Herstellung eines SARS-CoV-2 Virus ähnlichen Partikelsystems zur Untersuchung viraler Lebenszyklen in vitro

Wir stellen ein optimiertes In-vitro-Protokoll zur Herstellung von SARS-CoV-2-Virus-ähnlichen Partikeln vor, die das authentische Virus genau nachahmen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Virusinfektions-, Assemblierungs- und Austrittsmechanismen, ohne dass ein Labor der Biosicherheitsstufe 3 erforderlich ist.

Die Methode des schweren akuten respiratorischen Syndroms-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virusähnliche Partikel (SC2-VLP) bietet ein leistungsstarkes und zugängliches Werkzeug für die Untersuchung des Lebenszyklus von SARS-CoV-2, ohne dass Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) erforderlich sind. Dieses System ahmt kritische Phasen des viralen Lebenszyklus, einschließlich Assemblierung, Genomverpackung und Ausgang, effektiv nach, indem es einen Luciferase-Reporter verwendet, der mit dem T20-Signal fusioniert ist, um die Produktion von Viruspartikeln empfindlich und präzise zu detektieren. SC2-VLPs werden durch die Co-Expression von SARS-CoV-2-Strukturproteinen, einschließlich Membran (M), Nukleokapsid (N), Hülle (E) und Spike (S), zusammen mit dem RNA-Verpackungssignal in HEK-293T-Zellen erzeugt. Im Gegensatz zu herkömmlichen virusähnlichen Partikelsystemen gewährleistet die SC2-VLP-Methode eine genaue Quantifizierung und eine größere Genauigkeit des natürlichen Lebenszyklus des Virus. Darüber hinaus bietet das SC2-VLP-System im Vergleich zu lentiviralen Pseudotypisierungsmethoden, die sich auf die Untersuchung des Viruseintritts durch den Einbau des S-Proteins in HIV-basierte lentivirale Partikel beschränken, eine umfassendere Plattform für die Erforschung mehrerer Stadien der SARS-CoV-2-Biologie. Mit dieser Methode werden die Risiken des Umgangs mit lebenden Viren umgangen und die Zugänglichkeit erweitert. Die SC2-VLP-Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt in der antiviralen Forschung und der Entwicklung von Therapiestrategien gegen SARS-CoV-2 dar.

Die COVID-19-Pandemie hat sich zu einer der verheerendsten globalen Gesundheitskrisen der modernen Geschichte entwickelt, die weltweit Millionen von Todesfällen gefordert^{hat 1}. Das verantwortliche Virus, SARS-CoV-2, durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der Schlüsselstadien wie Infektion, Genomreplikation, Assemblierung und Austritt umfasst. Der Infektionsprozess beginnt, wenn das virale Spike-Protein (S) an den Wirtszellrezeptor Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) bindet und so die Freisetzung des viralen Genoms in die Wirtszelle^{erleichtert 2,3}. Die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) katalysiert dann die Replikation der genomischen RNA. Diese RNA bildet im Komplex mit dem Nukleokapsidprotein (N) eine stabile Struktur, die vom Membranprotein (M) erkannt wird. Das M-Protein spielt eine zentrale Rolle bei der viralen Assemblierung, indem es den RNA-N-Komplex S und das Hüllprotein (E)^4,5 rekrutiert. Nach dem Assemblieren schließt das Virion seinen Austritt über einen nicht-kanonischen Lysosomen-vermittelten Transportweg^{ab 6}.

