JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا محسنا في المختبر لإنتاج جزيئات شبيهة بفيروس SARS-CoV-2 تحاكي الفيروس الأصلي عن كثب. يتيح هذا النهج التحقيق في العدوى الفيروسية ، والتجميع ، وآليات الخروج دون قيود الحاجة إلى مختبر من المستوى 3 للسلامة البيولوجية.

Abstract

توفر طريقة الجسيمات الشبيهة بفيروس المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة - فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) أداة قوية ويمكن الوصول إليها لدراسة دورة حياة SARS-CoV-2 دون الحاجة إلى مختبرات السلامة البيولوجية من المستوى 3 (BSL-3). يحاكي هذا النظام بشكل فعال المراحل الحرجة من دورة الحياة الفيروسية ، بما في ذلك التجميع وتغليف الجينوم والخروج ، باستخدام مراسل لوسيفيراز مدمج في إشارة T20 للكشف الحساس والدقيق عن إنتاج الجسيمات الفيروسية. يتم إنشاء SC2-VLPs عن طريق التعبير المشترك عن البروتينات الهيكلية SARS-CoV-2 ، بما في ذلك الغشاء (M) ، والنوكليوكابسيد (N) ، والمغلف (E) ، والارتفاع (S) ، جنبا إلى جنب مع إشارة تغليف الحمض النووي الريبي في خلايا HEK-293T. على عكس أنظمة الجسيمات التقليدية الشبيهة بالفيروسات ، تضمن طريقة SC2-VLP القياس الكمي الدقيق ودقة أكبر لدورة الحياة الفيروسية الطبيعية. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع طرق التنميط الزائف الفيروسي ، والتي تقتصر على دراسة دخول الفيروس من خلال دمج بروتين S في جزيئات الفيروسات العدسية القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية ، يوفر نظام SC2-VLP منصة أكثر شمولا لاستكشاف مراحل متعددة من بيولوجيا SARS-CoV-2. بينما تتجاوز هذه الطريقة مخاطر التعامل مع الفيروسات الحية وتوسع إمكانية الوصول. تمثل طريقة SC2-VLP تقدما كبيرا في الأبحاث المضادة للفيروسات وتطوير الاستراتيجيات العلاجية ضد SARS-CoV-2.

Introduction

برزت جائحة COVID-19 كواحدة من أكثر الأزمات الصحية العالمية تدميرا في التاريخ الحديث ، مما أدى إلى وفاة ملايين الأشخاص في جميع أنحاءالعالم 1. يتبع الفيروس المسؤول ، SARS-CoV-2 ، دورة حياة معقدة تتضمن مراحل رئيسية مثل العدوى وتكرار الجينوم والتجميع والخروج. تبدأ عملية العدوى عندما يرتبط بروتين السنبلة الفيروسي (S) بمستقبل الخلية المضيفة ، إنزيم محول الأنجيوتنسين 2 (ACE2) ، مما يسهل إطلاق الجينوم الفيروسي في الخلية المضيفة2،3. ثم يحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي الفيروسي (RdRp) تكرار الحمض النووي الريبي الجيني. يشكل هذا الحمض النووي الريبي ، المركب مع بروتين النوكليوكابسيد (N) ، بنية مستقرة يتعرف عليها بروتين الغشاء (M). يلعب بروتين M دورا مركزيا في التجميع الفيروسي عن طريق تجنيد مركب RNA-N ، S ، وبروتين الغلاف (E) 4،5. بعد التجميع ، يكمل الفيروس خروجه من خلال مسار الاتجار بوساطة الليزوزوم غير المتعارفعليه 6.

واستجابة للجائحة، تم حشد موارد عالمية كبيرة لتطوير اللقاحات والأجسام المضادة المعادلة والأدوية المضادة للفيروسات. كان تقييم هذه التدخلات ضروريا في النهوض بأبحاث SARS-CoV-27. ومع ذلك ، فإن دراسة الفيروس الحي تمثل تحديات لوجستية كبيرة ، حيث يجب إجراء التجارب التي تنطوي على الفيروس في مختبرات السلامة البيولوجية من المستوى 3 (BSL-3). أدى التوافر المحدود لمرافق BSL-3 إلى تقييد وتيرة البحث التي تهدف إلى فهم ومكافحة SARS-CoV-2.

