Produção de um sistema de partículas semelhante ao vírus SARS-CoV-2 para investigar os ciclos de vida virais in vitro

Apresentamos um protocolo in vitro otimizado para a produção de partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 que imitam de perto o vírus autêntico. Essa abordagem permite a investigação dos mecanismos de infecção, montagem e saída viral sem as restrições de exigir um laboratório de nível 3 de biossegurança.

O método de partícula semelhante ao vírus da síndrome respiratória aguda grave do coronavírus 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) oferece uma ferramenta poderosa e acessível para estudar o ciclo de vida do SARS-CoV-2 sem a necessidade de laboratórios de nível de biossegurança 3 (BSL-3). Este sistema imita efetivamente os estágios críticos do ciclo de vida viral, incluindo montagem, empacotamento do genoma e saída, usando um repórter de luciferase fundido ao sinal T20 para detecção sensível e precisa da produção de partículas virais. As SC2-VLPs são geradas pela co-expressão de proteínas estruturais do SARS-CoV-2, incluindo membrana (M), nucleocapsídeo (N), envelope (E) e pico (S), juntamente com o sinal de empacotamento de RNA em células HEK-293T. Ao contrário dos sistemas tradicionais de partículas semelhantes a vírus, o método SC2-VLP garante quantificação precisa e maior fidelidade ao ciclo de vida viral natural. Além disso, em comparação com os métodos de pseudotipagem lentiviral, que se limitam a estudar a entrada viral por meio da incorporação da proteína S em partículas lentivirais baseadas no HIV, o sistema SC2-VLP fornece uma plataforma mais abrangente para explorar vários estágios da biologia do SARS-CoV-2. Embora esse método ignore os riscos de lidar com vírus vivos e expanda a acessibilidade. O método SC2-VLP representa um avanço significativo na pesquisa antiviral e no desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra o SARS-CoV-2.

A pandemia de COVID-19 emergiu como uma das crises globais de saúde mais devastadoras da história moderna, resultando em milhões de mortes em todo o mundo¹. O vírus responsável, SARS-CoV-2, segue um ciclo de vida complexo que inclui estágios-chave, como infecção, replicação do genoma, montagem e saída. O processo de infecção começa quando a proteína spike viral (S) se liga ao receptor da célula hospedeira, a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2), facilitando a liberação do genoma viral na célula hospedeira ^2,3. A RNA polimerase dependente de RNA viral (RdRp) então catalisa a replicação do RNA genômico. Este RNA, em complexo com a proteína do nucleocapsídeo (N), forma uma estrutura estável que é reconhecida pela proteína de membrana (M). A proteína M desempenha um papel central na montagem viral, recrutando o complexo RNA-N, S, e a proteína do envelope (E) ^{4 , 5} . Após a montagem, o vírion completa sua saída por meio de uma via de tráfego mediada por lisossomos não canônica⁶.

Em resposta à pandemia, recursos globais substanciais foram mobilizados para desenvolver vacinas, anticorpos neutralizantes e medicamentos antivirais. A avaliação dessas intervenções tem sido essencial para o avanço da pesquisa sobre o SARS-CoV-2⁷. No entanto, o estudo do vírus vivo apresenta desafios logísticos significativos, pois os experimentos envolvendo o vírus devem ser conduzidos em laboratórios de Nível de Biossegurança 3 (BSL-3). A disponibilidade limitada de instalações BSL-3 restringiu o ritmo das pesquisas destinadas a entender e combater o SARS-CoV-2.

Para enfrentar esses desafios, dois grandes sistemas de partículas semelhantes a vírus (VLP) e pseudotipagem lentiviral - foram amplamente adotados na pesquisa de SARS-CoV-2, ambos os quais não requerem contenção BSL-3⁸. O sistema VLP envolve a co-transfecção de células com genes que codificam proteínas estruturais virais, incluindo M, S, E e N, que juntas geram partículas semelhantes a vírus. Essas partículas imitam as propriedades estruturais e funcionais do vírus, tornando-as uma ferramenta valiosa para estudar processos-chave no ciclo de vida do SARS-CoV-2 e até mesmo um antígeno eficaz para o desenvolvimento de vacinas ^9,10,11.

Por outro lado, o sistema de pseudotipagem lentiviral envolve a substituição da proteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV) no lentivírus pela proteína SARS-CoV-2 S, permitindo a produção de partículas lentivirais que podem incorporar genes repórteres, como luciferase ou GFP. Esse sistema é particularmente útil para investigar anticorpos neutralizantes que bloqueiam a interação S-ACE2¹². No entanto, a pseudotipagem lentiviral não reflete a montagem ou saída viral do SARS-CoV-2 devido ao uso de proteínas estruturais do HIV, que medeiam a liberação de partículas na membrana plasmática.

Para superar essas limitações, Syed et al. identificaram recentemente o sinal de empacotamento do SARS-CoV-2 em seu genoma de RNA, o que demonstra a especificidade da proteína N em relação ao reconhecimento do genoma viral¹³. Ao fundir esse sinal de empacotamento aos genes repórteres, é possível incorporar eficientemente esses genes em partículas semelhantes ao vírus SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)¹³. Essa estratégia não apenas replica os processos de montagem e saída do SARS-CoV-2, mas também permite a medição sensível das etapas de infecção. Neste estudo, apresentamos a metodologia experimental para o uso do sistema SC2-VLP e destacamos as principais considerações para a condução dessa abordagem.

1. Geração de SC2-VLPs

1. Semear ~ 3,0 × 10⁶ células HEK-293T em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm de diâmetro com meio completo DMEM, suplementado com 10% v / v FBS e 1% de penicilina-estreptomicina.
   NOTA: Para garantir alta eficiência de transfecção e produção ideal de SC2-VLP, as células HEK-293T devem ser mantidas em números de passagem baixos ~ 10.
2. Cultivar a célula HEK-293T a 37 °C, 5% de CO₂ durante cerca de 24 h e verificar a confluência celular ao microscópio. Prossiga se ~ 70% confluente.
3. Diluir 60 μL de PEI de 1 mg/mL para 200 μL com meio sem soro.
4. Adicione 6,7 μg de plasmídeo N, 10 μg de plasmídeo Luc-T20, 0,016 μg de plasmídeo S e 3,3 μg de plasmídeo M-IRES-E em 200 μL de meio livre de soro (consulte o Arquivo Suplementar 1).
5. Adicione suavemente o PEI diluído da etapa 1.3 à solução contendo plasmídeos que codificam as proteínas da estrutura viral da etapa 1.4 e incube em temperatura ambiente por 10 min. Esta é a solução de transfecção.
6. Solte cuidadosamente a solução de transfecção da etapa 1.5 nas células HEK-293T e gire suavemente a placa de cultura de tecidos para uma mistura completa.
7. Troque o meio de cultura celular 6 h após a infecção pelo meio completo DMEM e incube as células HEK-293T transfectadas a 37 ° C, 5% CO₂ por 48 h.
8. Colete o sobrenadante das células HEK-293T infectadas, que contém as SC2-VLPs, e filtre o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover os detritos celulares. Este é o meio SC2-VLP.
   NOTA: Tentamos produzir SC2-VLPs em linhagens celulares HeLa, Vero E6 e Caco2, mas nenhum título viral mensurável foi obtido, indicando a especificidade do protocolo para células HEK-293T.

2. Exame da eficácia do SC2-VLP

NOTA: A linhagem celular HEK-293T expressando de forma estável ACE2 e TMPRSS2 foi estabelecida usando uma abordagem de transdução lentiviral ^14,15. A expressão proteica de ACE2 e TMPRSS2 foi confirmada pela análise de western blot, seguindo um protocolo semelhante ao descrito na Etapa 3 (análise da composição SC2-VLP).

