Name: inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה.

1. קבלת גנים של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב גנים סינתטיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייעל רצף גנים עבור ביטוי E. coli . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אתרי ההגבלות הבעייתיים מהרצף (AvrII, NdeI, EcoRI ו- XbaI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5&#39;-NdeI ואתר 3&#39;-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד בגודל 5 או 3 עבור זיהוי כתמים מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן מסחרי להזמין את הגן המעוצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או בוטה לשכפל את הגן לתוך וקטור קהה באמצעות ערכת שיבוט קהה, בהתאם להוראות היצרן; פריימרים בעיצוב כדי להגביר את הגן (ולאחר מכן להמשיך לשלב 1.2.2); או להוסיף 5 &#39;ו 3&#39; מסתיים נוספים שיבוט ישיר לתוך pMGX פלסמיד ולהמשיך לשלב 2. כאן,התוצאות הייצוגיות הן מתוך שיבוט קהה של הגנים המעניינים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הגן הרצוי (מגן מתוכנן וממוטב של סינתטי או מדגם DNA המכיל את הגן הרצוי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב primers עם אתרי הגבלה לשיבוט; מומלץ לבנות אתר של 5&#39;-NdeI ואתר 3&#39;-EcoRI. ניתן להשתמש באתרים אחרים, במידת הצורך; מתייחסים לאזור multicloning של הפלסמיד הנבחר ( איור S1- S4 ). אם תרצה, הוסף תג קידוד של 5 או 3 לזיהוי כתמים מערביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הגן הרצוי 15 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח PCR על ידי agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה 16 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש הגברה unspecification, לנקות את הגן מוגבר על ידי מיצוי ג &#39;ל. אם לא, השתמש ערכת אנזים ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר ידי בדיקת absorbancE ב 260 ננומטר; ריק עם חיץ elution 17 . </li></ol></li></ol> 2. שיבוט גנים של עניין לתוך מערכת ביטוי multigene וקטור, pMGX 18 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת digest הגן שהושג של עניין ואת וקטור הרצוי, pMGX, עם NdeI ו EcoRI. הערה: אם כמות גדולה של פלסמידים recircularized מתקבלים, לאפשר תגובה NdeI להמשיך במשך שעה 1 לפני הוספת EcoRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של ה- DNA ו 1 μL של אנזים עם 4 μL של חיץ 10x המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור Ndei ו- EcoRI digest, השתמש במאגר EcoRI והוסף תחילה endonuclease NDEI. תקציר עבור 1 שעה ב 37 ° C. לאחר מכן להוסיף endrouclease EcoRI, ולאפשר digest להמשיך במשך שעה נוספת. NdeI הוא רגיש מחשופים קרוב לסוף הדנ&quot;א, ולכן העיכול הראשוני על ידי EcoRI יכול למנוע עיכול יעיל על ידי NdeI. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשמלOphorese הגבלת digest על agarose ג&#39;ל (עבור גן 1 kb, השתמש ג&#39;ל agarose 0.7% ב 110 V עבור 55 דקות, כדי לבחור את אחוז ג&#39;ל agarose עבור גנים שונים בגן, עיין התייחסות 16 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו להוסיף להקות וקטור באמצעות אזמל נקי או סכין גילוח ומקום קטע ג&#39;ל שנעלמו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית דנ&quot;א מג&#39;ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל בהתאם לפרוטוקול היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשר את הגן של עניין לתוך וקטור pMGX באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור; להקים קשירת שלילי של pMGX מתעכל ללא הכנס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובה 20 קשירת μL המכיל 1 μL של ליגז DNA T4, 0.15-0.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5 μL), ואת הכמות המתאימה של הוספה על בסיס יחס של 3: 1 להוסיף וקטור ואת גודל הגן מוחדר; את pMGX backbones הם בין 5,312 ו 5,504 bp בגודל. כלול תגובה שלילית שליטה המכיל הכל buלא את הגן מוחדר. ודא כי כמות ה- DNA הווקטורית היא המקבילה של קשירת שליטה שלילית ואת וקטור פלוס להוסיף קשירת התגובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli ו ligated פלסמידים pMGX- yfg1 (המכיל גן של עניין 1), pMGX- yfg2 (המכיל גן של עניין 2) ... pMGX- yfgn (המכיל גן של עניין n). השתמש בטכניקה aseptic (בתוך ארון biosafety או תחת להבה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה 100 aliquots μL של המוסמכת כימית XL1-Blue E. coli על הקרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 5 μL של התגובות קשירת. דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים הלם התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה אותם על הקרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל&quot;ד עבור 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל אישורסמן לבחירה (או אמפיצילין או קנמיצין). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך שיבוטים עבור transformants חיובי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה סופרת על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבה גדול מ 1: 2 הוא הרצוי. אם יש מספר גדול של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור לשלב 2.1 ולסקור את ההערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילי: קשירת יחס) מכל תגובה קשירת כל הגנים השונים שהוכנסו להקרנה (1 n) ו לחסן 4 מ&quot;ל LB ואת התרבות המתאימה אנטיביוטיקה לילה / מושבה אישית. לגדול תרבויות לילה עם רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת 20 NDEI + תגובה EcoRI digest μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של כל אנזים עם μL 2 של חיץ 10x המתאים. בהוא מקרה, להוסיף NdeI ו EcoRI באותו זמן כי הגן של עניין יהיה בין אתרי הגבלה. שליטה שלילית עם וקטור pMGX ריק מומלץ. תקציר עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li></ol></li></ol> 3. הוספת ג&#39;ין 2 לתוך pMGX וקטור המכיל את ג &#39;ין 1, pMGX- yfg1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת digest pMGX- yfg1 עם AvrII ולטפל עם phosphatase המעי העגל (CIP). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40-μL digest המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA וקטורית (~ 5-10 μL של DNA בודד) ו 1 μL של AvrII עם 4 μL של חיץ 10x המתאים. תקציר עבור 1.5 שעות ב 37 ° C ולאחר מכן להוסיף 1.5 μL של CIP. להשאיר אותו על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg2 עם AvrII ו XbaI לשחרר את הגן של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 40 לעכל μL המכיל 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA ו 1 μ, L של כל אנזים עם 4 μL של חיץ המתאים 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה אלקטרופורזה מתעכל על אחוז המתאים (0.7%) agarose ג&#39;ל ובלו את להקות להוסיף וקטור באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח (עיין צעדים 2.2-2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל בהתאם לפרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור גן 2 לתוך pMGX- yfg1 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור. הגדרת קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1 ללא הוספה נוספת. הגדר כנ&quot;ל בשלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה 5 μL של התגובות קשירת לתוך XL1 כחול כחול מוכשר כימית תאים E. coli , פלסמידים ligated pMGX- yfg1,2 (המכיל גן של עניין 1 ו -2), ושליטה שלילית pMGX- yfg1 , כפי שניתן לראות בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. יחס ספירת מושבות זReater יותר מ 1: 2 הרצוי. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 3.1 ולסקור את הטיפול CIP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך ההכנסה יעילה של הגן השני על ידי ביצוע digest הגבלה של pMGX- yfg1,2 עם EcoRI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתגובת 20 לעכל μL המכיל 150-500 ng של DNA ו 1 μL של אנזים EcoRI עם μL 2 של חיץ EcoRI 10x. תקציר עבור 2 שעות ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל; לחפש להקה שמתאימהS לגודל הגן 2) ראה שלב 2.2 (. גן יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה. </li></ol> 4. הוספת ג &#39;ין השלישי לתוך וקטור pMGX המכילים גנים 1 ו -2, pMGX- yfg1,2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg1,2 עם AvrII ולטפל עם CIP, כפי שניתן לראות בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלה digest pMGX- yfg3 עם AvrII ו XbaI, כפי שניתן לראות בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digests על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל ו הבלו להוסיף ווקטור להקות באמצעות סכין מנתח נקי / סכין גילוח; עיין בשלבים 2.2-2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA מן ג&#39;ל agarose באמצעות ערכת מיצוי ג&#39;ל לכמת את ה- DNA 17 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור גן 3 לתוך pMGX- yfg1,2 באמצעות יחס 3: 1 להוסיף וקטור ולהגדיר קשירת שלילי של מתעכל pMGX- yfg1,2 ללא הוספה נוספת, כפי שניתן לראות בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה 5 μL של תגובות קשירת לתוך XL1-כחול מוכשר כימית תאים E. coli , ligated פלסמיד pMGX- yfg1,2,3 (המכיל גנים של עניין 1, 2, ו -3), וכן שלילי pMGX- yfg1,2 שליטה, כפי שניתן לראות בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המושבה לספור על שליטה שלילית צלחות קשירת. אם יש מספר רב של מושבות על לוח הבקרה השלילי, לחזור שלב 4.1 ולסקור את הטיפול CIP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 4-8 מושבות בודדות (בהתאם שליטה שלילית: יחס קשירת) מן התגובה קשירת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לכל מושבה הפרט; לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך ההכנסה יעילה של הגן השלישי על ידי ביצוע תקציר digest של pMGX- yfg1,2,3 עם EcoRI, כפי שניתן לראות בשלב 3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese הגבלה digest על אחוז המתאים agarose ג&#39;ל; תראהעבור להקות המתאימות לגדלים של גן 2 ו גן 3 (ראה שלב 2.2). הערה: הגן 3 יכול להכניס לתוך הווקטור בכיוון הלא רצוי, הפוכה. אם הגנים 2 ו- 3 הם באותו גודל, יש לבחור אתר אחר של עיכוב הגבלה מתאים להקרנה. הערה: חזור על פי הצורך בכל גן חדש. </li></ol> 5. הפקת חלבונים של עניין באמצעות מערכת ביטוי multigene ו הערכת הייצור על ידי סופג המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את שיבוט חיובי המכיל את כל הגנים של עניין לתוך מוכשר מבחינה כימית, חלבון-ייצור E. coli , כגון BL21- (λDE3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה 100 aliquots μL של BL21- מוכשר כימית (λDE3) E. coli על קרח במשך 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 μL של DNA פלסמיד משובץ חיובי; דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום התאים במשך 45 ים באמבט מים שנערך ב 42 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 200 μL של LB קר. דגירה על קרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לנער את התאים ב 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד במשך 1 שעות ולאחר מכן להפיץ צלחת 100 μL על צלחת LB אגר המכיל את סמן לבחירה המתאים (או ampicillin או kanamycin). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביע את החלבון על ידי איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) אינדוקציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה מבודדת מן B21- (λDE3) שינוי צלחת לחסן 4 מ&quot;ל של LB בתוספת אנטיביוטי מתאים; לגדול בן לילה, רועד על 37 מעלות צלזיוס 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 100 מ&quot;ל LB בתוספת תרבות אנטיביוטי מתאים באמצעות 1 מ&quot;ל של תרבות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 220 סל&quot;ד ל 600 OD של 0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את התרבות עם 100 מיקרומטר IPTG ולגדול במשך 15 שעות ב 25 ° C ו 220 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1 מ&quot;ל של התרבות צנטריפוגה זה ב XG 13,000 במשך דקה 1; להשליך את supernatant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה לפי הוראות היצרןו preform כתם המערבי של lysate תא מסיס כדי לקבוע אם כל החלבונים הופקו בהצלחה 19 . </li></ol>

<ol>
	<li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+wave+of+synthetic+biology:+from+modules+to+systems.">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li><li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway.">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li><li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids.">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li><li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli.">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li><li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli.">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li><li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli.">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li><li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylneuraminic+Acid+Production+in+Escherichia+coli+Lacking+N-Acetylglucosamine+Catabolic+Machinery.">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li><li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts:+experimental+procedures,+database+tracking+and+case+studies.">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li><li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli.">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Kim, K. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes.">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li><li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li><li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector.">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016)</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016)</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

ביטוי משותף של גנים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד באפיון מחדש מסלולים מורכבים, multigene מטבולי 3 , 4 , 5 . מערכת pMGX עושה ביטוי multigene שיתוף ב E. קולי שגרת 6 , 7 , 8 ונגי...

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר, במיוחד ביישומים ביולוגיה סינתטית, שבו מודולים פונקציונליים מרובים חייב לבוא לידי ביטוי 1 ; בחקר חלבונים חלבונים, שבו הביטוי ואת הפונקציה דורשים לעתים קרובות שיתוף ביטוי 2 , 3 ; וכן אפיון ורתום מסלולים ביוסינתטיים, שבו כל גן במסלול חייב לבוא לידי ביטוי 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . מספר מערכות פותחו עבור שיתוף ביטוי, במיוחד האורגניזם המארח Escherichia coli , סוס העבודה עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מעבדה 9 . לדוגמה, פלסמידים מרובים עם סמנים לבחירה שונים ניתן להשתמש כדי לבטא חלבונים בודדים באמצעות שפע של שונים לשעבר<html> 12 הצ 12 , 12 . מערכות פלסמיד יחיד עבור ביטוי חלבון מרובים השתמשו גם מספר האמרגן לשלוט על הביטוי של כל גן 10 , 12 ; אופטונים סינתטיים, שבהם מקודדים גנים מרובים על תמליל יחיד 2 , 13 ; או, במקרים מסוימים, גן יחיד קידוד פוליפפטיד כי הוא מעובד proteolytically בסופו של דבר, מניב את החלבונים הרצוי של עניין 14 . <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה pMGX מראה את הבנייה של וקטור polycistronic. מערכת pMGX מספקת אסטרטגיה גמישה וקלה לשימוש לבניית אופרונים סינתטיים בשליטתו של מקדם T7.&quot;לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.&quot; Target = &quot;_ blank&quot; בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene אופטונים סינתטיים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducible ( איור 1 ) מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הוא מבוסס על מערכת פלסמיד, שנקרא במקור pKH22, כי כבר בשימוש בהצלחה עבור מספר יישומים שונים 6 , 7 , 8 . הנה, זה להגדיר פלסמיד מורחבת לכלול ארבעה וקטורים הקשורים: pMGX-A, וקטור ביטוי חסר כל C- או N- מסוף תגים עם סמן עמיד ampicillin; PMGX-heA, ביטוי וקטור קידוד תג N- מסוף hexahistidine ועם סמן עמיד ampicillin; PMGX-K, וקטור ביטוי lAcking כל C או N- מסוף תגים עם סמן התנגדות kanamycin; ו pMGX-hek, ביטוי וקטור קידוד N- מסוף hexahistidine תג עם סמן התנגדות kanamycin. במחקר זה, השיטה להפקת וקטור polycistronic המכיל חמישה גנים באמצעות מערכת pMGX, במיוחד pMGX-A, הוא הפגינו יחד עם הייצור המוצלח של כל חלבון הפרט Escherichia coli .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

ביטוי משותף של חלבונים מרובים הוא חיוני יותר ויותר עבור ביולוגיה סינתטית, חקר קומפלקסים חלבונים חלבון, אפיון ורתום מסלולים biosynthetic. בכתב יד זה, את השימוש של מערכת יעילה מאוד לבניית multonene סינתטי אופרנים תחת שליטה של ​​פולימרז T7 RNA inducable מתואר. מערכת זו מאפשרת גנים רבים להתבטא בו זמנית פלסמיד אחד. הנה, קבוצה של ארבעה וקטורים הקשורים, pMGX-A, pMGX-hea, pMGX-K, ו pMGX-hek, עם או ampicillin או קנמיצין התנגדות סמן לבחירה (A ו K) או גם בעל או חסר N- מסוף hexahistidine התג (שלו) נחשפים. פרוטוקולים מפורטים לבניית אופטונים סינתטיים באמצעות מערכת וקטורית זו מסופקים יחד עם הנתונים המתאימים, מראים כי מערכת pMGX מבוסס המכיל חמישה גנים ניתן לבנות בקלות ומשמש לייצר את כל חמש חלבונים מקודדים ב Escherichia coli . זה systEm ופרוטוקול מאפשר לחוקרים באופן שגרתי להביע מורכבים מרובי רכיב רכיבים ומסלולים ב E. coli .

במחקר זה, המטרה היתה לשיתוף חמישה חלבונים מתוך פלסמיד אחד. חמש קודון אופטימיזציה שברי גנים סינתטיים קידוד או N- או מסוף hexahistidine תגים נרכשו מסחרית. הגנים הסינתטיים היו מוגבר על ידי PCR ו משובטים בנפרד לתוך וקטור PCR-blunt ו sequenced. כדי ליצור את polycistronic פלסמיד, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX at JoVE.com

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Views.  University of Ottawa.  מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד. 

Video: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Environment

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Biochemistry

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunology and Infection

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Bioengineering

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Biology

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

ביטוי גנים מבוסס מערכת מושרה Tet-On ב- Vivo: מערכת ביטוי גנים המושרה על ידי טטרציקלין להפעלת שעתוק גני מטרה במודל עכבר

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...