Viral Yaşam Döngülerini In Vitro Araştırmak için SARS-CoV-2 Virüsü Benzeri Bir Parçacık Sisteminin Üretimi

Gerçek virüsü yakından taklit eden SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklar üretmek için optimize edilmiş bir in vitro protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, bir biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarı gerektirme kısıtlamaları olmadan viral enfeksiyon, montaj ve çıkış mekanizmalarının araştırılmasını sağlar.

Şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) virüs benzeri parçacık (SC2-VLP) yöntemi, biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) laboratuvarlarına ihtiyaç duymadan SARS-CoV-2 yaşam döngüsünü incelemek için güçlü ve erişilebilir bir araç sunar. Bu sistem, viral partikül üretiminin hassas ve hassas tespiti için T20 sinyaline kaynaşmış bir lusiferaz raportörü kullanarak montaj, genom paketleme ve çıkış dahil olmak üzere viral yaşam döngüsünün kritik aşamalarını etkili bir şekilde taklit eder. SC2-VLP'ler, HEK-293T hücrelerinde RNA paketleme sinyali ile birlikte membran (M), nükleokapsid (N), zarf (E) ve spike (S) dahil olmak üzere SARS-CoV-2 yapısal proteinlerinin birlikte eksprese edilmesiyle üretilir. Geleneksel virüs benzeri parçacık sistemlerinin aksine, SC2-VLP yöntemi, doğru miktar tayini ve doğal viral yaşam döngüsüne daha fazla sadakat sağlar. Ayrıca, S proteininin HIV bazlı lentiviral partiküllere dahil edilmesi yoluyla viral girişi incelemekle sınırlı olan lentiviral psödotipleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, SC2-VLP sistemi, SARS-CoV-2 biyolojisinin birden fazla aşamasını keşfetmek için daha kapsamlı bir platform sağlar. Bu yöntem, canlı virüsü işleme risklerini atlar ve erişilebilirliği genişletir. SC2-VLP yöntemi, antiviral araştırmalarda ve SARS-CoV-2'ye karşı terapötik stratejilerin geliştirilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder.

COVID-19 salgını, modern tarihin en yıkıcı küresel sağlık krizlerinden biri olarak ortaya çıkmış ve dünya çapında milyonlarca ölümle sonuçlanmıştır¹. Virüsten sorumlu SARS-CoV-2, enfeksiyon, genom replikasyonu, montaj ve çıkış gibi temel aşamaları içeren karmaşık bir yaşam döngüsünü takip eder. Enfeksiyon süreci, viral spike proteini (S) konak hücre reseptörü olan Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim 2'ye (ACE2) bağlandığında başlar ve viral genomun konak hücre^2,3'e salınmasını kolaylaştırır. Viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) daha sonra genomik RNA'nın replikasyonunu katalize eder. Bu RNA, nükleokapsid proteini (N) ile kompleks halinde, zar proteini (M) tarafından tanınan kararlı bir yapı oluşturur. M proteini, RNA-N kompleksini, S'yi ve zarf proteinini (E) işe alarak viral montajda merkezi bir rol ^oynar4,5. Montajdan sonra, virion, kanonik olmayan lizozom aracılı bir kaçakçılık yolu⁶ aracılığıyla çıkışını tamamlar.

Pandemiye yanıt olarak, aşılar, nötralize edici antikorlar ve antiviral ilaçlar geliştirmek için önemli küresel kaynaklar seferber edildi. Bu müdahalelerin değerlendirilmesi, SARS-CoV-2 araştırmalarının ilerletilmesinde çok önemli olmuştur⁷. Bununla birlikte, virüsü içeren deneylerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) laboratuvarlarında yapılması gerektiğinden, canlı virüsü incelemek önemli lojistik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. BSL-3 tesislerinin sınırlı mevcudiyeti, SARS-CoV-2'yi anlamayı ve bunlarla mücadele etmeyi amaçlayan araştırmaların hızını kısıtlamıştır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, SARS-CoV-2 araştırmalarında iki ana sistem - virüs benzeri parçacık (VLP) ve lentiviral psödotipleme - yaygın olarak benimsenmiştir ve her ikisi de BSL-3 muhafazası⁸ gerektirmez. VLP sistemi, birlikte virüs benzeri parçacıklar üreten M, S, E ve N dahil olmak üzere viral yapısal proteinleri kodlayan genlerle hücrelerin birlikte transfeksiyonunu içerir. Bu parçacıklar virüsün yapısal ve işlevsel özelliklerini taklit eder, bu da onları SARS-CoV-2 yaşam döngüsündeki temel süreçleri incelemek için değerli bir araç ve hatta aşı geliştirme için etkili bir antijen haline getirir ^9,10,11.