1. Semeie 4,0 × 10⁴ células HEK-293T com expressão estável de ACE2 e TMPRSS2 em uma placa de 96 poços e adicione 50 μL de meio SC2-VLP a partir da etapa 1.8.
2. Incubar a placa de cultura de tecidos de 96 poços a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 h.
3. Remova o meio da placa de 96 poços e lave uma vez com 100 μL de tampão PBS a 37 ° C, contendo 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ e 1,8 mM de KH₂PO₄.
4. Lise as células HEK-293T ACE2/TMPRSS2 com 20 μL de tampão de lise passivo, balançando suavemente a amostra por 15 min em um agitador orbital à temperatura ambiente.
   NOTA: O tampão de lise contém 25 mM de Tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM de DTT, 2 mM de ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetracético, 1,25 mg/mL de lisozima, 2,5 mg/mL de BSA, 10% de glicerol e 1% de Triton X-100).
5. Gire a placa de 96 poços a 4.000 × g por 15 min a 4 ° C em uma centrífuga de microplacas refrigerada e, em seguida, transfira imediatamente a placa para um banho de gelo.
6. Pegue 100 μL de tampão de ensaio de luciferase reconstituída para uma placa branca opaca de 96 poços e adicione 20 μL de lisado da etapa 2.5. Misture-os brevemente pipetando para cima e para baixo 2-3x.
7. Meça a luminescência usando um leitor de placas com os seguintes parâmetros: Modo de detecção: Luminescência; Faixa de comprimento de onda: espectro completo; Formato da placa: placa opaca padrão de 96 poços; Tempo de integração: 200 ms.

3. Exame da composição do SC2-VLP

1. Adicione 1,36 mL de solução de PEG 8000, contendo 50% de PEG 8000 e 2,2% de NaCl, a 10 mL de meio SC2-VLP da etapa 1.8.
2. Manter a mistura num agitador orbital e misturar lentamente a solução a 4 °C durante a noite.
3. Centrifugue a solução a 4 °C, 2.000 × g por 30 min e colete o pellet SC2-VLP para análise de western blotting¹⁶.
   NOTA: Para a análise de western blotting, todas as informações sobre os anticorpos são fornecidas na Tabela de Materiais.

4. Análise da localização subcelular de S e seus mutantes em células produtoras de SC2-VLP

1. Semeie ~ 3,0 × 10⁶ células HEK-293T uniformemente na placa de cultura com fundo de vidro com 15 mm de diâmetro e, em seguida, permita que as células adiram e cresçam até ~ 70% de confluência antes da transfecção.
2. Repita o procedimento de transfecção conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.7 e modifique apenas as quantidades de plasmídeo da seguinte forma: plasmídeo N: 1,3 μg, plasmídeo Luc-T20: 2 μg, plasmídeo S: 0,0032 μg e plasmídeo M-IRES-E: 0,66 μg.
3. Lave suavemente a placa de cultura duas vezes com 1 mL de PBS gelado e, em seguida, adicione 1 mL de solução de fixação de paraformaldeído a 4% (PFA) à temperatura ambiente (RT) por 15 min.
4. Lave as células por 2 x 5 min com 1 mL de PBS em RT e, em seguida, permeabilize as células adicionando 1 mL de Triton X-100 a 0,25% em RT por 10 min.
5. Lave as células por 2 x 5 min com 1 mL de PBS em RT e, em seguida, adicione 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 5% em RT por 1 h para bloquear interações inespecíficas de anticorpos.
6. Adicione ~ 200 μL de solução de anticorpo primário (o suficiente para cobrir o fundo do vidro) e incube a 4 ° C durante a noite.
   NOTA: As soluções de anticorpos primários são preparadas diluindo em 5% de BSA dissolvido em PBS nas seguintes proporções de diluição: o anticorpo anti-S de camundongo a 1:200, o anticorpo anti-Sec61β de coelho a 1:200, o anticorpo anti-GM130 de coelho a 1:200 e o anticorpo anti-ERGIC53 de coelho a 1:200. A solução de BSA/PBS a 5% serviu como diluente e tampão de bloqueio para minimizar a ligação inespecífica durante os procedimentos subsequentes de coloração por imunofluorescência.
7. Remova a solução primária de anticorpos e lave as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
8. Adicione a solução de anticorpo secundário conjugado com fluorescência em RT por 1 h e, em seguida, lave as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
   NOTA Todas as etapas subsequentes devem ser executadas no escuro ou sob exposição mínima à luz para evitar o fotobranqueamento de conjugados fluorescentes e preservar a integridade do sinal. Dois tipos de anticorpos secundários conjugados com fluorescência, derivados de camundongos ou coelhos, são empregados para corar a proteína S ou as proteínas marcadoras de organelas celulares.
9. Corar os núcleos com solução de Hoechst 2,5 μg/mL em RT por 5 min e, em seguida, lavar as células por 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
10. Observe a coloração da proteína S ou organela e adquira imagens usando um microscópio confocal com os seguintes parâmetros: Modo PMT definido para VBF (sem média, varredura sequencial de linha) com abertura autoconfocal. Para o canal 1 (FITC), use o laser de 488 nm a 25% de potência com emissão de 500 a 548 nm, HV 525 V, ganho de 1x e deslocamento de 5%. Para o canal 2 (Alexa Fluor 594), use o laser de 594 nm a 25% de potência com emissão de 610 a 670 nm, HV 500 V, ganho de 1x e deslocamento de 5%. Para o canal 3 (DAPI), use o laser de 405 nm a 25% de potência com emissão de 430 a 470 nm, HV 490 V, ganho 1x e deslocamento de 5%.

As etapas de saída e montagem do ciclo de vida do SARS-CoV-2 foram menos estudadas do que as etapas de infecção e replicação^17,18. Antes do desenvolvimento do método SC2-VLP, esses processos só podiam ser investigados usando SARS-CoV-2 vivo, confinando a pesquisa aos laboratórios BSL-3¹³. O fluxo de trabalho SC2-VLP, mostrado na Figura 1, descreve o protocolo experimental e ilustra os processos envolvidos nessas etapas do ciclo de vida do SARS-CoV-2. Nessa abordagem, os plasmídeos que codificam as proteínas estruturais do SARS-CoV-2 (M, E, S e N) e o sinal de empacotamento de RNA (T20) são cotransfectados em células HEK-293T. Um repórter de luciferase fundido ao sinal T20 permite a detecção sensível das SC2-VLPs liberadas, que podem infectar células receptoras que expressam os receptores SARS-CoV-2 ACE2 e TMPRSS2, conforme ilustrado na Figura 1.

Para otimizar a quantidade de plasmídeo que codifica as proteínas estruturais do SARS-CoV-2 e o sinal de empacotamento, particularmente o plasmídeo S, transfectamos células HEK-293T com concentrações variadas do plasmídeo S. Os resultados revelaram que uma proporção de plasmídeo S para outro plasmídeo de 1:10 fornece as condições ideais para a produção de SC2-VLP (Figura 2). Este achado se alinha com um relatório anterior de Syed et al. e explica razoavelmente por que, apesar de ser um dos componentes mais abundantes nos vírions SARS-CoV-2, o nível de expressão da proteína S é relativamente menor em comparação com as proteínas M, N e E.

O sistema SC2-VLP serve como um modelo poderoso para estudar o processo de montagem do SARS-CoV-2, recapitulando fielmente a formação do envelope viral e o empacotamento do genoma. As evidências atuais destacam o papel central da proteína M na montagem, facilitando o recrutamento de outras proteínas estruturais, incluindo N, S e E. A imunocoloração dessas proteínas revela sua localização dentro de organelas subcelulares, provavelmente o complexo ERGIC ou cis-Golgi, os locais primários de montagem do SARS-CoV-2^19,20. Isso ressalta o potencial do sistema SC2-VLP como uma ferramenta valiosa para dissecar mecanismos de montagem viral. Para investigar ainda mais o papel de S na montagem, introduzimos a mutação H1271E, que interrompe a classificação S mediada por COPI, prejudicando assim a incorporação de S em vírions^21,22. Nas células receptoras, essa mutação reduziu significativamente a atividade da luciferase, confirmando que o sistema SC2-VLP não apenas recapitula fielmente a infecção viral, mas também serve como uma ferramenta poderosa para investigar a montagem do SARS-CoV-2 - um processo inacessível aos sistemas convencionais de pseudotipagem lentiviral (Figura 3). Além disso, empregamos uma abordagem abrangente de varredura mutacional, visando resíduos individuais (1.255-1.273) na cauda S C-terminal para identificar mutações adicionais que, como H1271E, podem atenuar a montagem do vírion e reduzir os títulos virais. A Figura 3 demonstra que a mutação E1262H diminui significativamente a produção de SC2-VLP, enquanto o duplo mutante H1271E / E1262H a abole completamente. Esses resultados implicam E1262 em interações potenciais com fatores hospedeiros não identificados. Uma caracterização mais aprofundada das proteínas do hospedeiro que se ligam a esta região, particularmente aquelas dependentes de E1261, pode revelar novos mecanismos que regem a montagem do SARS-CoV-2. Coletivamente, esses achados estabelecem SC2-VLPs como uma plataforma versátil e fisiologicamente relevante para estudar a montagem viral em sistemas de cultura de células.

Para avaliar a localização subcelular da proteína S em células produtoras de SC2-VLP, realizamos análise de imunocoloração da proteína S do tipo selvagem e de seu mutante H1271E. Os resultados demonstram que a proteína S colocaliza predominantemente com o marcador cis-Golgi GM130, enquanto mostra sobreposição mínima com o marcador ER Sec61β ou o marcador ERGIC ERGIC-53. Esses achados se alinham com observações anteriores de localização subcelular S na infecção autêntica por SARS-CoV-2²³. Em contraste, o mutante H1271E exibiu um padrão de distribuição difusa e não mostrou colocalização com o marcador cis-Golgi GM130. Isso sugere que a mutação interrompe a localização adequada no local de montagem viral, potencialmente explicando sua capacidade prejudicada de facilitar a montagem do vírion SARS-CoV-2 (Figura 4). Esses resultados estabelecem ainda mais as SC2-VLPs como uma ferramenta valiosa para estudar as funções biológicas de S e outras proteínas estruturais virais.

Figura 1: Representação esquemática da produção de SC2-VLP e suas aplicações. O sinal de empacotamento de RNA genômico SARS-CoV-2, T20, é destacado em ciano, enquanto a proteína S é mostrada em verde escuro. Os plasmídeos codificam proteínas estruturais do SARS-CoV-2, incluindo M, E, N e S, com M e E co-expressos a partir de um único vetor. Os principais estágios do ciclo de vida viral são ilustrados, incluindo montagem (verde claro), saída (azul claro) e infecção (laranja), conforme indicado pelas setas. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2; SC2-VLP = partícula semelhante ao vírus SARS-CoV-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sensibilidade do título de SC2-VLP à quantidade transfectada do plasmídeo que codifica S. (A) Tabela mostrando as quantidades de transfecção de plasmídeos que codificam proteínas estruturais SARS-CoV-2 e o sinal de empacotamento de gRNA. (B) O título de SC2-VLP varia em resposta à quantidade transfectada do plasmídeo que codifica S. Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2; SC2-VLP = partícula semelhante ao vírus SARS-CoV-2; gRNA= RNA guia; RLU = unidades de luminescência relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Sistema SC2-VLP usado para investigar a montagem de S em vírions. (A) Os mutantes S que afetam o tráfego de COPI levam a uma redução no título de SC2-VLP. (B) Análise de Western blot da abundância de proteínas SARS-CoV-2 S e N em SC2-VLPs. (C) Eficiência de empacotamento S calculada a partir de (B), com abundância de SC2-VLP normalizada para níveis de proteína N. (D) Quantificação da abundância de SC2-VLP de (B). Abreviaturas: SARS-CoV-2 = síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2; SC2-VLP = partícula semelhante ao vírus SARS-CoV-2; RLU = unidades de luminescência relativa; Ctr = controle; WT = tipo selvagem; mut = mutante; NS = não significativo. A banda correspondente à proteína spike (S) SARS-CoV-2 de comprimento total é rotulada como S, enquanto o fragmento S2 (resíduos 816-1.273) representa a porção C-terminal da proteína S, e uma banda não específica entre S e S2 é indicada como NS²⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Sistema SC2-VLP usado para investigar a localização subcelular S. (A-I) Imagem representativa de imunocoloração de WT S em células HEK-293T produtoras de SC2-VLP com co-coloração de marcadores de organelas celulares. (AC) Marcador ER: (D-F) Sec61β, (G-I) Marcador ERGIC: ERGIC-53; o marcador do complexo cis-Golgi: GM130. (JL) A colocalização do mutante S E1262H com o marcador cis-Golgi GM130. S é mostrado em verde, os marcadores de organelas celulares são exibidos em vermelho e o núcleo da célula é corado em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Sequências de DNA de plasmídeos N, Luc-T20, plasmídeo S e plasmídeos M-IRES-E. Clique aqui para baixar este arquivo.

Um método simples e eficaz para modelar o ciclo de vida do SARS-CoV-2 em sistemas de cultura de células, sem as restrições dos laboratórios BSL-3, representa um avanço fundamental para a pesquisa anti-SARS-CoV-2. O método SC2-VLP atende a essa necessidade, oferecendo uma plataforma robusta e acessível. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado para o método SC2-VLP, descrevendo etapas experimentais críticas para a produção de SC2-VLPs. Além disso, destacamos sua versatilidade e aplicações potenciais no avanço de nossa compreensão da biologia do SARS-CoV-2 e na facilitação do desenvolvimento de estratégias antivirais.

Os métodos tradicionais de VLP e pseudotipagem lentiviral do SARS-CoV-2 são amplamente utilizados na pesquisa anti-SARS-CoV-2 ^8,25. No método VLP tradicional, as proteínas estruturais M, N, E e S do SARS-CoV-2 são co-expressas para gerar partículas virais²⁶, com sua abundância normalmente monitorada por análise WB. No entanto, as proteínas estruturais virais também são incorporadas a outras estruturas de membrana, como exossomos, complicando a análise WB de partículas virais²⁷. Por outro lado, o método SC2-VLP incorpora um gene repórter fundido ao sinal T20, permitindo o empacotamento eficiente do repórter em partículas virais. Isso permite a detecção sensível e específica da abundância de partículas sem depender apenas da análise WB. Além disso, o método SC2-VLP imita mais fielmente o ciclo de vida completo do SARS-CoV-2 vivo em comparação com o método VLP tradicional.

O método SC2-VLP supera a abordagem de pseudotipagem lentiviral em vários aspectos críticos. O sistema de pseudotipagem lentiviral depende da estrutura do vírus HIV-1, na qual os vírions são montados e brotados da membrana plasmática. Em contraste, os vírions SARS-CoV-2 são montados dentro do complexo ERGIC ou cis-Golgi, destacando uma diferença fundamental em seus ciclos de vida. Essa discrepância torna o método de pseudotipagem lentiviral inadequado para estudar os principais estágios do ciclo de vida do SARS-CoV-2, como replicação, montagem e saída, limitando sua aplicabilidade à investigação de entrada e infecção viral.

O método SC2-VLP é uma ferramenta simples e poderosa para estudar o ciclo de vida do SARS-CoV-2. Por não envolver o vírus autêntico, esse método pode ser adotado por muitos laboratórios sem exigir acesso às instalações do BSL-3. No entanto, continua sendo crucial validar os achados derivados do sistema SC2-VLP usando SARS-CoV-2 vivo para garantir sua precisão e relevância biológica.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo programa de fundos Startup da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM) (90011451310011). Estendemos nossa gratidão a todos os membros do laboratório do Dr. Ma no BUCM pela inestimável discussão e assistência com os experimentos.