Name: inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
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Diese Arbeit wurde vom Naturwissenschaften und Ingenieurforschungsrat von Kanada unterstützt.

1. Erhalten von Genen von Interesse <ol><li> Design synthetische Gene. <ol><li> Optimieren Sie eine Gensequenz für die E. coli- Expression. </li><li> Entfernen Sie alle problematischen Restriktionsstellen aus der Sequenz (AvrII, NdeI, EcoRI und XbaI). </li><li> Einbindung von Restriktionsstellen für das Klonen; Eine 5&#39;-NdeI-Stelle und eine 3&#39;-EcoRI-Stelle werden empfohlen. Andere Standorte können bei Bedarf verwendet werden; Beziehen sich auf den Multicloning-Bereich des ausgewählten Plasmids ( Abbildung S1- S4 ). Falls gewünscht, bitte ein 5 &#39;oder 3&#39; Codierungs-Tag für die Western-Blot-Erkennung. </li><li> Kommerziell das entworfene Gen bestellen </li><li> Entweder stumpf klon das Gen in einen stumpfen Vektor unter Verwendung eines stumpfen Klonierungskits, wie nach den Anweisungen des Herstellers; Design-Primer zur Amplifikation des Gens (dann weiter mit Schritt 1.2.2); Oder zusätzliche 5&#39;- und 3&#39;-Enden zur direkten Klonierung in ein pMGX-Plasmid hinzufügen und mit Schritt 2 fortfahrenDie repräsentativen Ergebnisse stammen aus dem stumpfen Klonen der Gene von Interesse. </li></ol></li><li> Amplifizieren des gewünschten Gens (aus einem entworfenen und optimierten synthetischen Gen oder aus Templat-DNA, die das gewünschte Gen enthält) 15 . <ol><li> Design-Primer mit Restriktionsstellen für das Klonen; Eine 5&#39;-NdeI-Stelle und eine 3&#39;-EcoRI-Stelle werden empfohlen. Andere Standorte können bei Bedarf verwendet werden; Beziehen sich auf den Multicloning-Bereich des ausgewählten Plasmids ( Abbildung S1- S4 ). Wenn gewünscht, bitte entweder ein 5 &#39;oder 3&#39; Codierungs-Tag für Western Blot-Erkennung. </li><li> PCR amplifiziert das gewünschte Gen 15 . </li><li> Analysieren Sie die PCR durch Agarosegelelektrophorese 16 . </li><li> Wenn es unspezifische Amplifikation gibt, reinigen Sie das amplifizierte Gen durch Gel-Extraktion. Wenn nicht, verwenden Sie ein Enzym-Clean-up-Kit. </li><li> Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers durch Überprüfung des AbsorptionsmittelsE bei 260 nm; Leer mit Elutionspuffer 17 . </li></ol></li></ol> 2. Klonen von Genen von Interesse in ein Multigene Expression System Vector, pMGX 18 <ol><li> Die Beschränkung verdrängt das erhaltene Gen von Interesse und den gewünschten Vektor, pMGX, mit NdeI und EcoRI. HINWEIS: Wenn eine große Menge an rezirkulierten Plasmiden erhalten wird, lassen Sie die NdeI-Reaktion 1 h vor der Zugabe von EcoRI ablaufen. <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion mit 0,5-1,5 μg DNA und 1 μl jedes Enzyms mit 4 μl des entsprechenden 10x Puffers. </li><li> Für einen NdeI- und EcoRI-Digest verwenden Sie EcoRI-Puffer und fügen Sie zuerst NdeI-Endonuklease hinzu. Digest für 1 h bei 37 ° C. Dann füge EcoRI-Endonuklease hinzu und lasse den Digest für eine weitere Stunde ablaufen. NdeI ist empfindlich gegenüber Spaltungen nahe am Ende der DNA, so dass die anfängliche Verdauung durch EcoRI eine wirksame Verdauung durch NdeI verhindern kann. </li></ol></li><li> ElektrOphorese die Restriktionsverdauung auf Agarosegel (für ein 1 kb-Gen, verwenden Sie ein 0,7% Agarosegel bei 110 V für 55 min, um den Prozentsatz des Agarosegels für unterschiedliche