Als Reaktion auf die Pandemie wurden erhebliche globale Ressourcen mobilisiert, um Impfstoffe, neutralisierende Antikörper und antivirale Medikamente zu entwickeln. Die Evaluierung dieser Interventionen war für die Weiterentwicklung der SARS-CoV-2-Forschung von entscheidender Bedeutung⁷. Die Untersuchung des lebenden Virus stellt jedoch erhebliche logistische Herausforderungen dar, da Experimente mit dem Virus in Labors der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) durchgeführt werden müssen. Die begrenzte Verfügbarkeit von BSL-3-Einrichtungen hat das Tempo der Forschung zum Verständnis und zur Bekämpfung von SARS-CoV-2 eingeschränkt.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurden zwei wichtige Systeme – virusähnliche Partikel (VLP) und lentivirale Pseudotypisierung – in der SARS-CoV-2-Forschung weitgehend eingesetzt, die beide kein BSL-3-Containment⁸ erfordern. Das VLP-System beinhaltet die Co-Transfektion von Zellen mit Genen, die für virale Strukturproteine wie M, S, E und N kodieren, die zusammen virusähnliche Partikel erzeugen. Diese Partikel ahmen die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Virus nach und sind damit ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung wichtiger Prozesse im SARS-CoV-2-Lebenszyklus und sogar ein wirksames Antigen für die Impfstoffentwicklung ^9,10,11.

Umgekehrt beinhaltet das lentivirale Pseudotypisierungssystem den Ersatz des G-Proteins des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) im Lentivirus durch das SARS-CoV-2 S-Protein, wodurch die Produktion von lentiviralen Partikeln ermöglicht wird, die Reportergene wie Luciferase oder GFP einbauen können. Dieses System ist besonders nützlich für die Untersuchung neutralisierender Antikörper, die die S-ACE2-Interaktion blockieren¹². Die lentivirale Pseudotypisierung spiegelt jedoch nicht die Assemblierung oder den Ausgang von SARS-CoV-2-Viren wider, da HIV-Strukturproteine verwendet werden, die die Partikelfreisetzung an der Plasmamembran vermitteln.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Syed et al. kürzlich das SARS-CoV-2-Verpackungssignal in seinem RNA-Genom identifiziert, was die Spezifität des N-Proteins für die virale Genomerkennung demonstriert¹³. Durch die Fusion dieses Verpackungssignals mit Reportergenen ist es möglich, diese Gene effizient in SARS-CoV-2-Virus-ähnliche Partikel (SC2-VLPs) ^einzubauen13. Diese Strategie repliziert nicht nur die SARS-CoV-2-Assemblierungs- und -Austrittsprozesse, sondern ermöglicht auch die empfindliche Messung von Infektionsschritten. In dieser Studie stellen wir die experimentelle Methodik für die Verwendung des SC2-VLP-Systems vor und beleuchten wichtige Überlegungen zur Durchführung dieses Ansatzes.

1. Erzeugung von SC2-VLPs

1. Aussaat von ~3,0 × 10⁶ HEK-293T-Zellen in einer Gewebekulturplatte mit 10 cm Durchmesser mit DMEM-Komplettmedium, ergänzt mit 10 % v/v FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
   HINWEIS: Um eine hohe Transfektionseffizienz und eine optimale SC2-VLP-Produktion zu gewährleisten, sollten HEK-293T-Zellen bei niedrigen Passagezahlen von ~10 gehalten werden.
2. Kultivieren Sie die HEK-293T-Zelle bei 37 °C, 5 % CO₂ für ca. 24 h und überprüfen Sie die Zellkonfluenz unter dem Mikroskop. Fortfahren, wenn ~70% zusammenfließen.
3. Verdünnen Sie 60 μl PEI von 1 mg/ml Stammmaterial auf 200 μl mit serumfreiem Medium.
4. Geben Sie 6,7 μg N-Plasmid, 10 μg Luc-T20-Plasmid, 0,016 μg S-Plasmid und 3,3 μg M-IRES-E-Plasmid in 200 μl serumfreies Medium (siehe Zusatzdatei 1).
5. Das verdünnte PEI aus Schritt 1.3 wird vorsichtig in die Lösung gegeben, die Plasmide enthält, die für virale Strukturproteine aus Schritt 1.4 kodieren, und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dies ist die Transfektionslösung.
6. Lassen Sie die Transfektionslösung aus Schritt 1.5 vorsichtig auf die HEK-293T-Zellen fallen und schwenken Sie die Gewebekulturplatte vorsichtig, um sie gründlich zu mischen.
7. Tauschen Sie das Zellkulturmedium 6 h nach der Infektion gegen das DMEM-Komplettmedium aus und inkubieren Sie die transfizierten HEK-293T-Zellen 48 h lang bei 37 °C, 5 % CO₂ .
8. Sammeln Sie den Überstand der infizierten HEK-293T-Zellen, der die SC2-VLPs enthält, und filtrieren Sie den Überstand dann durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Zelltrümmer zu entfernen. Dies ist das SC2-VLP-Medium.
   HINWEIS: Wir haben versucht, SC2-VLPs in HeLa-, Vero E6- und Caco2-Zelllinien herzustellen, aber es wurde kein messbarer Virustiter erhalten, was auf die Spezifität des Protokolls für HEK-293T-Zellen hinweist.

2. Prüfung der Wirksamkeit von SC2-VLP

HINWEIS: Die HEK-293T-Zelllinie, die ACE2 und TMPRSS2 stabil exprimiert, wurde unter Verwendung eines lentiviralen Transduktionsansatzes etabliert^14,15. Die Proteinexpression sowohl von ACE2 als auch von TMPRSS2 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt, die einem Protokoll folgte, das dem in Schritt 3 beschriebenen (SC2-VLP-Zusammensetzungsanalyse) ähnelte.

1. Keimen Sie 4.0 × 10⁴ HEK-293T-Zellen mit stabiler Expression von ACE2 und TMPRSS2 in einer 96-Well-Platte und fügen Sie 50 μl SC2-VLP-Medium aus Schritt 1.8 hinzu.
2. Die 96-Well-Gewebekulturplatte wird bei 37 °C mit 5 % CO₂ 24 h inkubiert.
3. Nehmen Sie das Medium von der 96-Well-Platte und waschen Sie es einmal mit 100 μl PBS-Puffer bei 37 °C, der 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,8 mM KH₂PO₄ enthält.
4. Lysieren Sie die HEK-293T ACE2/TMPRSS2-Zellen mit 20 μl passivem Lysepuffer und wiegen Sie die Probe 15 Minuten lang sanft auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Der Lysepuffer enthält 25 mM Tris-Phosphat (pH 7,8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 1,25 mg/ml Lysozym, 2,5 mg/ml BSA, 10 % Glycerin und 1 % Triton X-100).
5. Schleudern Sie die 96-Well-Platte bei 4.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C in einer gekühlten Mikrotiterplatten-Zentrifuge und geben Sie die Platte dann sofort in ein Eisbad.
6. Nehmen Sie 100 μl rekonstituierten Luciferase-Assay-Puffer auf eine undurchsichtige weiße 96-Well-Platte und fügen Sie 20 μl Lysat aus Schritt 2.5 hinzu. Mischen Sie sie kurz, indem Sie sie 2-3x auf und ab pipettieren.
7. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät mit den folgenden Parametern: Detektionsmodus: Lumineszenz; Wellenlängenbereich: Vollspektrum; Plattenformat: 96-Well-Standard-Undurchsichtige Platte; Integrationszeit: 200 ms.

3. Untersuchung der Zusammensetzung des SC2-VLP

1. 1,36 ml PEG 8000-Lösung, die 50 % PEG 8000 und 2,2 % NaCl enthält, werden zu 10 ml SC2-VLP-Medium aus Schritt 1.8 gegeben.
2. Bewahren Sie die Mischung auf einem Orbitalschüttler auf und mischen Sie die Lösung langsam über Nacht bei 4 °C.
3. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 4 °C und 2.000 × g zentrifugiert und das SC2-VLP-Pellet für die Western-Blotting-Analyse^{aufgefangen 16}.
   HINWEIS: Für die Western-Blotting-Analyse sind alle Informationen zu den Antikörpern in der Materialtabelle aufgeführt.

4. Subzelluläre Lokalisationsanalyse von S und seinen Mutanten in SC2-VLP-produzierenden Zellen

1. ~3,0 × 10⁶ HEK-293T-Zellen gleichmäßig in der Kulturschale mit Glasboden und 15 mm Durchmesser säen und dann die Zellen anhaften und wachsen lassen, bis ~70% Konfluenz erreicht sind, bevor sie transfektioniert werden.
2. Wiederholen Sie das Transfektionsverfahren wie in den Schritten 1.3 bis 1.7 beschrieben, und ändern Sie nur die Plasmidmengen wie folgt: N-Plasmid: 1,3 μg, Luc-T20-Plasmid: 2 μg, S-Plasmid: 0,0032 μg und M-IRES-E-Plasmid: 0,66 μg.
3. Waschen Sie die Kulturschale zweimal vorsichtig mit 1 ml eiskaltem PBS und fügen Sie dann 1 ml 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Fixierlösung bei Raumtemperatur (RT) für 15 Minuten hinzu.
4. Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT und permeabilisieren Sie die Zellen dann, indem Sie 1 ml 0,25% Triton X-100 bei RT für 10 Minuten hinzufügen.
5. Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT und fügen Sie dann 1 ml 5% Rinderserumalbumin (BSA) bei RT für 1 h hinzu, um unspezifische Antikörperwechselwirkungen zu blockieren.
6. ~200 μl Primärantikörperlösung (genug, um den Glasboden zu bedecken) hinzufügen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Primärantikörperlösungen werden durch Verdünnung in 5 % BSA, gelöst in PBS, bei den folgenden Verdünnungsverhältnissen hergestellt: der Maus-Anti-S-Antikörper bei 1:200, der Kaninchen-Anti-Sec61β-Antikörper bei 1:200, der Kaninchen-Anti-GM130-Antikörper bei 1:200 und der Kaninchen-Anti-ERGIC53-Antikörper bei 1:200. Die 5%ige BSA/PBS-Lösung diente sowohl als Verdünnungsmittel als auch als Blockierungspuffer, um unspezifische Bindungen bei nachfolgenden Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zu minimieren.
7. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT.
8. Geben Sie fluoreszenzkonjugierte Sekundärantikörperlösung bei RT für 1 h hinzu und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 Minuten lang mit 1 ml PBS bei RT.
   HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen im Dunkeln oder bei minimaler Lichteinwirkung durchgeführt werden, um ein Photobleichen von fluoreszierenden Konjugaten zu verhindern und die Signalintegrität zu erhalten. Zwei Arten von fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern, die von Maus oder Kaninchen stammen, werden verwendet, um entweder das S-Protein oder Zellorganellen-Markerproteine zu färben.
9. Färben Sie die Zellkerne 5 min lang mit 2,5 μg/mL Hoechst-Lösung bei RT und waschen Sie die Zellen dann 3 x 5 min lang mit 1 mL PBS bei RT.
10. Beobachten Sie die Färbung von S-Proteinen oder Organellen und nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit den folgenden Parametern auf: PMT-Modus eingestellt auf VBF (keine Mittelwertbildung, zeilensequenzieller Scan) mit autokonfokaler Blende. Verwenden Sie für Kanal 1 (FITC) den 488-nm-Laser mit 25 % Leistung und 500 - 548 nm Emission, HV 525 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %. Verwenden Sie für Kanal 2 (Alexa Fluor 594) den 594-nm-Laser mit 25 % Leistung und 610 - 670 nm Emission, HV 500 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %. Verwenden Sie für Kanal 3 (DAPI) den 405-nm-Laser mit 25 % Leistung und 430 - 470 nm Emission, HV 490 V, Verstärkung 1x und Offset 5 %.

Die Austritts- und Assemblierungsschritte des SARS-CoV-2-Lebenszyklus sind weniger untersucht als die Infektions- und Replikationsschritte^17,18. Bevor die SC2-VLP-Methode entwickelt wurde, konnten diese Prozesse nur mit lebendem SARS-CoV-2 untersucht werden, so dass die Forschung auf BSL-3-Laboratorien beschränkt war¹³. Der in Abbildung 1 gezeigte SC2-VLP-Workflow skizziert das experimentelle Protokoll und veranschaulicht die Prozesse, die an diesen Schritten des SARS-CoV-2-Lebenszyklus beteiligt sind. Bei diesem Ansatz werden Plasmide, die für die Strukturproteine von SARS-CoV-2 (M, E, S und N) und das RNA-Verpackungssignal (T20) ko-transfiziert sind, in HEK-293T-Zellen ko-transfiziert. Ein Luciferase-Reporter, der mit dem T20-Signal fusioniert ist, ermöglicht den sensitiven Nachweis der freigesetzten SC2-VLPs, die dann Empfängerzellen infizieren können, die die SARS-CoV-2-Rezeptoren ACE2 und TMPRSS2 exprimieren, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Um die Menge an Plasmiden, die für SARS-CoV-2-Strukturproteine kodieren, und das Verpackungssignal, insbesondere das S-Plasmid, zu optimieren, transfizierten wir HEK-293T-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des S-Plasmids. Die Ergebnisse zeigten, dass ein S-Plasmid-zu-andere-Plasmid-Verhältnis von 1:10 die optimalen Bedingungen für die SC2-VLP-Produktion bietet (Abbildung 2). Dieser Befund stimmt mit einem früheren Bericht von Syed et al. überein und erklärt vernünftig, warum das Expressionsniveau des S-Proteins im Vergleich zu den M-, N- und E-Proteinen relativ niedriger ist, obwohl es eine der am häufigsten vorkommenden Komponenten in SARS-CoV-2-Virionen ist.

Das SC2-VLP-System dient als leistungsfähiges Modell für die Untersuchung des SARS-CoV-2-Assemblierungsprozesses, indem es sowohl die Bildung der Virushülle als auch die Genomverpackung originalgetreu rekapituliert. Aktuelle Erkenntnisse unterstreichen die zentrale Rolle des M-Proteins bei der Assemblierung, das die Rekrutierung anderer Strukturproteine, einschließlich N, S und E, erleichtert. Die Immunfärbung dieser Proteine zeigt ihre Lokalisation in subzellulären Organellen, wahrscheinlich dem ERGIC- oder cis-Golgi-Komplex, den primären Stellen der SARS-CoV-2-Assemblierung^19,20. Dies unterstreicht das Potenzial des SC2-VLP-Systems als wertvolles Werkzeug zur Entschlüsselung viraler Assemblierungsmechanismen. Um die Rolle von S bei der Assemblierung weiter zu untersuchen, führten wir die H1271E-Mutation ein, die die COPI-vermittelte S-Sortierung stört und dadurch den S-Einbau in die Virionen^21,22 beeinträchtigt. In den Empfängerzellen reduzierte diese Mutation die Luciferase-Aktivität signifikant, was bestätigt, dass das SC2-VLP-System nicht nur die Virusinfektion originalgetreu rekapituliert, sondern auch als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der SARS-CoV-2-Assemblierung dient – ein Prozess, der für herkömmliche lentivirale Pseudotypisierungssysteme unzugänglich ist (Abbildung 3). Darüber hinaus verwendeten wir einen umfassenden Mutationsscan-Ansatz, der auf einzelne Reste (1.255-1.273) im S C-terminalen Schwanz abzielte, um zusätzliche Mutationen zu identifizieren, die wie H1271E die Virionenassemblierung abschwächen und die viralen Titer reduzieren könnten. Abbildung 3 zeigt, dass die E1262H-Mutation die SC2-VLP-Produktion signifikant verringert, während die H1271E/E1262H-Doppelmutante sie vollständig aufhebt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass E1262 in potenziellen Wechselwirkungen mit nicht identifizierten Wirtsfaktoren steht. Eine weitere Charakterisierung von Wirtsproteinen, die an diese Region binden, insbesondere derjenigen, die von E1261 abhängig sind, könnte neue Mechanismen aufdecken, die die SARS-CoV-2-Assemblierung steuern. Zusammengenommen etablieren diese Ergebnisse SC2-VLPs als vielseitige und physiologisch relevante Plattform für die Untersuchung der Virusassemblierung in Zellkultursystemen.

Um die subzelluläre Lokalisation des S-Proteins in SC2-VLP-produzierenden Zellen zu beurteilen, führten wir Immunfärbeanalysen sowohl des Wildtyp-S-Proteins als auch seiner H1271E-Mutante durch. Die Ergebnisse zeigen, dass das S-Protein überwiegend mit dem cis-Golgi-Marker GM130 kolokalisiert, während es eine minimale Überlappung mit dem ER-Marker Sec61β oder dem ERGIC-Marker ERGIC-53 aufweist. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen der subzellulären Lokalisation von S bei authentischen SARS-CoV-2-Infektionen überein²³. Im Gegensatz dazu zeigte die H1271E-Mutante ein diffuses Verteilungsmuster und zeigte keine Kolokalisation mit dem cis-Golgi-Marker GM130. Dies deutet darauf hin, dass die Mutation die korrekte Lokalisation an der Virussammelstelle stört, was möglicherweise ihre beeinträchtigte Fähigkeit erklärt, die SARS-CoV-2-Virionenassemblierung zu erleichtern (Abbildung 4). Diese Ergebnisse etablieren SC2-VLPs als wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der biologischen Funktionen von S und anderen viralen Strukturproteinen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der SC2-VLP-Produktion und ihrer Anwendungen. Das genomische RNA-Verpackungssignal von SARS-CoV-2, T20, ist in Cyan hervorgehoben, während das S-Protein in dunkelgrün dargestellt ist. Plasmide kodieren für Strukturproteine von SARS-CoV-2, einschließlich M, E, N und S, wobei M und E aus einem einzigen Vektor koexprimiert werden. Die wichtigsten Stadien des viralen Lebenszyklus sind dargestellt, einschließlich des Assemblierens (hellgrün), des Austritts (hellblau) und der Infektion (orange), wie durch Pfeile angezeigt. Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom-Coronavirus 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-Virus-ähnliches Teilchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Sensitivität des SC2-VLP-Titers gegenüber der transfizierten Menge des Plasmids, das für S kodiert. (A) Tabelle mit den Transfektionsmengen von Plasmiden, die für SARS-CoV-2-Strukturproteine kodieren, und dem gRNA-Verpackungssignal. (B) Der SC2-VLP-Titer variiert als Reaktion auf die transfizierte Menge des Plasmids, das für S kodiert. Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom-Coronavirus 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-Virus-ähnliches Teilchen; gRNA= Leit-RNA; RLU = relative Lumineszenzeinheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: SC2-VLP-System zur Untersuchung der S-Assemblierung in Virionen. (A) S-Mutanten, die den COPI-Transport beeinflussen, führen zu einer Verringerung des SC2-VLP-Titers. (B) Western-Blot-Analyse der SARS-CoV-2 S- und N-Proteinhäufigkeit in SC2-VLPs. (C) S-Verpackungseffizienz, berechnet aus (B), wobei die SC2-VLP-Häufigkeit auf die N-Proteinspiegel normiert wurde. (D) Quantifizierung der SC2-VLP-Häufigkeit aus (B). Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom-Coronavirus 2; SC2-VLP = SARS-CoV-2-Virus-ähnliches Teilchen; RLU = relative Lumineszenzeinheiten; Ctr = Kontrolle; WT = Wildtyp; mut = Mutante; NS = nicht signifikant. Die Bande, die dem SARS-CoV-2-Spike-Protein (S) in voller Länge entspricht, ist als S gekennzeichnet, während das S2-Fragment (Reste 816-1.273) den C-terminalen Teil des S-Proteins darstellt und eine unspezifische Bande zwischen S und S2 als NS²⁴ angegeben ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: SC2-VLP-System zur Untersuchung der subzellulären Lokalisation von S. (A-I) Repräsentatives Immunfärbebild von WT S in SC2-VLP-produzierenden HEK-293T-Zellen mit Co-Färbung von Zellorganellenmarkern. (A-C) ER-Marker: (D-F) Sec61β, (G-I) ERGIC-Marker: ERGIC-53; der cis-Golgi-Komplex-Marker: GM130. (J-L) Die Kolokalisation der S E1262H-Mutante mit dem cis-Golgi-Marker GM130. S ist grün dargestellt, die Marker der Zellorganellen sind rot dargestellt und der Zellkern ist blau angefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: DNA-Sequenzen von N-, Luc-T20-Plasmid-, S-Plasmid- und M-IRES-E-Plasmiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Eine einfache und effektive Methode zur Modellierung des SARS-CoV-2-Lebenszyklus in Zellkultursystemen ohne die Einschränkungen der BSL-3-Laboratorien stellt einen entscheidenden Fortschritt für die Anti-SARS-CoV-2-Forschung dar. Die SC2-VLP-Methode erfüllt diese Anforderung und bietet eine robuste und zugängliche Plattform. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die SC2-VLP-Methode vor, das kritische experimentelle Schritte zur Herstellung von SC2-VLPs skizziert. Darüber hinaus heben wir ihre Vielseitigkeit und ihre potenziellen Anwendungen hervor, um unser Verständnis der SARS-CoV-2-Biologie zu verbessern und die Entwicklung antiviraler Strategien zu erleichtern.

Traditionelle SARS-CoV-2-VLP- und lentivirale Pseudotypisierungsmethoden sind in der Anti-SARS-CoV-2-Forschung weit verbreitet ^8,25. Bei der traditionellen VLP-Methode werden die SARS-CoV-2-Strukturproteine M, N, E und S koexprimiert, um Viruspartikel^{zu erzeugen 26}, wobei ihre Häufigkeit typischerweise durch WB-Analyse überwacht wird. Virale Strukturproteine werden jedoch auch in andere Membranstrukturen, wie z. B. Exosomen, eingebaut, was die WB-Analyse von Viruspartikeln erschwert²⁷. Im Gegensatz dazu enthält die SC2-VLP-Methode ein Reportergen, das mit dem T20-Signal fusioniert ist, was eine effiziente Verpackung des Reporters in virale Partikel ermöglicht. Dies ermöglicht eine empfindliche und spezifische Detektion der Partikelhäufigkeit, ohne sich ausschließlich auf die WB-Analyse verlassen zu müssen. Darüber hinaus ahmt die SC2-VLP-Methode im Vergleich zur herkömmlichen VLP-Methode den gesamten Lebenszyklus von lebendem SARS-CoV-2 originalgetreuer nach.

Die SC2-VLP-Methode übertrifft den lentiviralen Pseudotypisierungsansatz in mehreren kritischen Aspekten. Das lentivirale Pseudotypisierungssystem stützt sich auf das HIV-1-Virusgerüst, bei dem Virionen zusammengesetzt und aus der Plasmamembran geknospt werden. Im Gegensatz dazu werden SARS-CoV-2-Virionen innerhalb des ERGIC- oder cis-Golgi-Komplexes assembliert, was einen grundlegenden Unterschied in ihren Lebenszyklen verdeutlicht. Diese Diskrepanz macht die lentivirale Pseudotypisierungsmethode ungeeignet für die Untersuchung wichtiger Stadien des SARS-CoV-2-Lebenszyklus, wie z. B. Replikation, Assemblierung und Austritt, und schränkt ihre Anwendbarkeit auf die Untersuchung des Viruseintritts und der Virusinfektion ein.

Die SC2-VLP-Methode ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung des SARS-CoV-2-Lebenszyklus. Da das authentische Virus nicht verwendet wird, kann diese Methode von vielen Laboratorien übernommen werden, ohne dass Zugang zu BSL-3-Einrichtungen erforderlich ist. Es bleibt jedoch von entscheidender Bedeutung, die aus dem SC2-VLP-System gewonnenen Erkenntnisse mit lebendem SARS-CoV-2 zu validieren, um ihre Genauigkeit und biologische Relevanz sicherzustellen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch das Startup-Fund-Programm an der Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern des Dr. Ma Labors an der BUCM für die unschätzbare Diskussion und Unterstützung bei den Experimenten.