Производство системы частиц вируса SARS-CoV-2 для исследования вирусных жизненных циклов in vitro

Мы представляем оптимизированный протокол in vitro для производства вирусоподобных частиц SARS-CoV-2, которые точно имитируют подлинный вирус. Такой подход позволяет исследовать механизмы вирусной инфекции, сборки и выхода вирусной инфекции без ограничений, связанных с лабораторией уровня биобезопасности 3.

Метод вирусоподобных частиц тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) предлагает мощный и доступный инструмент для изучения жизненного цикла SARS-CoV-2 без необходимости использования лабораторий уровня биобезопасности 3 (BSL-3). Эта система эффективно имитирует критические этапы жизненного цикла вируса, включая сборку, упаковку генома и выход, используя репортер люциферазы, слитый с сигналом T20, для чувствительного и точного обнаружения производства вирусных частиц. SC2-VLP генерируются коэкспрессирующими структурными белками SARS-CoV-2, включая мембрану (M), нуклеокапсид (N), оболочку (E) и спайк (S), а также сигналом упаковки РНК в клетках HEK-293T. В отличие от традиционных систем вирусоподобных частиц, метод SC2-VLP обеспечивает точное количественное определение и большую верность естественному жизненному циклу вируса. Кроме того, по сравнению с методами лентивирусного псевдотипирования, которые ограничены изучением проникновения вируса через включение S-белка в лентивирусные частицы на основе ВИЧ, система SC2-VLP обеспечивает более комплексную платформу для изучения нескольких этапов биологии SARS-CoV-2. При этом этот метод обходит риски работы с живым вирусом и расширяет доступность. Метод SC2-VLP представляет собой значительный шаг вперед в противовирусных исследованиях и разработке терапевтических стратегий против SARS-CoV-2.

Пандемия COVID-19 стала одним из самых разрушительных глобальных кризисов в области здравоохранения в современной истории, приведшим к миллионам смертей во всем^мире1. Вирус SARS-CoV-2 проходит сложный жизненный цикл, включающий такие ключевые этапы, как заражение, репликация генома, сборка и выход. Инфекционный процесс начинается, когда вирусный спайковый белок (S) связывается с рецептором клетки-хозяина, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), способствуя высвобождению вирусного генома в клетку-хозяина ^2,3. Вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) затем катализирует репликацию геномной РНК. Эта РНК в комплексе с нуклеокапсидным белком (N) образует стабильную структуру, которая распознается мембранным белком (M). Белок М играет центральную роль в сборке вируса, рекрутируя комплекс РНК-N, S, и белок оболочки (E)^4,5. После сборки вирион завершает свой выход по неканоническому лизосом-опосредованному пути транспортировки⁶.

В ответ на пандемию были мобилизованы значительные глобальные ресурсы для разработки вакцин, нейтрализующих антител и противовирусных препаратов. Оценка этих вмешательств сыграла важную роль в продвижении исследований SARS-CoV-2⁷. Тем не менее, изучение живого вируса сопряжено со значительными логистическими проблемами, поскольку эксперименты с вирусом должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3 (BSL-3). Ограниченная доступность установок BSL-3 ограничивает темпы исследований, направленных на понимание SARS-CoV-2 и борьбу с ним.

Для решения этих проблем в исследованиях SARS-CoV-2 широко используются две основные системы — вирусоподобные частицы (VLP) и лентивирусная псевдотипизация, обе из которых не требуют локализации BSL-3⁸. Система VLP включает в себя котрансфекцию клеток с генами, кодирующими вирусные структурные белки, включая M, S, E и N, которые вместе генерируют вирусоподобные частицы. Эти частицы имитируют структурные и функциональные свойства вируса, что делает их ценным инструментом для изучения ключевых процессов в жизненном цикле SARS-CoV-2 и даже эффективным антигеном для разработки вакцины ^9,10,11.

И наоборот, система лентивирусного псевдотипирования включает замену белка G вируса везикулярного стоматита (VSV) в лентивирусе на S-белок SARS-CoV-2, что позволяет производить лентивирусные частицы, которые могут включать репортерные гены, такие как люцифераза или GFP. Эта система особенно полезна для исследования нейтрализующих антител, блокирующих взаимодействие S-ACE2¹². Тем не менее, лентивирусное псевдотипирование не отражает сборку или выход вируса SARS-CoV-2 из-за использования структурных белков ВИЧ, которые опосредуют высвобождение частиц на плазматической мембране.

Чтобы преодолеть эти ограничения, Syed et al. недавно идентифицировали сигнал упаковки SARS-CoV-2 в его геноме РНК, что демонстрирует специфичность белка N к распознаванию вирусного генома¹³. Путем слияния этого сигнала упаковки с репортерными генами можно эффективно встраивать эти гены в вирусоподобные частицы SARS-CoV-2 (SC2-VLP)¹³. Эта стратегия не только воспроизводит процессы сборки и выхода SARS-CoV-2, но и позволяет с высокой точностью измерять этапы заражения. В данном исследовании мы представляем экспериментальную методологию использования системы SC2-VLP и выделяем ключевые соображения для применения этого подхода.

1. Генерация SC2-VLP

1. Семена ~3,0 × 10⁶ клеток HEK-293T в тканевом планшете диаметром 10 см с полной средой DMEM, дополненной 10% v/v FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения высокой эффективности трансфекции и оптимальной продукции SC2-VLP, клетки HEK-293T должны поддерживаться на низком уровне пассажа ~10.
2. Культивируйте клетку HEK-293T при 37 °C, 5%_CO2 в течение примерно 24 ч и проверьте слитность клеток под микроскопом. Продолжайте, если ~70% сливается.
3. Разбавьте 60 мкл PEI с 1 мг/мл до 200 мкл средой, не содержащей сыворотки.
4. Добавьте 6,7 г N-плазмиды, 10 мкг плазмиды Luc-T20, 0,016 мкг S-плазмиды и 3,3 мкг M-IRES-E плазмиды в 200 мкл среды, не содержащей сыворотки (см . Дополнительный файл 1).
5. Осторожно добавьте разведенный PEI из стадии 1.3 в раствор, содержащий плазмиды, кодирующие белки вирусной структуры из стадии 1.4, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Это решение для трансфекции.
6. Осторожно капните раствор для трансфекции с шага 1.5 на клетки HEK-293T и осторожно поверните планшет для культуры тканей для тщательного перемешивания.
7. Через 6 ч после заражения замените среду для культивирования клеток полной средой DMEM и инкубируйте трансфицированные клетки HEK-293T при 37 °C, 5%_CO2 в течение 48 ч.
8. Соберите надосадочную жидкость инфицированных клеток HEK-293T, которая содержит SC2-VLP, а затем отфильтруйте надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления клеточного мусора. Это среда SC2-VLP.
   Примечание: Мы попытались получить SC2-VLP в клеточных линиях HeLa, Vero E6 и Caco2, но не удалось получить измеримый титр вируса, что указывает на специфичность протокола для клеток HEK-293T.

2. Исследование эффективности SC2-VLP

Клеточная линия HEK-293T, стабильно экспрессирующая ACE2 и TMPRSS2, была создана с использованием подхода лентивирусной трансдукции^14,15. Экспрессия белков как ACE2, так и TMPRSS2 была подтверждена вестерн-блоттингом в соответствии с протоколом, аналогичным описанному на этапе 3 (анализ состава SC2-VLP).

1. Затравить 4.0 × 10⁴ клеток HEK-293T со стабильной экспрессией ACE2 и TMPRSS2 в 96-луночный планшет и добавить 50 мкл среды SC2-VLP с шага 1.8.
2. Инкубируйте 96-луночный планшет для культивирования тканей при 37 °C с 5%_CO2 в течение 24 ч.
3. Удалите среду из 96-луночного планшета и однократно промойте 100 мкл PBS буфером при 37 °C, содержащим 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,8 мМ KH₂PO₄.
4. Лизируйте клетки HEK-293T ACE2/TMPRSS2 20 мкл буфера пассивного лизиса, осторожно покачивая образец в течение 15 минут на орбитальном вибростенде при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса содержит 25 мМ трис-фосфата (pH 7,8), 2 мМ DTT, 2 мМ 1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту, 1,25 мг/мл лизоцима, 2,5 мг/мл BSA, 10% глицерина и 1% Triton X-100).
5. Вращайте 96-луночный планшет при температуре 4 000 × г в течение 15 минут при 4 °C в охлаждаемой центрифуге на микропланшетах, а затем немедленно перенесите планшет на ледяную баню.
6. Возьмите 100 μL восстановленного буфера для анализа люциферазы в непрозрачный белый 96-луночный планшет и добавьте 20 μL лизата, начиная с шага 2.5. Быстро перемешайте их, пипетируя вверх и вниз 2-3 раза.
7. Измерьте люминесценцию с помощью планшетного ридера со следующими параметрами: Режим обнаружения: Люминесценция; Диапазон длин волн: Полный спектр; Формат планшета: 96-луночный стандартный непрозрачный планшет; Время интеграции: 200 мс.

3. Исследование состава SC2-VLP

1. Добавьте 1,36 мл раствора PEG 8000, содержащего 50% PEG 8000 и 2,2% NaCl, к 10 мл среды SC2-VLP с шага 1.8.
2. Держите смесь на орбитальном шейкере, и медленно перемешивайте раствор при 4 °C в течение ночи.
3. Центрифугируйте раствор при 4 °C, 2 000 × г в течение 30 мин и соберите гранулу SC2-VLP для анализа вестерн-блоттинга¹⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа вестерн-блоттинга вся информация об антителах представлена в Таблице материалов.

4. Анализ субклеточной локализации S и его мутантов в клетках, продуцирующих SC2-VLP

1. Высадите ~3,0 × 10⁶ клеток HEK-293T равномерно в чашке для культуры со стеклянным дном диаметром 15 мм, а затем дайте клеткам прилипнуть и расти до ~70% слияния перед трансфекцией.
2. Повторите процедуру трансфекции, описанную в шагах с 1.3 по 1.7, и модифицируйте только количество плазмиды следующим образом: N плазмида: 1,3 мкг, Luc-T20 плазмида: 2 мкг, S плазмида: 0,0032 мкг, и M-IRES-E плазмида: 0,66 мкг.
3. Осторожно дважды промойте чашку с культурой 1 мл ледяного PBS, а затем добавьте 1 мл 4% раствора фиксации параформальдегида (PFA) при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
4. Промойте клетки в течение 2 x 5 минут 1 мл PBS при RT, а затем пропитайте клетки, добавив 1 мл 0,25% Triton X-100 при RT в течение 10 минут.
5. Промойте клетки в течение 2 x 5 мин 1 мл PBS во время ЛТ, а затем добавьте 1 мл 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) во время ЛТ в течение 1 ч для блокирования взаимодействий неспецифических антител.
6. Добавьте ~200 μL раствора первичного антитела (достаточно, чтобы покрыть стеклянное дно) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
   Первичные растворы антител получают путем разведения в 5% BSA, растворенном в PBS, в следующих соотношении разведения: мышиное анти-S антитело в соотношении 1:200, кроличье анти-Sec61β антитело в соотношении 1:200, кроличье анти-GM130 антитело в соотношении 1:200 и кроличье анти-ERGIC53 антитело в соотношении 1:200. 5% раствор BSA/PBS служил как разбавителем, так и блокирующим буфером для минимизации неспецифического связывания во время последующих процедур иммунофлуоресцентного окрашивания.
7. Удалите первичный раствор антитела, а затем промойте клетки в течение 3 x 5 минут 1 мл PBS во время ОТ.
8. Добавьте флуоресцентно-конъюгированный раствор вторичного антитела в момент ЛТ в течение 1 ч, а затем промойте клетки в течение 3 х 5 мин 1 мл PBS в режиме ЛТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны выполняться в темноте или при минимальном освещении для предотвращения фотообесцвечивания флуоресцентных конъюгатов и сохранения целостности сигнала. Два типа флуоресцентно-конъюгированных вторичных антител, которые получают от мышей или кроликов, используются для окрашивания либо S-белка, либо белков-маркеров клеточных органелл.
9. Окрашивайте ядра 2,5 мкг/мл раствором Хёхста в режиме РТ в течение 5 минут, а затем промывайте клетки в течение 3 х 5 минут 1 мл PBS в режиме РТ.
10. Наблюдайте за окрашиванием S-белка или органелл и получайте изображения с помощью конфокального микроскопа со следующими параметрами: режим ФЭУ установлен на VBF (без усреднения, последовательное сканирование линий) с автоконфокальной апертурой. Для канала 1 (FITC) используйте лазер с длиной волны 488 нм при мощности 25% с излучением 500–548 нм, HV 525 В, коэффициентом усиления 1x и смещением 5%. Для канала 2 (Alexa Fluor 594) используйте лазер с длиной волны 594 нм на 25% мощности с излучением 610 - 670 нм, HV 500 В, коэффициент усиления 1x и смещение 5%. Для канала 3 (DAPI) используйте лазер с длиной волны 405 нм при мощности 25% с излучением 430–470 нм, HV 490 В, коэффициентом усиления 1x и смещением 5%.

Этапы выхода и сборки жизненного цикла SARS-CoV-2 изучены меньше, чем этапы инфицирования и репликации^17,18. До разработки метода SC2-VLP эти процессы можно было исследовать только с использованием живого SARS-CoV-2, что ограничивало исследования лабораториями BSL-3¹³. Рабочий процесс SC2-VLP, показанный на рисунке 1, описывает экспериментальный протокол и иллюстрирует процессы, участвующие в этих этапах жизненного цикла SARS-CoV-2. При таком подходе плазмиды, кодирующие структурные белки SARS-CoV-2 (M, E, S и N) и сигнал упаковки РНК (T20), котрансфицируются в клетки HEK-293T. Репортер люциферазы, слитый с сигналом T20, позволяет чувствительно обнаруживать высвобожденные SC2-VLP, которые затем могут инфицировать клетки-реципиенты, экспрессирующие рецепторы SARS-CoV-2 ACE2 и TMPRSS2, как показано на рисунке 1.

Для оптимизации количества плазмиды, кодирующей структурные белки SARS-CoV-2 и упаковочный сигнал, в частности S-плазмиду, мы трансфицировали клетки HEK-293T с различными концентрациями S-плазмиды. Результаты показали, что отношение S-плазмиды к другой плазмиде 1:10 обеспечивает оптимальные условия для производства SC2-VLP (Рисунок 2). Этот вывод согласуется с предыдущим отчетом Syed et al. и разумно объясняет, почему, несмотря на то, что он является одним из самых распространенных компонентов в вирионах SARS-CoV-2, уровень экспрессии S-белка относительно ниже по сравнению с белками M, N и E.

Система SC2-VLP служит мощной моделью для изучения процесса сборки SARS-CoV-2, точно повторяя как формирование вирусной оболочки, так и упаковку генома. Имеющиеся данные подчеркивают центральную роль М-белка в сборке, способствуя рекрутированию других структурных белков, включая N, S и E. Иммуноокрашивание этих белков выявляет их локализацию в субклеточных органеллах, вероятно, в комплексе ERGIC или цис-Гольджи, основных сайтах сборки SARS-CoV-2^19,20. Это подчеркивает потенциал системы SC2-VLP в качестве ценного инструмента для анализа механизмов сборки вирусов. Для дальнейшего изучения роли S в сборке мы ввели мутацию H1271E, которая нарушает COPI-опосредованную сортировку S, тем самым ухудшая инкорпорацию S в вирионы^21,22. В клетках-реципиентах эта мутация значительно снизила активность люциферазы, подтвердив, что система SC2-VLP не только достоверно повторяет вирусную инфекцию, но и служит мощным инструментом для исследования сборки SARS-CoV-2 — процесса, недоступного для обычных систем лентивирусного псевдотипирования (рис. 3). Кроме того, мы применили комплексный подход мутационного сканирования, нацеливаясь на отдельные остатки (1,255-1,273) в S-концевом хвосте для выявления дополнительных мутаций, которые, как и H1271E, могут ослаблять сборку вирионов и снижать титры вируса. На рисунке 3 показано, что мутация E1262H значительно снижает продукцию SC2-VLP, в то время как двойная мутация H1271E/E1262H полностью уничтожает ее. Эти результаты указывают на то, что E1262 может взаимодействовать с неопознанными факторами хозяина. Дальнейшая характеристика белков хозяина, связывающихся с этой областью, особенно тех, которые зависят от E1261, может выявить новые механизмы, регулирующие сборку SARS-CoV-2. В совокупности эти результаты делают SC2-VLP универсальной и физиологически значимой платформой для изучения сборки вируса в системах клеточных культур.

Для оценки субклеточной локализации S-белка в клетках, продуцирующих SC2-VLP, мы провели иммуноокрашивающий анализ как S-белка дикого типа, так и его мутанта H1271E. Результаты показывают, что S-белок преимущественно колокализуется с цис-маркером Гольджи GM130, демонстрируя при этом минимальное перекрытие с маркером ER Sec61β или маркером ERGIC ERGIC-53. Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями S-субклеточной локализации при подлинной инфекции SARS-CoV-2²³. Напротив, мутант H1271E продемонстрировал диффузное распределение и не продемонстрировал колокализацию с маркером цис-Гольджи GM130. Это говорит о том, что мутация нарушает правильную локализацию в месте сборки вируса, что потенциально объясняет его нарушенную способность облегчать сборку вирионов SARS-CoV-2 (рис. 4). Эти результаты еще раз подтверждают, что SC2-VLP являются ценным инструментом для изучения биологических функций S и других вирусных структурных белков.

Рисунок 1: Схематическое изображение производства SC2-VLP и его приложений. Сигнал упаковки геномной РНК SARS-CoV-2, T20, выделен голубым цветом, а S-белок — темно-зеленым. Плазмиды кодируют структурные белки SARS-CoV-2, включая M, E, N и S, при этом M и E экспрессируются совместно из одного вектора. На карте показаны ключевые этапы жизненного цикла вируса, включая сборку (светло-зеленый), выход (голубой) и инфекцию (оранжевый), как показано стрелками. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром-коронавирус 2; SC2-VLP = вирусоподобная частица SARS-CoV-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Чувствительность титра SC2-VLP к трансфицированному количеству плазмиды, кодирующей S. (A) Таблица, показывающая количество трансфекции плазмид, кодирующих структурные белки SARS-CoV-2 и сигнал упаковки гРНК. (B) Титр SC2-VLP изменяется в ответ на трансфицированное количество плазмиды, кодирующей S. Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром-коронавирус 2; SC2-VLP = вирусоподобная частица SARS-CoV-2; гРНК = направляющая РНК; RLU = единицы относительной люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Система SC2-VLP, используемая для исследования сборки S в вирионы. (А) S-мутанты, влияющие на транспортировку COPI, приводят к снижению титра SC2-VLP. (B) Вестерн-блоттинг обилия S и N белков SARS-CoV-2 в SC2-VLP. (C) Эффективность упаковки S рассчитана по формуле (B) с нормализованной до уровня N белка SC2-VLP. D) Количественная оценка распространенности SC2-VLP по пункту (B). Сокращения: SARS-CoV-2 = тяжелый острый респираторный синдром-коронавирус 2; SC2-VLP = вирусоподобная частица SARS-CoV-2; RLU = единицы относительной люминесценции; Ctr = контроль; WT = дикий тип; mut = мутант; NS = незначительный. Полоса, соответствующая полноразмерному шиповидному белку (S) SARS-CoV-2, помечена как S, в то время как фрагмент S2 (остатки 816-1,273) представляет собой С-концевую часть S-белка, а неспецифическая полоса между S и S2 обозначена как NS²⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Система SC2-VLP, используемая для исследования S-субклеточной локализации. (А-И) Репрезентативное иммуноокрашивающее изображение WT S в клетках HEK-293T, продуцирующих SC2-VLP, с коокрашиванием маркеров клеточных органелл. (А-С) маркер ER: (D-F) Sec61β, (G-I) маркер ERGIC: ERGIC-53; маркер комплекса цис-Гольджи: GM130. (Дж-Л) Колокализация мутанта S E1262H с маркером цис-Гольджи GM130. S обозначен зеленым цветом, маркеры клеточных органелл — красным, а клеточное ядро окрашено в синий цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Последовательности ДНК плазмид N, Luc-T20, S-плазмид и M-IRES-E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Простой и эффективный метод моделирования жизненного цикла SARS-CoV-2 в системах клеточных культур без ограничений лабораторий BSL-3 представляет собой ключевой шаг вперед в исследованиях анти-SARS-CoV-2. Метод SC2-VLP удовлетворяет эту потребность, предлагая надежную и доступную платформу. В этом исследовании мы представляем подробный протокол для метода SC2-VLP, в котором изложены важнейшие экспериментальные этапы для производства SC2-VLP. Кроме того, мы подчеркиваем его универсальность и потенциальное применение для углубления нашего понимания биологии SARS-CoV-2 и содействия разработке противовирусных стратегий.

Традиционные методы SARS-CoV-2 VLP и лентивирусной псевдотипизации широко используются в исследованиях анти-SARS-CoV-2 ^8,25. В традиционном методе VLP структурные белки M, N, E и S SARS-CoV-2 совместно экспрессируются для генерации вирусных частиц²⁶, при этом их численность обычно контролируется с помощью анализа WB. Тем не менее, вирусные структурные белки также включаются в другие мембранные структуры, такие как экзосомы, что усложняет анализ вирусных частиц^WB. В отличие от этого, метод SC2-VLP включает в себя репортерный ген, слитый с сигналом T20, что позволяет эффективно упаковывать репортер в вирусные частицы. Это позволяет проводить чувствительное и специфическое обнаружение содержания частиц, не полагаясь только на анализ ББ. Кроме того, метод SC2-VLP более точно имитирует полный жизненный цикл живого SARS-CoV-2 по сравнению с традиционным методом VLP.

Метод SC2-VLP превосходит подход лентивирусного псевдотипирования в нескольких критических аспектах. Система лентивирусного псевдотипирования опирается на каркас вируса ВИЧ-1, в котором вирионы собираются и отпочковываются от плазматической мембраны. Вирионы SARS-CoV-2, напротив, собираются внутри комплекса ERGIC или цис-Гольджи, что подчеркивает принципиальную разницу в их жизненных циклах. Это несоответствие делает метод лентивирусного псевдотипирования непригодным для изучения ключевых этапов жизненного цикла SARS-CoV-2, таких как репликация, сборка и выход, что ограничивает его применимость для исследования проникновения вируса и инфекции.

Метод SC2-VLP является простым и мощным инструментом для изучения жизненного цикла SARS-CoV-2. Не привлекая подлинного вируса, этот метод может быть принят многими лабораториями без необходимости доступа к объектам BSL-3. Тем не менее, по-прежнему крайне важно проверить результаты, полученные с помощью системы SC2-VLP с использованием живого SARS-CoV-2, чтобы обеспечить их точность и биологическую значимость.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана программой Startup fund Пекинского университета китайской медицины (BUCM) (90011451310011). Мы выражаем нашу благодарность всем сотрудникам лаборатории доктора Ма в BUCM за неоценимую дискуссию и помощь в проведении экспериментов.