Tersine, lentiviral psödotipleme sistemi, lentivirüsteki Veziküler Stomatit Virüsü (VSV) G proteininin SARS-CoV-2 S proteini ile değiştirilmesini içerir ve lusiferaz veya GFP gibi raportör genleri içerebilen lentiviral partiküllerin üretimini sağlar. Bu sistem özellikle S-ACE2 etkileşimini bloke eden nötralize edici antikorları araştırmak için kullanışlıdır¹². Bununla birlikte, lentiviral psödotipleme, plazma zarında partikül salınımına aracılık eden HIV yapısal proteinlerinin kullanımı nedeniyle SARS-CoV-2 viral montajını veya çıkışını yansıtmaz.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, Syed ve ark. yakın zamanda RNA genomu içinde SARS-CoV-2 paketleme sinyalini tanımladı ve bu da N proteininin viral genom tanımaya yönelik özgüllüğünü gösteriyor¹³. Bu paketleme sinyalini raportör genlere kaynaştırarak, bu genleri SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklara (SC2-VLP'ler) verimli bir şekilde dahil etmek ^{mümkündür13}. Bu strateji yalnızca SARS-CoV-2 montaj ve çıkış süreçlerini kopyalamakla kalmaz, aynı zamanda enfeksiyon adımlarının hassas bir şekilde ölçülmesine de olanak tanır. Bu çalışmada, SC2-VLP sistemini kullanmak için deneysel metodolojiyi tanıtıyoruz ve bu yaklaşımı yürütmek için temel hususları vurguluyoruz.

1. SC2-VLP'lerin Oluşturulması

1. %10 v/v FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş, DMEM tam ortamlı 10 cm çapında doku kültürü plakasında ~^{3.0 × 10 6} HEK-293T hücresi tohumlayın.
   NOT: Yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum SC2-VLP üretimini sağlamak için, HEK-293T hücreleri düşük geçiş sayılarında ~ 10 tutulmalıdır.
2. HEK-293T hücresini 37 °C'de, %5 CO_2'de yaklaşık 24 saat kültürleyin ve mikroskop altında hücre birleşmesini kontrol edin. ~%70 birleşikse devam edin.
3. 60 μL PEI'yi 1 mg / mL stoktan serum içermeyen ortam ile 200 μL'ye seyreltin.
4. 200 μL serumsuz ortama 6.7 μg N plazmit, 10 μg Luc-T20 plazmit, 0.016 μg S plazmid ve 3.3 μg M-IRES-E plazmidi ekleyin (bkz. Ek Dosya 1).
5. Adım 1.3'ten seyreltilmiş PEI'yi, adım 1.4'ten viral yapı proteinlerini kodlayan plazmitleri içeren çözeltiye yavaşça ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bu transfeksiyon çözümüdür.
6. Transfeksiyon solüsyonunu adım 1.5'ten HEK-293T hücrelerine dikkatlice bırakın ve iyice karıştırmak için doku kültürü plakasını hafifçe döndürün.
7. Enfeksiyondan 6 saat sonra hücre kültürü ortamını DMEM tam ortamı ile değiştirin ve transfekte edilmiş HEK-293T hücrelerini 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 48 saat boyunca inkübe edin.
8. SC2-VLP'leri içeren enfekte HEK-293T hücrelerinin süpernatantını toplayın ve ardından hücre kalıntılarını gidermek için süpernatanı 0.45 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün. Bu SC2-VLP ortamıdır.
   NOT: HeLa, Vero E6 ve Caco2 hücre hatlarında SC2-VLP'ler üretmeye çalıştık, ancak protokolün HEK-293T hücreleri için özgüllüğünü gösteren ölçülebilir bir viral titre elde edilmedi.

2. SC2-VLP etkinliğinin incelenmesi

NOT: ACE2 ve TMPRSS2'yi stabil bir şekilde eksprese eden HEK-293T hücre hattı, bir lentiviral transdüksiyon yaklaşımı^14,15 kullanılarak kurulmuştur. Hem ACE2 hem de TMPRSS2'nin protein ekspresyonu, Adım 3'te (SC2-VLP kompozisyon analizi) tarif edilene benzer bir protokol izlenerek western blot analizi ile doğrulandı.

1. 4.0 × 10⁴ HEK-293T hücresini, ACE2'nin kararlı ekspresyonu ile tohumlayın ve 96 oyuklu bir plakada TMPRSS2 ve adım 1.8'den itibaren 50 μL SC2-VLP ortamı ekleyin.
2. 96 oyuklu doku kültürü plakasını 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 24 saat inkübe edin.
3. Ortamı 96 oyuklu plakadan çıkarın ve 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ ve 1.8 mM KH₂PO₄ içeren 37 ° C'de 100 μL PBS tamponu ile bir kez yıkayın.
4. HEK-293T ACE2/TMPRSS2 hücrelerini 20 μL pasif lizis tamponu ile parçalayın, numuneyi oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca hafifçe sallayın.
   NOT: Lizis tamponu 25 mM Tris-fosfat (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminosikloheksan-N,N,N',N'-tetraasetik asit, 1.25 mg/mL lizozim, 2.5 mg/mL BSA, %10 gliserol ve %1 Triton X-100 içerir).
5. 96 oyuklu plakayı soğutmalı bir mikroplaka santrifüjünde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4.000 × g'da döndürün ve ardından plakayı hemen bir buz banyosuna aktarın.
6. Opak beyaz 96 oyuklu bir plakaya 100 μL sulandırılmış lusiferaz tahlil tamponu alın ve adım 2.5'ten 20 μL lizat ekleyin. 2-3 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek kısa bir süre karıştırın.
7. Aşağıdaki parametrelere sahip bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün: Algılama modu: Lüminesans; Dalga boyu aralığı: Tam spektrum; Plaka formatı: 96 oyuklu standart opak plaka; Entegrasyon süresi: 200 ms.

3. SC2-VLP bileşiminin incelenmesi

1. Adım 1.8'den itibaren 10 mL SC2-VLP ortamına %50 PEG 8000 ve %2.2 NaCl içeren 1.36 mL PEG 8000 çözeltisi ekleyin.
2. Karışımı bir orbital çalkalayıcı üzerinde tutun ve çözeltiyi gece boyunca 4 °C'de yavaşça karıştırın.
3. Çözeltiyi 4 ° C'de, 2.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin ve batı lekeleme analizi¹⁶ için SC2-VLP peletini toplayın.
   NOT: Western blotlama analizi için antikorlarla ilgili tüm bilgiler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

4. SC2-VLP üreten hücrelerde S ve mutantlarının hücre altı lokalizasyon analizi

1. ~ 3.0 × 10⁶ HEK-293T hücresini 15 mm çapında cam tabanlı kültür kabına eşit şekilde tohumlayın ve daha sonra hücrelerin transfeksiyondan önce ~% 70 birleşene kadar yapışmasına ve büyümesine izin verin.
2. Transfeksiyon prosedürünü 1.3 ila 1.7 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi tekrarlayın ve yalnızca plazmit miktarlarını aşağıdaki gibi değiştirin: N plazmit: 1.3 μg, Luc-T20 plazmit: 2 μg, S plazmit: 0.0032 μg ve M-IRES-E plazmit: 0.66 μg.
3. Kültür kabını 1 mL buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve ardından oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) fiksasyon solüsyonu ekleyin.
4. Hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın ve ardından RT'de 1 mL %0.25 Triton X-100 10 dakika ekleyerek hücrelere geçirgen hale getirin.
5. Hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın ve daha sonra spesifik olmayan antikor etkileşimlerini bloke etmek için RT'de 1 saat boyunca 1 mL% 5 sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
6. ~ 200 μL primer antikor çözeltisi (cam tabanı kaplayacak kadar) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Birincil antikor çözeltileri, aşağıdaki seyreltme oranlarında PBS içinde çözünmüş %5 BSA içinde seyreltilerek hazırlanır: fare anti-S antikoru 1:200'de, tavşan anti-Sec61β antikoru 1:200'de, tavşan anti-GM130 antikoru 1:200'de ve tavşan anti-ERGIC53 antikoru 1:200'de. % 5 BSA / PBS çözeltisi, sonraki immünofloresan boyama prosedürleri sırasında spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için hem seyreltici hem de bloke edici tampon görevi gördü.
7. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ardından hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
8. RT'de 1 saat boyunca floresan konjuge ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve daha sonra hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
   NOT: Floresan konjugatların foto-ağartılmasını önlemek ve sinyal bütünlüğünü korumak için sonraki tüm adımlar karanlıkta veya minimum ışığa maruz kalma altında gerçekleştirilmelidir. Fare veya tavşandan türetilen iki tip floresan konjuge ikincil antikor, S proteinini veya hücre organel işaretleyici proteinlerini boyamak için kullanılır.
9. Çekirdekleri RT'de 2.5 μg / mL Hoechst çözeltisi ile 5 dakika boyayın ve ardından hücreleri RT'de 1 mL PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
10. S proteini veya organel boyamasını gözlemleyin ve aşağıdaki parametrelerle konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüler elde edin: Otomatik konfokal diyafram açıklığına sahip VBF (ortalama yok, satır sıralı tarama) olarak ayarlanmış PMT modu. Kanal 1 (FITC) için, 488 - 25 nm emisyon, HV 500 V, 525x kazanç ve %525 ofset ile %1 güçte 5 nm lazeri kullanın. Kanal 2 (Alexa Fluor 594) için, 594 nm lazeri 25 - 610 nm emisyon, HV 670 V, kazanç 500x ve %1 ofset ile %5 güçte kullanın. Kanal 3 (DAPI) için, 430 - 470 nm emisyon, HV 490 V, kazanç 1x kazanç ve %5 ofset ile %25 güçte 405 nm lazeri kullanın.

SARS-CoV-2 yaşam döngüsünün çıkış ve montaj adımları, enfeksiyon ve replikasyon adımlarından daha az çalışılmıştır^17,18. SC2-VLP yöntemi geliştirilmeden önce, bu süreçler yalnızca canlı SARS-CoV-2 kullanılarak araştırılabiliyordu ve araştırmayı BSL-3 laboratuvarlarıyla sınırlıyordu¹³. Şekil 1'de gösterilen SC2-VLP iş akışı, deneysel protokolün ana hatlarını çizer ve SARS-CoV-2 yaşam döngüsünün bu adımlarında yer alan süreçleri gösterir. Bu yaklaşımda, SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerini (M, E, S ve N) ve RNA paketleme sinyalini (T20) kodlayan plazmitler, HEK-293T hücrelerine birlikte transfekte edilir. T20 sinyaline kaynaşmış bir lusiferaz raporlayıcı, salınan SC2-VLP'lerin hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar ve bu daha sonra Şekil 2'de gösterildiği gibi SARS-CoV-2 reseptörleri ACE2 ve TMPRSS2'yi eksprese eden alıcı hücreleri enfekte edebilir.

SARS-CoV-2 yapısal proteinlerini kodlayan plazmid miktarını ve paketleme sinyalini, özellikle S plazmidini optimize etmek için, HEK-293T hücrelerini değişen konsantrasyonlarda S plazmidi ile transfekte ettik. Sonuçlar, 1:10'luk bir S plazmid-diğer plazmit oranının SC2-VLP üretimi için en uygun koşulları sağladığını ortaya koydu (Şekil 2). Bu bulgu, Syed ve arkadaşları tarafından hazırlanan önceki bir raporla uyumludur ve SARS-CoV-2 virionlarında en bol bulunan bileşenlerden biri olmasına rağmen, S proteininin ekspresyon seviyesinin M, N ve E proteinlerine kıyasla neden nispeten daha düşük olduğunu makul bir şekilde açıklamaktadır.

SC2-VLP sistemi, SARS-CoV-2 montaj sürecini incelemek için güçlü bir model görevi görür ve hem viral zarf oluşumunu hem de genom paketlemesini aslına uygun olarak özetler. Mevcut kanıtlar, M proteininin montajdaki merkezi rolünü vurgulamakta ve N, S ve E dahil olmak üzere diğer yapısal proteinlerin işe alınmasını kolaylaştırmaktadır. Bu proteinlerin immün boyama, hücre altı organeller, muhtemelen SARS-CoV-2 montajının birincil bölgeleri olan ERGIC veya cis-Golgi kompleksi içindeki lokalizasyonlarını ortaya koymaktadır^19,20. Bu, SC2-VLP sisteminin viral montaj mekanizmalarını incelemek için değerli bir araç olarak potansiyelinin altını çizmektedir. S'nin montajdaki rolünü daha fazla araştırmak için, COPI aracılı S sıralamasını bozan ve böylece S'nin viryonlara ^21,22 dahil olmasını bozan H1271E mutasyonunu tanıttık. Alıcı hücrelerde, bu mutasyon lusiferaz aktivitesini önemli ölçüde azalttı ve SC2-VLP sisteminin yalnızca viral enfeksiyonu aslına uygun olarak özetlemekle kalmayıp, aynı zamanda geleneksel lentiviral psödotipleme sistemlerine erişilemeyen bir süreç olan SARS-CoV-2 montajını araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet ettiğini doğruladı (Şekil 3). Ayrıca, H1,255E gibi virion montajını zayıflatabilecek ve viral titreleri azaltabilecek ek mutasyonları tanımlamak için S C-terminal kuyruğundaki bireysel kalıntıları (1,273-1271) hedefleyen kapsamlı bir mutasyon tarama yaklaşımı kullandık. Şekil 3, E1262H mutasyonunun SC2-VLP üretimini önemli ölçüde azalttığını, H1271E/E1262H çift mutantının ise onu tamamen ortadan kaldırdığını göstermektedir. Bu sonuçlar, E1262'yi tanımlanamayan konak faktörleri ile potansiyel etkileşimlerde ima eder. Bu bölgeye bağlanan konakçı proteinlerin, özellikle E1261'e bağımlı olanların daha fazla karakterizasyonu, SARS-CoV-2 montajını yöneten yeni mekanizmaları ortaya çıkarabilir. Toplu olarak, bu bulgular SC2-VLP'leri hücre kültürü sistemlerinde viral montajı incelemek için çok yönlü ve fizyolojik olarak ilgili bir platform olarak kurar.

SC2-VLP üreten hücrelerde S proteininin hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için, hem vahşi tip S proteininin hem de H1271E mutantının immün boyama analizini gerçekleştirdik. Sonuçlar, S proteininin ağırlıklı olarak cis-Golgi markörü GM130 ile kolokalize olduğunu, ER markörü Sec61β veya ERGIC markörü ERGIC-53 ile minimum örtüşme gösterdiğini göstermektedir. Bu bulgular, otantik SARS-CoV-2 enfeksiyonunda S hücre altı lokalizasyonunun önceki gözlemleriyle uyumludur²³. Buna karşılık, H1271E mutantı dağınık bir dağılım modeli sergiledi ve cis-Golgi işaretleyicisi GM130 ile kolokalizasyon göstermedi. Bu, mutasyonun viral montaj bölgesine uygun lokalizasyonu bozduğunu ve potansiyel olarak SARS-CoV-2 virion montajını kolaylaştırma yeteneğinin bozulmasını açıkladığını göstermektedir (Şekil 4). Bu sonuçlar ayrıca SC2-VLP'leri S ve diğer viral yapısal proteinlerin biyolojik fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araç olarak ortaya koymaktadır.

Şekil 1: SC2-VLP üretiminin ve uygulamalarının şematik gösterimi. SARS-CoV-2 genomik RNA paketleme sinyali olan T20, camgöbeği ile vurgulanırken, S proteini koyu yeşil renkle gösterilir. Plazmitler, M, E, N ve S dahil olmak üzere SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerini kodlar ve M ve E tek bir vektörden birlikte eksprese edilir. Oklarla gösterildiği gibi montaj (açık yeşil), çıkış (açık mavi) ve enfeksiyon (turuncu) dahil olmak üzere viral yaşam döngüsünün temel aşamaları gösterilmektedir. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-virüs benzeri parçacık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SC2-VLP titresinin S'yi kodlayan plazmidin transfekte edilen miktarına duyarlılığı . (A) SARS-CoV-2 yapısal proteinlerini ve gRNA paketleme sinyalini kodlayan plazmitlerin transfeksiyon miktarlarını gösteren tablo. (B) SC2-VLP titresi, S'yi kodlayan plazmidin transfekte edilen miktarına yanıt olarak değişir. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-virüs benzeri parçacık; gRNA= kılavuz RNA; RLU = bağıl lüminesans birimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: SC2-VLP sistemi, S'nin viryonlara montajını araştırmak için kullanılır. (A) COPI kaçakçılığını etkileyen S mutantları, SC2-VLP titresinde bir azalmaya yol açar. (B) SC2-VLP'lerde SARS-CoV-2 S ve N protein bolluğunun Western blot analizi. (C) S paketleme verimliliği (B)'den hesaplanmıştır, SC2-VLP bolluğu N protein seviyelerine normalize edilmiştir. (D) (B)'den SC2-VLP bolluğunun miktarının belirlenmesi. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-virüs benzeri parçacık; RLU = bağıl lüminesans birimleri; Ctr = kontrol; WT = vahşi tip; mut = mutant; NS = önemli değil. Tam uzunlukta SARS-CoV-2 spike (S) proteinine karşılık gelen bant S olarak etiketlenirken, S2 fragmanı (kalıntılar 816-1,273) S proteininin C-terminal kısmını temsil eder ve S ile S2 arasındaki spesifik olmayan bir bant NS²⁴ olarak belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: S hücre altı lokalizasyonunu araştırmak için kullanılan SC2-VLP sistemi. (A-I) SC2-VLP üreten HEK-293T hücrelerinde WT S'nin hücre organeli belirteçlerinin birlikte boyanması ile temsili immün boyama görüntüsü. (A-C) ER belirteci: (DF) Sec61β, (G-I) ERGIC belirteci: ERGIC-53; cis-Golgi kompleksi işaretleyicisi: GM130. (J-L) S E1262H mutantının cis-Golgi işaretleyici GM130 ile kolokalizasyonu. S yeşil renkle gösterilir, hücre organeli belirteçleri kırmızı renkle gösterilir ve hücre çekirdeği mavi renkle boyanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: N, Luc-T20 plazmidi, S plazmidi ve M-IRES-E plazmitlerinin DNA dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

BSL-3 laboratuvarlarının kısıtlamaları olmadan hücre kültürü sistemlerinde SARS-CoV-2 yaşam döngüsünü modellemek için basit ve etkili bir yöntem, anti-SARS-CoV-2 araştırmaları için çok önemli bir ilerlemeyi temsil eder. SC2-VLP yöntemi, sağlam ve erişilebilir bir platform sunarak bu ihtiyacı karşılar. Bu çalışmada, SC2-VLP'lerin üretilmesi için kritik deneysel adımların ana hatlarını çizen SC2-VLP yöntemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, SARS-CoV-2 biyolojisi anlayışımızı ilerletmede ve antiviral stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmada çok yönlülüğünü ve potansiyel uygulamalarını vurguluyoruz.

Geleneksel SARS-CoV-2 VLP ve lentiviral psödotipleme yöntemleri, anti-SARS-CoV-2 araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ^8,25. Geleneksel VLP yönteminde, SARS-CoV-2 yapısal proteinleri M, N, E ve S, viral partiküller²⁶ oluşturmak için birlikte eksprese edilir ve bollukları tipik olarak WB analizi ile izlenir. Bununla birlikte, viral yapısal proteinler, eksozomlar gibi diğer zar yapılarına da dahil edilir ve bu da viral partiküllerin WB analizini karmaşıklaştırır²⁷. Buna karşılık, SC2-VLP yöntemi, T20 sinyaline kaynaşmış bir raportör geni içerir ve raportörün viral partiküller halinde verimli bir şekilde paketlenmesini sağlar. Bu, yalnızca WB analizine güvenmeden partikül bolluğunun hassas ve spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, SC2-VLP yöntemi, geleneksel VLP yöntemine kıyasla canlı SARS-CoV-2'nin tüm yaşam döngüsünü daha sadık bir şekilde taklit eder.

SC2-VLP yöntemi, birçok kritik açıdan lentiviral psödotipleme yaklaşımını aşmaktadır. Lentiviral psödotipleme sistemi, viryonların plazma zarından toplandığı ve tomurcuklandığı HIV-1 virüs çerçevesine dayanır. Buna karşılık, SARS-CoV-2 virionları, ERGIC veya cis-Golgi kompleksi içinde bir araya getirilir ve yaşam döngülerindeki temel bir farkı vurgular. Bu tutarsızlık, lentiviral psödotipleme yöntemini, SARS-CoV-2 yaşam döngüsünün replikasyon, montaj ve çıkış gibi temel aşamalarını incelemek için uygun hale getiremez hale getirir ve uygulanabilirliğini viral giriş ve enfeksiyonun araştırılmasına sınırlar.

SC2-VLP yöntemi, SARS-CoV-2 yaşam döngüsünü incelemek için basit ve güçlü bir araçtır. Otantik virüsü içermeyerek, bu yöntem BSL-3 tesislerine erişim gerektirmeden birçok laboratuvar tarafından benimsenebilir. Bununla birlikte, doğruluklarını ve biyolojik alaka düzeylerini sağlamak için canlı SARS-CoV-2 kullanarak SC2-VLP sisteminden elde edilen bulguları doğrulamak çok önemlidir.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki (BUCM) (90011451310011) Başlangıç fonu programı tarafından desteklenmiştir. Deneylerle ilgili paha biçilmez tartışma ve yardım için BUCM'deki Dr. Ma laboratuvarının tüm üyelerine şükranlarımızı sunuyoruz.