لمواجهة هذه التحديات ، تم اعتماد نظامين رئيسيين - الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) والتنميط الزائف الفيروسي - على نطاق واسع في أبحاث SARS-CoV-2 ، وكلاهما لا يتطلب احتواء BSL-38. يتضمن نظام VLP التعداء المشترك للخلايا مع الجينات التي تشفر البروتينات الهيكلية الفيروسية ، بما في ذلك M و S و E و N ، والتي تولد معا جزيئات شبيهة بالفيروسات. تحاكي هذه الجسيمات الخصائص الهيكلية والوظيفية للفيروس ، مما يجعلها أداة قيمة لدراسة العمليات الرئيسية في دورة حياة SARS-CoV-2 ، وحتى مستضد فعال لتطوير اللقاح9،10،11.

على العكس من ذلك ، يتضمن نظام التنميط الكاذب الفيروسي العدسي استبدال بروتين فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) G في الفيروس العدسي ببروتين SARS-CoV-2 S ، مما يتيح إنتاج جزيئات الفيروسات العدسية التي يمكن أن تتضمن جينات المراسل مثل لوسيفيراز أو GFP. هذا النظام مفيد بشكل خاص لفحص تحييد الأجسام المضادة التي تمنع تفاعل S-ACE212. ومع ذلك ، فإن التنميط الكاذب الفيروسي العدسي لا يعكس التجمع الفيروسي SARS-CoV-2 أو الخروج بسبب استخدام البروتينات الهيكلية لفيروس نقص المناعة البشرية ، والتي تتوسط إطلاق الجسيمات في غشاء البلازما.

للتغلب على هذه القيود ، حدد سيد وآخرون مؤخرا إشارة تغليف SARS-CoV-2 داخل جينوم الحمض النووي الريبي الخاص به ، مما يوضح خصوصية بروتين N تجاه التعرف على الجينوم الفيروسي13. من خلال دمج إشارة التغليف هذه مع جينات المراسل ، من الممكن دمج هذه الجينات بكفاءة في الجسيمات الشبيهة بفيروس SARS-CoV-2 (SC2-VLPs) 13. لا تكرر هذه الإستراتيجية عمليات تجميع وخروج SARS-CoV-2 فحسب ، بل تسمح أيضا بالقياس الحساس لخطوات العدوى. في هذه الدراسة ، نقدم المنهجية التجريبية لاستخدام نظام SC2-VLP ونسلط الضوء على الاعتبارات الرئيسية لإجراء هذا النهج.

Protocol

1. توليد SC2-VLPs

  1. البذور ~ 3.0 × 106 خلايا HEK-293T في صفيحة زراعة الأنسجة بقطر 10 سم مع وسط DMEM كامل ، مكملة بنسبة 10٪ من النفط / الحجمي FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين.
    ملاحظة: لضمان كفاءة عالية في التعدين والإنتاج الأمثل SC2-VLP ، يجب الحفاظ على خلايا HEK-293T عند أرقام مرور منخفضة ~ 10.
  2. استزراع خلية HEK-293T عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة تقريبا ، وتحقق من التقاء الخلية تحت المجهر. تابع إذا ~ 70٪ ملتقية.
  3. تمييع 60 ميكرولتر من PEI من 1 مجم / مل إلى 200 ميكرولتر مع وسيط خال من المصل.
  4. أضف 6.7 ميكروغرام من بلازميد N ، و 10 ميكروغرام من بلازميد Luc-T20 ، و 0.016 ميكروغرام من بلازميد S ، و 3.3 ميكروغرام من بلازميد M-IRES-E في 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل (انظر الملف التكميلي 1).
  5. أضف PEI المخفف برفق من الخطوة 1.3 إلى المحلول الذي يحتوي على بلازميدات مشفرة لبروتينات البنية الفيروسية من الخطوة 1.4 ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. هذا هو حل التعداد.
  6. قم بإسقاط محلول التعداء بحذر من الخطوة 1.5 على خلايا HEK-293T ، وقم بتدوير لوحة زراعة الأنسجة برفق للخلط الشامل.
  7. تبادل وسط زراعة الخلايا بعد 6 ساعات من الإصابة بوسط DMEM الكامل ، واحتضان خلايا HEK-293T المنقولة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
  8. اجمع المادة الطافية لخلايا HEK-293T المصابة ، والتي تحتوي على SC2-VLPs ، ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة بقايا الخلية. هذا هو وسيط SC2-VLP.
    ملاحظة: حاولنا إنتاج SC2-VLPs في خطوط خلايا HeLa و Vero E6 و Caco2 ، ولكن لم يتم الحصول على عيار فيروسي قابل للقياس ، مما يشير إلى خصوصية البروتوكول لخلايا HEK-293T.

2. فحص فعالية SC2-VLP

ملاحظة: تم إنشاء خط خلايا HEK-293T الذي يعبر بثبات عن ACE2 و TMPRSS2 باستخدام نهج نقل الفيروساتالعدسية 14،15. تم تأكيد التعبير البروتيني لكل من ACE2 و TMPRSS2 عن طريق تحليل اللطخة الغربية ، باتباع بروتوكول مشابه لتلك الموصوفة في الخطوة 3 (تحليل تكوين SC2-VLP).

  1. البذور 4.0 × 104 خلايا HEK-293T مع التعبير المستقر عن ACE2 و TMPRSS2 في صفيحة 96 بئرا وإضافة 50 ميكرولتر من وسط SC2-VLP من الخطوة 1.8.
  2. احتضان لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  3. قم بإزالة الوسط من اللوحة المكونة من 96 بئرا ، واغسلها مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS عند 37 درجة مئوية ، تحتوي على 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي أمبيرNa 2HPO4 ، و 1.8 ملي مولار KH2PO4.
  4. قم بعمل خلايا HEK-293T ACE2 / TMPRSS2 مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل السلبي ، وهز العينة برفق لمدة 15 دقيقة على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت للتحلل على 25 ملي مولار من تريس فوسفات (الرقم الهيدروجيني 7.8) ، و 2 ملي مولار DTT ، و 2 ملي مولار 1،2-ديامينوسيلوهكسان-N ، N ، N ′ ، N حمض رباعي الأسيتيك ، 1.25 مجم / مل ليزوزيم ، 2.5 مجم / مل BSA ، 10٪ جلسرين ، و 1٪ تريتون X-100).
  5. قم بتدوير اللوحة المكونة من 96 بئرا عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد ، ثم انقل اللوحة على الفور إلى حمام جليدي.
  6. خذ 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص لوسيفيراز المعاد تكوينه إلى صفيحة بيضاء غير شفافة مكونة من 96 بئرا ، وأضف 20 ميكرولتر من المحللة من الخطوة 2.5. امزجها لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 2-3 مرات.
  7. قم بقياس اللمعان باستخدام قارئ لوحة بالمعلمات التالية: وضع الكشف: اللمعان. نطاق الطول الموجي: طيف كامل. شكل اللوحة: لوحة معتمة قياسية 96 بئر ؛ وقت التكامل: 200 مللي ثانية.

3. فحص تكوين SC2-VLP

  1. أضف 1.36 مل من محلول PEG 8000 ، الذي يحتوي على 50٪ PEG 8000 و 2.2٪ كلوريد الصوديوم ، إلى 10 مل من وسط SC2-VLP من الخطوة 1.8.
  2. احتفكي بالخليط على شاكر مداري ، واخلطي المحلول ببطء عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. الطرد المركزي المحلول عند 4 درجات مئوية ، 2,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وجمع حبيبات SC2-VLP لتحليل النشاف الغربي16.
    ملاحظة: بالنسبة لتحليل النشاف الغربي ، يتم توفير جميع المعلومات المتعلقة بالأجسام المضادة في جدول المواد.

4. تحليل التوطين تحت الخلوي ل S وطفراتها في الخلايا المنتجة ل SC2-VLP

  1. البذور ~ 3.0 × 106 خلايا HEK-293T بالتساوي في طبق الثقافة ذو القاع الزجاجي بقطر 15 مم ، ثم اسمح للخلايا بالالتصاق والنمو حتى ~ 70٪ التقاء قبل التعدين.
  2. كرر إجراء التعدي كما هو موضح في الخطوات من 1.3 إلى 1.7 وقم بتعديل كميات البلازميد فقط على النحو التالي: N البلازميد: 1.3 ميكروغرام ، بلازميد Luc-T20: 2 ميكروغرام ، بلازميد S: 0.0032 ميكروغرام ، وبلازميد M-IRES-E: 0.66 ميكروغرام.
  3. اغسل طبق الاستزراع برفق مرتين باستخدام 1 مل من PBS المثلج ، ثم أضف 1 مل من محلول تثبيت بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  4. اغسل الخلايا لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT ، ثم تخلل الخلايا بإضافة 1 مل من 0.25٪ Triton X-100 في RT لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل الخلايا لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT ، ثم أضف 1 مل من ألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ (BSA) في RT لمدة ساعة واحدة لمنع تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة.
  6. أضف ~ 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (يكفي لتغطية قاع الزجاج) واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يتم تحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخفيف في 5٪ BSA المذاب في PBS بنسب التخفيف التالية: الجسم المضاد للفأر المضاد S عند 1: 200 ، والجسم المضاد للأرانب المضاد ل Sec61β عند 1: 200 ، والجسم المضاد للأرانب المضاد ل GM130 عند 1: 200 ، والجسم المضاد للأرانب المضاد ERGIC53 عند 1: 200. كان محلول BSA / PBS بنسبة 5٪ بمثابة مخزن مؤقت مخفف ومانع لتقليل الارتباط غير المحدد أثناء إجراءات تلطيخ التألق المناعي اللاحقة.
  7. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي ، ثم اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT.
  8. أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالتألق في RT لمدة 1 ساعة ، ثم اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام أو تحت الحد الأدنى من التعرض للضوء لمنع التبييض الضوئي للمتقارنات الفلورية والحفاظ على سلامة الإشارة. يتم استخدام نوعين من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالتألق ، والتي تشتق من الفأر أو الأرانب ، لتلطيخ بروتين S أو بروتينات علامة عضية الخلية.
  9. قم بصبغ النوى بمحلول Hoechst 2.5 ميكروغرام / مل في RT لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام 1 مل من PBS في RT.
  10. راقب تلوين بروتين S أو العضية واحصل على صور باستخدام مجهر متحد البؤر مع المعلمات التالية: وضع PMT مضبوطة على VBF (بدون متوسط ، مسح متتابع للخط) مع فتحة تلقائية متحدة البؤر. بالنسبة للقناة 1 (FITC) ، استخدم ليزر 488 نانومتر بقوة 25٪ مع انبعاث 500 - 548 نانومتر ، وارتفاع 525 فولت ، وكسب 1x ، وإزاحة 5٪. بالنسبة للقناة 2 (Alexa Fluor 594) ، استخدم ليزر 594 نانومتر بقوة 25٪ مع انبعاث 610 - 670 نانومتر ، HV 500 V ، كسب 1x ، وإزاحة 5٪. بالنسبة للقناة 3 (DAPI) ، استخدم ليزر 405 نانومتر بقوة 25٪ مع انبعاث 430 - 470 نانومتر ، والجهد العالي 490 فولت ، والكسب 1x ، والإزاحة 5٪.

النتائج

تمت دراسة خطوات الخروج والتجميع لدورة حياة SARS-CoV-2 أقل من خطوات العدوى والتكاثرالمتماثل 17،18. قبل تطوير طريقة SC2-VLP ، لا يمكن التحقيق في هذه العمليات إلا باستخدام SARS-CoV-2 الحي ، مما يقتصر البحث على مختبرات BSL-313. يحدد سير عمل SC2-VLP ، الموضح في الشكل 1 ، البروتوكول التجريبي ويوضح العمليات المتضمنة في هذه الخطوات من دورة حياة SARS-CoV-2. في هذا النهج ، يتم نقل البلازميدات التي تشفر البروتينات الهيكلية ل SARS-CoV-2 (M و E و S و N) وإشارة تغليف الحمض النووي الريبي (T20) إلى خلايا HEK-293T. يتيح مراسل لوسيفيراز المدمجة في إشارة T20 الكشف الحساس عن SC2-VLPs التي تم إصدارها ، والتي يمكن أن تصيب بعد ذلك الخلايا المتلقية التي تعبر عن مستقبلات SARS-CoV-2 ACE2 و TMPRSS2 ، كما هو موضح في الشكل 1.

لتحسين كمية البلازميد الذي يشفر البروتينات الهيكلية SARS-CoV-2 وإشارة التعبئة ، وخاصة البلازميد S ، قمنا بنقل خلايا HEK-293T بتركيزات متفاوتة من بلازميد S. كشفت النتائج أن نسبة البلازميد S إلى البلازميد الآخر البالغة 1:10 توفر الظروف المثلى لإنتاج SC2-VLP (الشكل 2). تتوافق هذه النتيجة مع تقرير سابق صادر عن Syed et al. وتشرح بشكل معقول لماذا ، على الرغم من كونه أحد أكثر المكونات وفرة في فيروسات SARS-CoV-2 ، فإن مستوى التعبير عن بروتين S أقل نسبيا مقارنة ببروتينات M و N و E.

يعمل نظام SC2-VLP كنموذج قوي لدراسة عملية تجميع SARS-CoV-2 ، حيث يلخص بأمانة كل من تكوين الغلاف الفيروسي وتغليف الجينوم. تسلط الأدلة الحالية الضوء على الدور المركزي لبروتين M في التجميع ، مما يسهل تجنيد البروتينات الهيكلية الأخرى ، بما في ذلك N و S و E. يكشف التلوين المناعي لهذه البروتينات عن توطينها داخل العضيات تحت الخلوية ، على الأرجح مركب ERGIC أو cis-Golgi ، المواقع الأساسية لتجميع SARS-CoV-219،20. وهذا يؤكد إمكانات نظام SC2-VLP كأداة قيمة لتشريح آليات التجميع الفيروسي. لمزيد من التحقيق في دور S في التجميع ، قدمنا طفرة H1271E ، التي تعطل فرز S بوساطة COPI ، وبالتالي تضعف دمج S في الفيروسات21،22. في الخلايا المتلقية ، قللت هذه الطفرة بشكل كبير من نشاط لوسيفيراز ، مما يؤكد أن نظام SC2-VLP لا يلخص العدوى الفيروسية بأمانة فحسب ، بل يعمل أيضا كأداة قوية للتحقيق في تجميع SARS-CoV-2 - وهي عملية لا يمكن الوصول إليها من قبل أنظمة الأنماط الزائفة التقليدية للفيروسات العدسية (الشكل 3). استخدمنا أيضا نهجا شاملا للمسح الطفري ، مستهدفا المخلفات الفردية (1،255-1،273) في ذيل S C-terminal لتحديد الطفرات الإضافية التي ، مثل H1271E ، قد تخفف من تجميع الفيروسات وتقلل من العيارات الفيروسية. يوضح الشكل 3 أن طفرة E1262H تقلل بشكل كبير من إنتاج SC2-VLP ، في حين أن الطفرة المزدوجة H1271E / E1262H تلغيها تماما. تشير هذه النتائج إلى تورط E1262 في التفاعلات المحتملة مع عوامل مضيف غير محددة. قد يكشف التوصيف الإضافي للبروتينات المضيفة المرتبطة بهذه المنطقة ، لا سيما تلك التي تعتمد على E1261 ، عن آليات جديدة تحكم تجميع SARS-CoV-2. بشكل جماعي ، تؤسس هذه النتائج SC2-VLPs كمنصة متعددة الاستخدامات وذات صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة التجميع الفيروسي في أنظمة زراعة الخلايا.