Gengrößen auszuwählen, siehe Referenz 16 . </li><li> Exzisionseinsatz und Vektorbänder mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge und legen das ausgeschnittene Gelsegment in ein 1,5 mL Röhrchen. </li><li> Extrahieren Sie die DNA aus dem Agarosegel mit einem Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Ligieren Sie das Gen von Interesse in den pMGX-Vektor unter Verwendung eines 3: 1-Insert-zu-Vektor-Verhältnisses; Eine negative Ligation von verdautem pMGX ohne den Einsatz einrichten. <ol><li> Stellen Sie eine 20 &amp; mgr; l Ligationsreaktion ein, die 1 &amp; mgr; l T4-DNA-Ligase, 0,15-0,5 &amp; mgr; g Vektor-DNA (&amp; ndash; 5 &amp; mgr; l) und eine geeignete Menge an Insert auf der Basis eines 3: 1-Insert-zu-Vektor-Verhältnisses und der Grße von &amp; lgr; Das Gen wird eingefügt; Die pMGX-Backbones sind zwischen 5.312 und 5.504 bp groß. Füge eine Negativkontrolle ein, die alles enthältWenn das Gen eingefügt wird. Sicherstellen, dass die Menge an Vektor-DNA in der Negativkontrollligatur äquivalent ist und der Vektor plus Insert-Ligationsreaktionen. </li></ol></li><li> Transformieren von Ligationsreaktionen in XL1-Blue-chemisch kompetente E. coli- Zellen und ligierte Plasmide pMGX- yfg1 (enthaltendes Gen von Interesse 1), pMGX- yfg2 (enthaltendes Gen von Interesse 2) ... pMGX- yfgn (mit Gen von Interesse n). Verwenden Sie aseptische Technik (innerhalb eines Biosicherheitskabinetts oder unter einer Flamme). <ol><li> 100 μl Aliquots von chemisch kompetenten XL1-Blue E. coli auf Eis für 5 min auftauen und dann 5 μl der Ligationsreaktionen hinzufügen. Inkubieren für 30 min auf Eis. </li><li> Schütteln Sie die Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei 42 ° C gehalten wird, und fügen Sie dann 200 &amp; mgr; l kaltes LB hinzu. Inkubieren sie auf Eis für 2 min. </li><li> Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C, 220 U / min für 1 h und dann die Platte 100 μl auf eine LB-Agar-Platte, die eine Zulassung enthält,Eine vorwählbare Markierung (entweder Ampicillin oder Kanamycin). </li></ol></li><li> Screen die Klone für positive Transformanten. <ol><li> Vergleichen Sie die Kolonie zählt auf der negativen Kontrolle und Ligation Platten. Ein Kolonenzählungsverhältnis größer als 1: 2 ist erwünscht. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 2.1 und überprüfen Sie die Notiz. </li><li> Wählen Sie aus jeder Ligationsreaktion der verschiedenen Gene, die zum Screening (1 n) eingefügt wurden, 4-8 einzelne Kolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und inokulieren Sie eine 4 ml LB und die entsprechende Antibiotika-Übernachtkultur / Einzelkolonie. Wachsen Sie Kulturen über Nacht mit Schütteln bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Isolieren Sie Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Richten Sie eine 20 μl NdeI + EcoRI-Digest-Reaktion ein, die 150-500 ng DNA und 1 μl jedes Enzyms mit 2 μl des entsprechenden 10x Puffers enthält. In thIst der Fall, füge NdeI und EcoRI zur gleichen Zeit hinzu, dass das Gen von Interesse zwischen den Restriktionsstellen liegt. Eine negative Kontrolle mit dem leeren pMGX-Vektor wird empfohlen. Digest für 2 h bei 37 ° C im Wasserbad. </li></ol></li></ol> 3. Einfügen von Gen 2 in den pMGX-Vektor, der das Gen 1 enthält, pMGX- yfg1 <ol><li> Restriktions-Digest pMGX- yfg1 mit AvrII und behandeln mit Kalb-Darm-Phosphatase (CIP). <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion, die 0,5-1,5 μg Vektor-DNA (~ 5-10 μl isolierte DNA) und 1 μl AvrII mit 4 μl des entsprechenden 10x Puffers enthält. Digest für 1,5 h bei 37 ° C und füge dann 1,5 μl CIP hinzu. Lassen Sie es bei 37 ° C für weitere 30 min. </li></ol></li><li> Restriktionsverdauung pMGX- yfg2 mit AvrII und XbaI, um das Gen von Interesse zu befreien. <ol><li> Verwenden Sie eine 40 μl Digest-Reaktion, die 0,5-1,5 μg DNA und 1 μ enthält, L jedes Enzyms mit 4 &amp; mgr; l des geeigneten 10 × Puffers. Digest für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektrophorese Restriktion verdaut auf einem entsprechenden Prozent (0,7%) Agarosegel und verbraucht die Insert- und Vektorbänder mit einem sauberen Skalpell / Rasierklinge (siehe Schritte 2.2-2.3). </li><li> Extrahiere die DNA mit einem Gel-Extraktionskit nach dem Protokoll des Herstellers und quantifiziere die DNA 17 . </li><li> Ligat-Gen 2 in pMGX- yfg1 unter Verwendung eines 3: 1-Insert-to-Vektor-Verhältnisses. Richten Sie eine negative Ligation von verdautem pMGX- yfg1 ohne den zusätzlichen Einsatz ein. Einrichten wie oben in Schritt 2.5. </li><li> Verwandeln Sie 5 μl der Ligationsreaktionen in XL1-Blue-chemisch kompetente E. coli- Zellen, ligierte Plasmide pMGX- yfg1,2 (enthaltendes Gen von Interesse 1 und 2) und eine negative pMGX- yfg1- Kontrolle, wie in Schritt 2.6 zu sehen ist. </li><li> Vergleichen Sie die Koloniezahl auf die Negativkontrolle und Ligationsplatten. Ein Kolonienzahlverhältnis gReater als 1: 2 ist erwünscht. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 3.1 und überprüfen Sie die CIP-Behandlung. </li><li> Wählen Sie aus der Ligationsreaktion 4-8 Einzelkolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und inokulieren Sie 4 ml LB plus das entsprechende Antibiotikum pro Einzelkolonie und wachsen über Nacht bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Isolieren Sie Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers und quantifizieren Sie die DNA 17 . </li><li> Screen die effektive Insertion des zweiten Gens durch Durchführen einer Restriktionsverdauung von pMGX- yfg1,2 mit EcoRI. <ol><li> Verwenden Sie eine 20 μl Digest-Reaktion, die 150-500 ng DNA und 1 μl EcoRI-Enzym enthält, mit 2 μl EcoRI 10x Puffer. Digest für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektrophorese die Restriktionsverdauung auf einem geeigneten prozentualen Agarosegel; Suche nach einer Band, die korrespondiertS auf die Größe des Gens 2 (siehe Schritt 2.2). Ein Gen kann in den Vektor in die unerwünschte, umgekehrte Orientierung einfügen. </li></ol> 4. Hinzufügen eines dritten Gens in den pMGX-Vektor, der die Gene 1 und 2 enthält, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Beschränkung digest pMGX- yfg1,2 mit AvrII und behandeln mit CIP, wie in Schritt 3.1 gesehen. </li><li> Einschränkung digest pMGX- yfg3 mit AvrII und XbaI, wie in Schritt 3.2 gesehen. </li><li> Elektrophorese die Restriktion verdaut auf einem geeigneten Prozent Agarosegel und Exzisionseinsatz und Vektorbänder unter Verwendung einer sauberen Skalpell / Rasierklinge; Siehe Schritte 2.2-2.3. </li><li> Extrahieren Sie die DNA aus dem Agarosegel mit einem Gel-Extraktionskit und quantifizieren Sie die DNA 17 . </li><li> Ligat-Gen 3 in pMGX- yfg1,2 unter Verwendung eines 3: 1-Insert-to-Vector-Verhältnisses und stellte eine negative Ligation von verdautem pMGX- yfg1,2 ohne ein zusätzliches Insert auf, wie in Schritt 3.5 zu sehen ist. </li><li> Umwandlung von 5 μl der Ligationsreaktionen in XL1-blaue chemisch kompetente E. coli- Zellen, ligiertes Plasmid pMGX- yfg1,2,3 (enthaltende Gene von Interesse 1, 2 und 3) und negative pMGX- yfg1,2- Kontrolle, wie in Schritt 2.6 gesehen. </li><li> Vergleichen Sie die Koloniezahl auf die Negativkontrolle und Ligationsplatten. Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der negativen Kontrollplatte gibt, gehen Sie zurück zu Schritt 4.1 und überprüfen Sie die CIP-Behandlung. </li><li> Wählen Sie aus der Ligationsreaktion 4-8 einzelne Kolonien (abhängig von der Negativkontrolle: Ligationsverhältnis) und 4xL LB plus das entsprechende Antibiotikum pro Einzelkolonie inokulieren; Über Nacht bei 37 ° C und 220 U / min wachsen. </li><li> Isolieren Sie die Plasmid-DNA unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Screen die effektive Insertion des dritten Gens durch Durchführen einer Restriktionsverdauung von pMGX- yfg1,2,3 mit EcoRI, wie in Schritt 3.10 gesehen. </li><li> Elektrophorese die Restriktionsverdauung auf einem geeigneten prozentualen Agarosegel; SchauFür Banden, die den Größen von Gen 2 und Gen 3 entsprechen (siehe Schritt 2.2). Anmerkung: Gen 3 kann in den Vektor in der unerwünschten, umgekehrten Orientierung einfügen. Wenn die Gene 2 und 3 die gleiche Größe haben, muss eine andere geeignete Beschränkungs-Digest-Site für das Screening ausgewählt werden. HINWEIS: Wiederholen Sie, wie es für jedes neue Gen benötigt wird. </li></ol> 5. Herstellung von Proteinen von Interesse mit einem Multigene Expression System und Bewertung der Produktion durch Western Blotting <ol><li> Verwandeln Sie den positiven Klon, der alle Gene von Interesse enthält, in chemisch kompetente Proteinproduktion E. coli , wie BL21- (λDE3). <ol><li> 100 μl Aliquote von chemisch kompetenten BL21- (λDE3) E. coli auf Eis für 5 min auftauen und dann 1 μl der positiv klonierten Plasmid-DNA zugeben; 30 min auf Eis inkubieren </li><li> Schütteln Sie die Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei 42 ° C gehalten wird, und fügen Sie dann 200 &amp; mgr; l kaltes LB hinzu. Inkubieren auf Eis für 2 min. </li><li>Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C und 220 U / min für 1 h und dann die Platte 100 μl auf eine LB-Agar-Platte, die den geeigneten selektierbaren Marker (entweder Ampicillin oder Kanamycin) enthält. </li></ol></li><li> Expression des Proteins durch Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Induktion. <ol><li> Wählen Sie eine isolierte Kolonie aus der B21- (λDE3) Transformationsplatte und inokulieren Sie 4 ml LB plus das entsprechende Antibiotikum; Wachsen über Nacht und schütteln bei 37 ° C und 220 U / min. </li><li> Inokulieren Sie eine 100 ml LB plus die entsprechende antibiotische Kultur mit 1 ml über Nacht Kultur. </li><li> Bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 U / min auf eine OD 600 von 0,6 wachsen. </li><li> Die Kultur mit 100 μM IPTG induzieren und 15 h bei 25 ° C und 220 U / min wachsen lassen. </li><li> 1 ml der Kultur entfernen und bei 13000 xg für 1 min zentrifugieren; Den Überstand verwerfen. </li></ol></li><li> Lyse die Zellen mit Lyse-Lösung gemäß den Anweisungen des HerstellersUnd präformieren einen Western-Blot des löslichen Zelllysats, um festzustellen, ob alle Proteine ​​erfolgreich produziert wurden 19 . </li></ol>

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	<li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+wave+of+synthetic+biology:+from+modules+to+systems.">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li><li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway.">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li><li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids.">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li><li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli.">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li><li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli.">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li><li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli.">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li><li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylneuraminic+Acid+Production+in+Escherichia+coli+Lacking+N-Acetylglucosamine+Catabolic+Machinery.">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li><li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts:+experimental+procedures,+database+tracking+and+case+studies.">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li><li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli.">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li><li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli.">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li><li>Kim, K. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes.">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li><li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li><li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector.">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li><li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer.">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016)</li><li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: <a target="_blank" href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot">https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016)</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Koexpression mehrerer Gene ist immer wichtiger, insbesondere bei der Charakterisierung und Rekonstitution komplexer, multigener Stoffwechselwege 3 , 4 , 5 . Das pMGX-System macht die Multigene-Koexpression in der E. coli- Routine 6 , 7 , 8 und ist für verschiedene Forscher zugänglich. In dieser Studie wurden fünf Protei...

Die Koexpression mehrerer Proteine ​​ist zunehmend von wesentlicher Bedeutung, vor allem in synthetischen Biologieanwendungen, bei denen mehrere Funktionsmodule ausgedrückt werden müssen 1 ; Bei der Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen, wo Expression und Funktion oft Co-Expression 2 , 3 erfordern; Und bei der Charakterisierung und Nutzung von Biosynthesewegen, wo jedes Gen im Weg ausgedrückt werden muss 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Eine Reihe von Systemen wurde für die Co-Expression entwickelt, insbesondere im Wirtsorganismus Escherichia coli , dem Arbeitspferd für die rekombinante Protein-Expression des Labors 9 . Zum Beispiel können mehrere Plasmide mit unterschiedlichen selektierbaren Markern verwendet werden, um einzelne Proteine ​​unter Verwendung einer Fülle von verschiedenen ex zu exprimieren<html> Druckvektoren 10 , 11 . Einzelne Plasmidsysteme für die multiple Proteinexpression haben entweder mehrere Promotoren verwendet, um die Expression jedes Gens 10 , 12 zu kontrollieren; Synthetische Operons, wo mehrere Gene auf einem einzigen Transkript 2 , 13 codiert sind; Oder in einigen Fällen ein einzelnes Gen, das für ein Polypeptid kodiert, das letztlich proteolytisch verarbeitet wird, wobei die gewünschten interessierenden Proteine 14 erhalten werden . <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Abbildung 1: pMGX-Workflow, der den Aufbau eines polycistronischen Vektors zeigt. Das pMGX-System bietet eine flexible, einfach zu bedienende Strategie für den Bau von synthetischen Operons unter der Kontrolle eines induzierbaren T7-Promotors.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase ( Fig. 1 ) beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Es basiert auf einem Plasmidsystem, das ursprünglich pKH22 genannt wurde und das für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen 6 , 7 , 8 erfolgreich eingesetzt wurde . Hier wird dieser Plasmidsatz um vier verwandte Vektoren erweitert: pMGX-A, ein Expressionsvektor ohne C- oder N-terminale Markierungen und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker; PMGX-hisA, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Ampicillin-Resistenzmarker kodiert; PMGX-K, ein Expressionsvektor lAcking alle C- oder N-terminalen Markierungen und mit dem Kanamycin-Resistenz-Marker; Und pMGX-hisK, ein Expressionsvektor, der für ein N-terminales Hexahistidin-Tag und mit dem Kanamycin-Resistenzmarker kodiert. In dieser Studie wird das Verfahren zur Erzeugung eines polycistronischen Vektors, der fünf Gene enthält, unter Verwendung des pMGX-Systems, insbesondere pMGX-A, zusammen mit der erfolgreichen Produktion jedes einzelnen Proteins in Escherichia coli gezeigt .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemically comeptent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Supplied with polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized instant skim milk powder</td><td>Local grocery store</td><td></td><td>No-name grocery store milk is adequate</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membrane PT 0.45 &amp;micro;m 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolation Kit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Design primers as needed for desired gene</td></tr><tr><td>Synthetic Gene</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Design and optimize as needed</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemically competent cells</td><td></td><td></td><td>Comeptent cell prepared in house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Razors</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocylcer</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, supplied by Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

inducible t7 rna polymerase-mediated multigene expression system, pmgx

Die Co-Expression mehrerer Proteine ​​ist für die synthetische Biologie immer wichtiger, studiert Protein-Protein-Komplexe und charakterisiert und nutzt Biosynthesewege. In diesem Manuskript wird die Verwendung eines hochwirksamen Systems für die Konstruktion von multigenen synthetischen Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase beschrieben. Dieses System erlaubt es, dass viele Gene gleichzeitig aus einem Plasmid exprimiert werden. Hier ist ein Satz von vier verwandten Vektoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K und pMGX-hisK, entweder mit dem Ampicillin- oder Kanamycin-resistente Marker (A und K) und entweder mit einem N-terminalen Hexahistidin oder einem N-terminalen Hexahistidin Tag (seine) werden offenbart. Detaillierte Protokolle für die Konstruktion von synthetischen Operen, die dieses Vektorsystem verwenden, werden zusammen mit den entsprechenden Daten bereitgestellt, was zeigt, dass ein pMGX-basiertes System, das fünf Gene enthält, leicht konstruiert und verwendet werden kann, um alle fünf codierten Proteine ​​in Escherichia coli zu produzieren . Dieses systEm und Protokoll ermöglicht es Forschern, routinemäßig komplexe Mehrkomponentenmodule und Wege in E. coli auszudrücken.

In dieser Studie war es das Ziel, fünf Proteine ​​aus einem einzigen Plasmid zu exprimieren. Die Fünf-Codon-optimierten synthetischen Genfragmente, die entweder N- oder C-terminale Hexahistidin-Markierungen codieren, wurden kommerziell gekauft. Die synthetischen Gene wurden durch PCR amplifiziert und einzeln in einen PCR-stumpfen Vektor kloniert und sequenziert. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf interessierenden Gene zuerst in ein geeignetes pMGX-Plasmid...

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

13.2K Aufrufe.  University of Ottawa.  Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems. 

Serie: Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Forschung

Umwelt

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Genetik

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly useful. Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based constructs is an efficient method for genetic manipulation of hepatocytes in adult mice. In addition to constitutive transgene expression, this system can be used for more advanced applications, such as shRNA-mediated gene knock-down, implication of the CRISPR/Cas9 system to induce gene mutations, or inducible systems. Here, the combination of constitutive CreER expression together with inducible expression of a transgene or miR-shRNA of choice is presented as an example of this technique. We cover the multi-step procedure starting from the preparation of sleeping beauty-transposon constructs, to the injection and treatment of mice, and the preparation of liver tissue for analysis by immunostaining. The system presented is a reliable and efficient approach to achieve complex genetic manipulations in hepatocytes. It is specifically useful in combination with Cre/loxP-based mouse strains and can be applied to a variety of models in the research of liver disease.

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hydrodynamic tail vein injection of transposon-based integration vectors enables stable transfection of murine hepatocytes in vivo. Here, we present a practical protocol for transfection systems that enables the long-term constitutive expression of a single transgene or combined constitutive and doxycycline-inducible expression of a transgene or miR-shRNA in the liver.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Biochemie

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunologie und Infektion

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

DNA-Tethered RNA Polymerase für programmierbare In-vitro-Transkription und molekulare Berechnung

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Biotechnik

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Biologie

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56613">Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

Induzierbare Tet-On-regulierbare systembasierte Genexpression in vivo: Ein Tetracyclin-induziertes Genexpressionssystem für die Aktivierung der Zielgentranskription im Mausmodell

Source: Hubner, E. K. et al.&#160; Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein ...