入ライゲーション反応において同等であることを確認する。 </li></ol></li><li> 連結反応をXL1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞に連結し、連結したプラスミドpMGX- yfg1 （目的遺伝子1を含む）、pMGX -yfg2 （目的遺伝子2を含む）、pMGX -yfgn （目的遺伝子nを含む）。無菌技術を使用する（バイオセーフティキャビネット内または炎の下）。 <ol><li>化学的にコンピテントなXL1-Blue E. coliの 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、ライゲーション反応液 5μLを加えます。氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。 </li><li>細胞を37℃、220rpmで1時間振盪し、次いでプレートを100μLをLBを含有する寒天プレート上に広げる。（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含む。 </li></ol></li><li> 陽性形質転換体のクローンをスクリーニングする。 <ol><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。 1：2より大きいコロニーカウント比が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ2.1に戻り、メモを確認します。 </li><li>スクリーニング（1 n）のために挿入された異なる遺伝子の各ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に依存する）を選択し、4 mLのLBおよび適切な抗生物質一晩培養/個々のコロニーに接種する。 37℃および220 rpmで振とうしながら一晩培養します。 </li><li>製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。 </li><li> 150〜500ngのDNAと1μLの各酵素を含む20μLのNdeI + EcoRI消化反応を2μLの適切な10×緩衝液で設定する。第一に関心のある遺伝子が制限部位の間にあるのと同時にNdeIおよびEcoRIを添加する。空のpMGXベクターによる陰性対照が推奨される。水浴中で37℃で2時間消化する。 </li></ol></li></ol> 3.遺伝子1、pMGX -yfg1を含むpMGXベクターへの遺伝子2の挿入<ol><li> 制限は、AvrIIでpMGX- yfg1を消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で治療する。 <ol><li> 0.5-1.5μgのベクターDNA（約5-10μLの単離されたDNA）および1μLのAvrIIを含む40μLの消化反応物を、適切な10×緩衝液4μLとともに使用する。 37℃で1.5時間消化し、次いで1.5μLのCIPを添加する。 37℃でさらに30分間放置する。 </li></ol></li><li> 制限酵素消化物pMGX- yfg2をAvrIIおよびXbaIで消化して目的の遺伝子を遊離させる。 <ol><li> 0.5〜1.5μgのDNAと1μMのDNAを含む40μLの消化反応;各酵素のLを4μLの適切な10×緩衝液で希釈する。 37℃で2時間消化する。 </li></ol></li><li>電気泳動制限は、適切なパーセント（0.7％）のアガロースゲルで消化し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する（ステップ2.2〜2.3参照）。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出し、DNA 17を定量する。 </li><li> 3：1インサート - ベクター比を用いて、L遺伝子2をpMGX- yfg1に挿入する。追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1のネガティブライゲーションを設定する。上記の手順2.5で設定します。 </li><li>ステップ2.6で見られるように、ライゲーション反応物5μLをXL1-Blue化学的コンピテント大腸菌細胞に連結し、プラスミドpMGX -yfg1,2 （目的遺伝子1および2を含む）および陰性pMGX -yfg1コントロールに連結する。 </li><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。コロニー数の比g1：2以上が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ3.1に戻り、CIP処理を確認します。 </li><li>ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種し、37℃および220 rpmで一晩増殖させます。 </li><li>製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離し、DNA17を定量する。 </li><li> EcoRIでpMGX -yfg1,2の制限消化を行うことにより、第2の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。 <ol><li> 150-500 ngのDNAと1μLのEcoRI酵素と2μLのEcoRI 10xバッファーを含む20μLの消化反応を使用します。 37℃で2時間消化する。 </li></ol></li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;対応するバンドを探すsを遺伝子2のサイズに合わせる（ステップ2.2参照）。遺伝子は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができる。 </li></ol>第1および第2遺伝子pMGX-yfg1,2を含むpMGXベクターへの第3遺伝子の付加 <ol><li>制限はAvrIIでpMGX- yfg1,2を消化し、ステップ3.1に示すようにCIPで治療する。 </li><li>ステップ3.2に見られるように、制限消化物pMGX- yfg3をAvrIIおよびXbaIで消化する。 </li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する;手順2.2-2.3を参照してください。 </li><li>ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを抽出し、DNA 17を定量する。 </li><li> 3：1インサート対ベクター比を用いてL遺伝子3をpMGX- yfg1,2に挿入し、ステップ3.5に示すように、追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1,2のネガティブライゲーションを設定した。 </li><li> 5μLの連結反応をXLに変換する1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞、ライゲートしたプラスミドpMGX- yfg1,2,3 （目的の遺伝子1,2および3を含む）、および陰性pMGX -yfg1,2対照（ステップ2.6参照）。 </li><li>ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ4.1に戻り、CIP処理を確認します。 </li><li>ライゲーション反応から4〜8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種する。 37℃および220rpmで一晩増殖させる。 </li><li>プラスミドDNA単離キットを製造元のプロトコールに従って用いてプラスミドDNAを単離する。 </li><li>ステップ3.10に示すように、EcoRIでpMGX -yfg1,2,3の制限消化を行うことにより、第3の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。 </li><li>適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;見える遺伝子2および遺伝子3のサイズに対応するバンドについては（ステップ2.2参照）。注：遺伝子3は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができます。遺伝子2および3が同じサイズである場合、スクリーニングのために別の適切な制限消化部位を選択しなければならない。 注：新しい遺伝子ごとに必要に応じて繰り返します。 </li></ol> 5.マルチ遺伝子発現系を用いた目的タンパク質の産生およびウエスタンブロッティングによる産生の評価<ol><li> 関心のある全ての遺伝子を含む陽性クローンを、BL21-（λDE3）のような化学的コンピテントなタンパク質生産大腸菌に形質転換する。 <ol><li>化学的にコンピテントなBL21-（λDE3） 大腸菌の 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、次いで陽性クローン化プラスミドDNA1μLを加える;氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。 </li><li>細胞を37°Cおよび220 rpmで1時間振とうし、プレート100μLを適切な選択マーカー（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含むLB-寒天プレートに塗布する。 </li></ol></li><li> イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導によりタンパク質を発現させる。 <ol><li> B21-（λDE3）形質転換プレートから単離されたコロニーを選択し、適切な抗生物質を加えた4mLのLBに接種する。一晩増殖し、37℃および220rpmで振とうする。 </li><li> 1mLの一晩培養液を使用して、100mLのLBに適切な抗生物質培養物を加えて接種する。 </li><li> OD 600が0.6になるまで220 rpmで振盪しながら37℃で増殖させる。 </li><li> 100μMIPTGで培養物を誘導し、25℃および220rpmで15時間増殖させる。 </li><li> 1 mLの培養液を取り除き、13,000 xgで1分間遠心してください。上清を捨てる。 </li></ol></li><li>製造元の指示に従って溶解液を用いて細胞を溶解する可溶性細胞ライセートのウエスタンブロットを行い、すべてのタンパク質がうまく産生されたかどうかを調べる19 。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

特に複雑な多遺伝子代謝経路の特徴付けおよび再構築には、複数の遺伝子の同時発現がますます必要不可欠となっている3,4,5 。 pMGXシステムは、 大腸菌ルーチン6,7,8で多遺伝子同時発現を行い、多様な研究者にアクセス可能である。この研究では、目的の5つのタンパク質が、pMGX-Aを用いて単一のプラスミドシステムから同時に生成されることが示された。現?...

特に、複数の機能モジュールを発現させなければならない合成生物学アプリケーションでは、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠となっている。発現および機能がしばしば共発現2,3を必要とするタンパク質 - タンパク質複合体の研究において ;経路中の各遺伝子が4,5,6,7,8で発現されなければならない生合成経路を特徴づけ、利用することにある。特に宿主生物であるエシェリヒア・コリ （ Escherichia coli）において、共発現のための多くの系が開発されている。例えば、異なる選択可能なマーカーを有する複数のプラスミドを使用して、豊富な異なるex<html>プレスベクトル10,11 。複数のタンパク質発現のための単一プラスミド系は、各遺伝子の発現を制御するために複数のプロモーターのいずれかを使用している10,12 ;複数の遺伝子が単一の転写産物にコードされている合成オペロン2,13;場合によっては、最終的にタンパク質分解処理されたポリペプチドをコードする単一の遺伝子を含み、目的の所望のタンパク質14を生じる。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> 図1：ポリシストロニックベクターの構築を示すpMGXワークフロー。 pMGXシステムは、誘導性T7プロモーターの制御下で合成オペロンの構築のための柔軟で使い易い戦略を提供する。e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 この原稿では、誘導性T7 RNAポリメラーゼ（ 図1 ）の制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。これは元々pKH22と呼ばれていたプラスミドシステムに基づいており、これは数多くのさまざまなアプリケーションでよく使用されています6,7,8。ここでは、このプラスミドセットは、4つの関連ベクター：pMGX-A、C末端タグまたはN末端タグを欠く発現ベクターおよびアンピシリン耐性マーカーを含むように拡大される。 pMGX-hisA、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびアンピシリン耐性マーカーをコードする発現ベクター; pMGX-K、発現ベクターl任意のC末端タグまたはN末端タグとカナマイシン耐性マーカーとを接触させる工程;およびN末端ヘキサヒスチジンタグおよびカナマイシン耐性マーカーをコードする発現ベクターであるpMGX-hisK。この研究では、pMGXシステム、特にpMGX-Aを使用して5つの遺伝子を含むポリシストロニックベクターを作製する方法が、 大腸菌における個々のタンパク質の成功した産生と共に実証される。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

合成生物学、タンパク質 - タンパク質複合体の研究、および生合成経路の特徴付けおよび利用には、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠である。この原稿では、誘導性T7RNAポリメラーゼの制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。ここでは、アンピシリンまたはカナマイシン耐性選択マーカー（AおよびK）のいずれかとN末端ヘキサヒスチジンを有するかまたは欠いている4つの関連ベクターpMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-KおよびpMGX-hisKのセットタグ（his）が開示される。 5つの遺伝子を含むpMGXベースのシステムが容易に構築され、 大腸菌で 5つのコードされたタンパク質すべてを産生することができることを示す、このベクターシステムを用いた合成オペロンの構築のための詳細なプロトコールを対応するデータと共に提供する。このシステムemとプロトコルは、研究者が大腸菌で複雑な多成分モジュールと経路を日常的に発現することを可能にする。

この研究では、目的は単一のプラスミドから5つのタンパク質を同時発現させることであった。 N-またはC-末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかをコードする5コドン最適化合成遺伝子断片を商業的に購入した。合成遺伝子をPCRによって増幅し、個々にPCR-平滑ベクターにクローニングし、配列決定した。ポリシストロニックプラスミドを作製するために、目的の5つの遺?...

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K ビュー.  University of Ottawa. この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。 

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

遺伝学

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

生化学

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

免疫・感染学

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

生物工学

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

生物学

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

インビボでの誘導性Tet-On調節可能なシステムベースの遺伝子発現:マウスモデルにおける標的遺伝子転写活性化のためのテトラサイクリン誘導遺伝子発現システム

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...