لتقييم التوطين الخلوي لبروتين S في الخلايا المنتجة ل SC2-VLP ، أجرينا تحليل التلوين المناعي لكل من بروتين S من النوع البري وطفرة H1271E. توضح النتائج أن بروتين S يتزامن في الغالب مع علامة رابطة الدول المستقلة GM130 ، بينما يظهر الحد الأدنى من التداخل مع علامة ER Sec61β أو علامة ERGIC ERGIC-53. تتوافق هذه النتائج مع الملاحظات السابقة لتوطين الخلايا الفرعية S في عدوى SARS-CoV-2 الأصلية23. في المقابل ، أظهر طفرة H1271E نمط توزيع منتشر ولم تظهر أي تحديد مشترك مع علامة رابطة الدول المستقلة جولجي GM130. يشير هذا إلى أن الطفرة تعطل التوطين المناسب لموقع التجميع الفيروسي ، مما قد يفسر ضعف قدرتها على تسهيل تجميع الفيروس SARS-CoV-2 (الشكل 4). تؤسس هذه النتائج أيضا أن SC2-VLPs هي أداة قيمة لدراسة الوظائف البيولوجية ل S والبروتينات الهيكلية الفيروسية الأخرى.

figure-results-4161
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإنتاج SC2-VLP وتطبيقاته. يتم تمييز إشارة تغليف الحمض النووي الريبي الجينومي SARS-CoV-2 ، T20 ، باللون السماوي ، بينما يظهر بروتين S باللون الأخضر الداكن. تقوم البلازميدات بتشفير البروتينات الهيكلية ل SARS-CoV-2 ، بما في ذلك M و E و N و S ، مع التعبير المشترك عن M و E من ناقل واحد. يتم توضيح المراحل الرئيسية لدورة حياة الفيروس ، بما في ذلك التجميع (الأخضر الفاتح) ، والخروج (الأزرق الفاتح) ، والعدوى (البرتقالي) ، كما هو موضح في الأسهم. الاختصارات: SARS-CoV-2 = متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة - فيروس كورونا 2 ؛ SC2-VLP = جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5090
الشكل 2: حساسية عيار SC2-VLP للكمية المنقولة من البلازميد المشفر S. (أ) يوضح الجدول كميات تعداء البلازميدات التي تشفر البروتينات الهيكلية SARS-CoV-2 وإشارة تغليف gRNA. (ب) يختلف عيار SC2-VLP استجابة للكمية المنقولة من البلازميد الذي يشفر S. الاختصارات: SARS-CoV-2 = متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة - فيروس كورونا 2 ؛ SC2-VLP = جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2 ؛ gRNA = دليل الحمض النووي الريبي ؛ RLU = وحدات التلألؤ النسبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5893
الشكل 3: نظام SC2-VLP المستخدم للتحقيق في تجميع S في فيريونات. (أ) تؤدي الطفرات التي تؤثر على الاتجار بقانون COPI إلى انخفاض عيار SC2-VLP. (ب) تحليل اللطخة الغربية لوفرة بروتين SARS-CoV-2 S و N في SC2-VLPs. (C) كفاءة التعبئة S محسوبة من (B) ، مع وفرة SC2-VLP تطبيع إلى مستويات البروتين N. (د) التقدير الكمي لوفرة SC2-VLP من (B). الاختصارات: SARS-CoV-2 = متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة - فيروس كورونا 2 ؛ SC2-VLP = جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2 ؛ RLU = وحدات التلألؤ النسبية ؛ Ctr = التحكم ؛ WT = النوع البري ؛ mut = متحول. NS = غير معنوي. تم تصنيف النطاق المقابل لبروتين SARS-CoV-2 (S) كامل الطول على أنه S ، بينما يمثل جزء S2 (البقايا 816-1،273) الجزء الطرفي C من البروتين S ، ويشار إلى نطاق غير محدد بين S و S2 على أنه NS24. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7077
الشكل 4: نظام SC2-VLP المستخدم للتحقيق في التوطين تحت الخلوي S. (أ-أ) صورة تلغيم مناعية تمثيلية ل WT S في خلايا HEK-293T المنتجة ل SC2-VLP مع تلطيخ مشترك لعلامات عضيات الخلية. (أ-ج) علامة ER: (D-F) Sec61β ، (G-I) ERGIC العلامة: ERGIC-53 ؛ علامة مركب رابطة الدول المستقلة-جولجي: GM130. (J-L) التوطين المتحولة S E1262H مع علامة رابطة الدول المستقلة جولجي GM130. يظهر S باللون الأخضر ، ويتم عرض علامات عضية الخلية باللون الأحمر ، ونواة الخلية ملطخة باللون الأزرق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: تسلسل الحمض النووي لبلازميد N و Luc-T20 و S البلازميد و M-IRES-E. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تمثل الطريقة البسيطة والفعالة لنمذجة دورة حياة SARS-CoV-2 في أنظمة زراعة الخلايا ، دون قيود مختبرات BSL-3 ، تقدما محوريا لأبحاث مكافحة SARS-CoV-2. تلبي طريقة SC2-VLP هذه الحاجة ، حيث توفر نظاما أساسيا قويا ويمكن الوصول إليه. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لطريقة SC2-VLP ، يحدد الخطوات التجريبية الحاسمة لإنتاج SC2-VLPs. بالإضافة إلى ذلك ، نسلط الضوء على تعدد استخداماته وتطبيقاته المحتملة في تعزيز فهمنا لبيولوجيا SARS-CoV-2 وتسهيل تطوير استراتيجيات مضادة للفيروسات.

تستخدم طرق SARS-CoV-2 VLP التقليدية والتنميط الكاذب الفيروسي على نطاق واسع في أبحاث مكافحة SARS-CoV-28،25. في طريقة VLP التقليدية ، يتم التعبير المشترك عن البروتينات الهيكلية ل SARS-CoV-2 M و N و E و S لتوليد جزيئاتفيروسية 26 ، مع مراقبة وفرة عادة عن طريق تحليل WB. ومع ذلك ، يتم دمج البروتينات الهيكلية الفيروسية أيضا في هياكل الأغشية الأخرى ، مثل الإكسوسومات ، مما يعقد تحليل WB للجزيئات الفيروسية27. على النقيض من ذلك ، تشتمل طريقة SC2-VLP على جين مراسل مدمج في إشارة T20 ، مما يتيح التعبئة الفعالة للمراسل في جزيئات فيروسية. وهذا يسمح بالكشف الحساس والمحدد عن وفرة الجسيمات دون الاعتماد فقط على تحليل WB. علاوة على ذلك ، تحاكي طريقة SC2-VLP بشكل أكثر أمانة دورة الحياة الكاملة ل SARS-CoV-2 الحية مقارنة بطريقة VLP التقليدية.

تتجاوز طريقة SC2-VLP نهج التنميط الكاذب الفيروسي في العديد من الجوانب الحرجة. يعتمد نظام التنميط الكاذب الفيروسي على إطار فيروس فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، حيث يتم تجميع الفيروسات وتبرعمها من غشاء البلازما. في المقابل ، يتم تجميع فيرونات SARS-CoV-2 داخل مركب ERGIC أو cis-Golgi ، مما يسلط الضوء على اختلاف جوهري في دورات حياتها. هذا التناقض يجعل طريقة النمط الكاذب للفيروسات العدسية غير مناسبة لدراسة المراحل الرئيسية لدورة حياة SARS-CoV-2 ، مثل التكاثر والتجميع والخروج ، مما يحد من قابليتها للتطبيق على التحقيق في دخول الفيروس والعدوى.

تعد طريقة SC2-VLP أداة بسيطة وقوية لدراسة دورة حياة SARS-CoV-2. من خلال عدم إشراك الفيروس الأصلي ، يمكن اعتماد هذه الطريقة من قبل العديد من المختبرات دون الحاجة إلى الوصول إلى مرافق BSL-3. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري التحقق من صحة النتائج المستمدة من نظام SC2-VLP باستخدام SARS-CoV-2 الحي لضمان دقتها وأهميتها البيولوجية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج صندوق الشركات الناشئة في جامعة بكين للطب الصيني (BUCM) (90011451310011). نعرب عن امتناننا لجميع أعضاء مختبر الدكتور ما في BUCM على المناقشة التي لا تقدر بثمن والمساعدة في التجارب.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine Serum Albumin (BSA)Cell Signaling Technology9998S
Confocal Laser Scanning MicroscopeOlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermofisherA5670402
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) antibodyInvitrogenA11001dilution ratio: IF 1:1000
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) antibodyAbcamab150080dilution ratio: IF 1:1000
HEK-293T cell lineNational Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)NICR-293T-001To ensure high transfection efficiency and optimal SC2-VLP production, HEK-293T cells should be maintained at low passage numbers (≤ P10).
Hoechst 33342InvitrogenH1399Working concentration: 2.5 μg/mL
Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
Mouse monoclonal anti-GAPDHProteintech60004-1-Igdilution ratio: WB 1:20,000
Mouse monoclonal anti-S RBDAbclonalA23771dilution ratio: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070serum-free medium for transfection
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
Penicillin-StreptomycinThermofisher15140122
Polyethyleneimine (PEI)Thermofisher43896.01
Promega passive lysis bufferPromegaE1941
Rabbit polyclonal anti-ACE2Proteintech21115-1-APdilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-ERGIC53Proteintech13364-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-GM130Proteintech11308-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-SAbcamab272504dilution ratio: WB 1:1000
Rabbit polyclonal anti-Sec61βProteintech15087-1-APdilution ratio: IF 1:200
Rabbit polyclonal anti-TMPRSS2Abcamab109131dilution ratio: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmidAddgene177938
SARS-CoV-2 N plasmidAddgene177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAbAbclonalA21042dilution ratio: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plasmidAddgene177960
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Mouse IgG (H+L)Invitrogen31460dilution ratio: WB 1:5000
Secondary Antibody, HRP, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Invitrogen31430dilution ratio: WB 1:5000
SpectraMax i3x plate reader Molecular DevicesSpectraMax i3x

References

  1. Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
  2. Shang, J., et al. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).
  3. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly. Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).
  5. Han, Y., et al. SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains. J Virol. 98 (11), e0103624(2024).
  6. Ghosh, S., et al. beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).
  7. Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. Treatments for COVID-19. Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).
  8. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  9. Sultana, R., Stahelin, R. V. Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems. Virology. 601, 110285(2025).
  10. Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system. Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).
  11. Plescia, C. B., et al. SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles. J Biol Chem. 296, 100103(2021).
  12. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  13. Syed, A. M., et al. Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles. Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).
  14. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  15. Matsuyama, S., et al. Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).
  16. Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).
  17. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).
  18. Yang, H., Rao, Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).
  19. Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond. Viruses. 16 (11), 1648(2024).
  20. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).
  21. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor. Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).
  22. Dey, D., et al. A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs. Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).
  23. Christie, S. M., et al. Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions. Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).
  24. Guo, L., et al. Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).
  25. Mi, D., Hu, J., Qian, Z. A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein. Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).
  26. Swann, H., et al. Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles. Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).
  27. Xia, B., et al. Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2. Cell Discov. 9 (1), 2(2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

220 SARS CoV 2 COVID 19

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved