Farelerde Akut Böbrek Hasarı için Bilateral Renal İskemi-Reperfüzyon Modeli

İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) modeli, akut böbrek hasarı (ABH) gelişiminin farklı aşamalarında, özellikle ABH'den kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerlemesi sırasında kullanılabilir. Burada, iskemik yaralanmayı indüklemek için renal pedikülleri vasküler bir klips aracılığıyla klempleyen transabdominal bir yaklaşımla farelerde IRI modeli geliştirme prosedürünü açıklıyoruz.

Akut böbrek hasarı (ABH), böbrek fonksiyonlarında hızlı bir düşüş olarak tanımlanır ve kalıcı böbrek fonksiyon bozukluğu, nefronların geri dönüşümsüz kaybı ve uyumsuz onarımları nedeniyle yavaş yavaş kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerler. Son yıllarda, hacim azalması, sepsis, nefrotoksisite, kas yaralanması ve majör travma gibi çeşitli etiyolojilerde ABH insidansı giderek artmakta olup, iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) en sık epizodu oluşturmaktadır. Farelerde IRI modelinin geliştirilmesi, ABH'nin klinik öncesi modelleri için güçlü ve kontrol edilebilir araçlar sağlayan renal pediküllerin cerrahi klemplenmesi ile indüklenir. Daha da önemlisi, IRI modeli, ABH gelişiminin farklı aşamalarında, özellikle AKI'den KBH'ye kadar olan süreçlerde kullanılmaktadır. IRI modelinin birçok laboratuvarda yaygın olarak uygulanmasına rağmen, bir dizi değişken hala bu modelin sonuçlarını etkilemektedir. Burada, araştırmacıların ABH gelişiminde altta yatan patogenezi ve ABH'nin KBH'ye ilerlemesini araştırmaları için tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem sağlamak için IRI model geliştirme prosedürünü açıklıyoruz.

Akut böbrek hasarı (ABH), 48 saat içinde serum kreatinininde ≥ 0.3 mg / dL (26.5 μM / L) artış veya serum kreatinininde 7 gün içinde taban çizgisinin 1.5 katına ≥ artış veya idrar hacmi 6 saat boyunca 0.5 mL / kg / s'< bir artış olarak tanımlanan, önemli morbidite ve mortaliteye sahip ciddi bir klinik sendromdur^{1, 2,3}. Onlarca yıllık araştırmalara rağmen, ABH için böbrek hasarını hafifletmek veya böbrek iyileşmesini hızlandırmak için etkili bir tedavi eksiktir ve ABH hastalarının önemli bir kısmı kronik böbrek hastalığına (KBH) ilerlemektedir4,5,6. Karmaşık moleküller ve yolaklar ABH ve kısmen ilerlemesinde rol oynar, bu nedenle klinik öncesi modeller, verimli terapötik modalitelerin geliştirilmesi için bu karmaşıklıkları çözmek için güçlü araçlar sağlar.

Klinik olarak, iskemi-reperfüzyon yaralanması (IRI) yaralanması, kardiyak ve karaciğer ameliyatları, dolaşım şoku, hacim azalması, sepsis, renal vasküler tıkanıklık veya tıkanıklık, böbrek nakli vb. dahil olmak üzere çeşitli durumlarda ABH'nin başlıca nedenidir⁷. IRI-AKI fare modeli 1960'lardan beri kullanılmaktadır; Bu model, iskemiye yol açan farelerde renal pediküllerin travmatik olmayan klemplerle cerrahi olarak klemplenmesi ve ardından klemplerin çıkarılarak renal kan akımının reperfüzyonu ile geliştirilmiştir. IRI-ABI modeli tipik olarak renal tübüler hücre ölümü ve ilerleyici böbrek dokusu hasarı ile karakterizedir. IRI, çeşitli nedenlerle ABH'de patogenez ve terapötik müdahale için kullanılan en yaygın modellerden biridir: (1) Cerrahi prosedürün basitliği ve güvenliği, IRI-ABH modelinin hayatta kalma oranını ve başarı oranını artırır⁸; (2) İskemi insan ABH'sinde önemli bir etiyoloji olduğundan, klinik ABH olayı^9'u değerlendirmek için IRI-ABH modeli daha iyi kullanılır; (3) IRI modeli, ABH'nin farklı aşamalarında böbrek hasarı ve histopatoloji değişiklikleri sunabilir, bu da ABH'den KBH^10'a ilerlemeyi incelemek için de geçerlidir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, IRI ile indüklenen ABH modelleri arasında bilateral IRI, sağlam kontralateral böbrekli tek taraflı IRI ve eşzamanlı kontralateral nefrektomi ile tek taraflı IRI bulunur. Özellikle, bilateral IRI modeli, ABH'nin insan patolojik koşullarıyla daha ilgili olarak kabul edilir, çünkü her iki böbrek de kan akışından etkilenmiştir¹¹. IRI modeli, böbrek nakli, kardiyak baypas, renal vasküler veya nefron koruyucu cerrahi sonrası ve ayrıca hipotansiyon⁹ ortamında azalan renal kan akışının etkilerini simüle etmek için uygulanabilir. Burada, araştırmacıların iskemiye bağlı ABH'de altta yatan patogenezi araştırmaları için tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlamak için bilateral bir IRI modeli için prosedürü açıklıyoruz.

8 haftalık ve 25 g ağırlığındaki erkek C57BL/6J fareler, bilateral iskemi-reperfüzyon ile AKI modelini oluşturmak için kullanıldı. Önceki çalışmalara göre, vücut ısısını 36.5 °C-37 °C civarında tutuyoruz ve IRI cerrahisinde böbrek iskemi süresi 30 dakikadır^12,13. Her grup için toplam 6 fareye ihtiyaç vardı ve sahte olarak çalıştırılan fareler kontrol görevi gördü. Bu çalışmadaki hayvan deneyleri, hayvanların refahını korumak için Zhejiang Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvan araştırma prosedürleri, Zhejiang Üniversitesi'nin etik yönergelerine ve ilkelerine uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Tüm cerrahi aletleri yüksek basınçla sterilize edin.
2. 7.6 mL steril salin içinde 2 mL ketamin ve 0.4 mL ksilazin ekleyerek anestezik çözeltiyi hazırlayın. Fareyi intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (16 mg / kg) karışımı ile uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırma refleksini kullanarak anestezik derinliği değerlendirin.
3. Hava yolunun engellenmediğinden emin olmak için anestezi uygulanmış fareyi homeotermik battaniyenin üzerine yerleştirin. Vücut ısısını 36,5-37 °C aralığında tutun.
4. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerini %1 tetrasiklin hidroklorür göz merhemi ile kapatın.
5. Karın kıllarını bir saç kesme makinesi ile tıraş edin ve cerrahi alanın cildini 3 kez povidon-iyot solüsyonu ile temizleyin.

2. Ameliyat

1. Cerrahi makasla yaklaşık 1-1,5 cm'lik bir karın medyan kesisini cilt ve kas tabakası üzerinden yapın ve karın boşluğunu yayıcı ile açın.
2. Retroperitoneal yağı hareket ettirerek ve bağırsakları ve diğer organları pamuklu çubukla ofsayta iterek böbreği açığa çıkarın. Böbrek, retroperitoneal boşlukta, omurganın yaklaşık 0.5 cm lateralinde ve 13^{. kaburganın} altında bulunur.
3. Fasya ve yağ dokusunu ayırmak ve çıkarmak ve sol renal pedikülleri ortaya çıkarmak için renal pedikülü ince sivri forseps ile inceleyin.
4. Renal pedikülleri tutma forseps kullanarak vasküler bir klips ile kelepçeleyin ve vasküler hasarın mümkün olduğunca küçük olduğundan emin olun. Eksik renal iskemiye yol açabilecek gereksiz renal sinüs yağını klemplemekten kaçının.
5. Böbrek iskemi süresini, 30 dakika boyunca klempleme ile başlayarak ayarlayın. Başarılı iskeminin özelliği, böbreğin birkaç dakika içinde yavaş yavaş kırmızıdan koyu mora değişmesidir.
6. Böbreği retroperitoneal boşluğa taşıyın. Sağ renal pedikülleri açığa çıkarmak ve klemplemek için karşı taraftaki prosedürü tekrarlayın.
7. Her iki böbreğin de iskeminin tam süresini almasını sağlamak için her iki taraftaki iskemi süresini ayrı ayrı kaydedin. İnsizyonu tekrar açın ve iskemi süresinin sonunda vasküler klipsi serbest bırakın.
8. Böbreği retroperitoneal boşluğa yerleştirin ve ardından Vicryl 4-0 sütür ile kas ve cildi katman katman dikin.
   NOT: Cerrahi işlemler steril şartlarda yapılmalıdır. Ameliyat masasını ve aletleri çalışma sırasında gerektiğinde %75 etanol ile temizleyin.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Sıvı kaybını telafi etmek için intraperitoneal enjeksiyon ile 0.5-1 mL ılık ve steril salin uygulayın.
2. Fare yeterli bilinci yeniden kazanana kadar sternal yaslanmaya dikkat edin. Fareyi tam bilinç kazanana kadar homeotermik battaniyenin üzerine koyun, ardından kafesine geri dönün. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
3. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için ilk 3 gün boyunca her 12 saatte bir buprenorfin 0.05-0.10 mg / kg verin. Cerrahi fareleri her gün izleyin.

4. Model değerlendirmesi

1. Hematoksilen-Eozin (HE) boyama
   1. IRI'den sonraki 1, 3, 7 veya 14. günlerde intraperitoneal enjeksiyonla pentobarbital sodyum kullanarak hayvanlara ötenazi yapın.
   2. Taze böbrek dokularını gece boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve 4 °C'de %75 etanol içinde saklayın.
   3. Dehidrasyon ve gömme işleminden sonra, elde edilen numuneleri boyama için 8 μm kalınlığında kesin.
   4. Doku bölümlerini ksilen içinde mumdan arındırın ve ardından azalan etanol konsantrasyonları ile rehidre edin.
   5. Doku bölümlerini hematoksilen ve eozin ile boyayın.
   6. Etanol ve ksilen konsantrasyonlarını artırarak doku bölümlerini kurutun.
2. Böbrek fonksiyon testi
   1. Anesteziden sonra göz küresi kan alma yöntemini kullanarak kan örnekleri toplayın.
   2. Serumu ayırmak için kan örneklerini 12000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   3. Böbrek fonksiyonunu izlemek için otomatik kuru kimya analizörü ile serum kreatinin ve kan üre azotunu (BUN) belirleyin.
3. Gerçek Zamanlı PCR (RT-PCR)
   1. Hızlı bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak böbrek dokularından toplam RNA'yı çıkarın ve ardından bir ters transkriptaz karışım kiti ile cDNA'yı sentezleyin. SYBR Green Premix Kit ile RT-PCR gerçekleştirin ve RT-PCR cihazında çalıştırın. Burada kullanılan primer dizileri^14'ten önce rapor edilmiştir: KIM1 ileri, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; ters 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL ileri, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; ters 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTAGTCC-3'; GAPDH ileri, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; ters 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Ameliyat sırasında böbreğin durumu

Başarılı iskeminin özelliği, böbreğin 1-2 dakika içinde kademeli olarak kırmızıdan koyu mora değişmesi ve başarılı reperfüzyonun böbreğin 1-2 dakika içinde yavaş yavaş koyu mordan kırmızıya dönüşmesi ile karakterize olmasıdır.

Ameliyat sonrası böbreğin histolojisi

HE ve Periyodik Asit Schiff (PAS) boyama, akut böbrek hasarını doğrulamanın doğrudan yollarıdır. İskemi-reperfüzyon yaralanma modelinde, baskın yaralanan bölge proksimal tübüllerin S3 segmentidir. Renal tübüler hasarın klasik belirtileri arasında şiddetli tübüler genişleme ve bozulma, fırça kenarı kaybı, dökülmüş kalıntı ve hücre apoptozu bulunur. Boru şeklindeki hasar aynı zamanda kör bir şekilde hasar görmüş tübüllerin yüzdesi ile de puanlanır: 0 puan, hasar yok; skor 1,% <25 hasarlı tübüller; Skor 2,% 25 -% 50 hasarlı tübüller; skor 3,% 50 -% 75 hasarlı tübüller; Skor 4,% >75 hasarlı tübüller. İskemiye bağlı ABH'de renal tübüler ve yüksek tübüler yaralanma skorunun karakteristik patolojik değişikliklerini doğruladık (Şekil 1A-B).

Ameliyat sonrası böbreğin işlevi

Böbrek fonksiyonundaki bir düşüş, otomatik bir kuru kimya analizörü tarafından tespit edilen yüksek serum kreatinin ve BUN seviyeleri ile değerlendirilebilir (Şekil 1C-D).

Ameliyat sonrası renal tübülün yaralanması

Nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalin (NGAL) ve böbrek hasarı molekülü-1 (KIM1), ABH^15'in erken teşhisi için renal tübüler disfonksiyonu değerlendirmek için iyi bilinen ve hassas biyobelirteçlerdir. Gerçekten de, iskemiye bağlı ABH'de erken tübüler yaralanma belirteçleri NGAL ve KIM1'in ekspresyonunun arttığını gözlemledik (Şekil 1 E).

Şekil 1: Bilateral IRI modelinde böbreğin histolojisi ve işlevi. (A-B) Böbrek bölümlerinin hematoksilen-Eozin boyaması (HE) ve Periyodik Asit-Schiff boyaması (PAS), bilateral IRI modelinde (ölçek çubukları, 100 μm) böbrek hasarı ve tübüler yaralanma skorunun nicelleştirilmesini gösterdi. Oklar, boru şeklindeki fırça sınır kaybını, boru şeklindeki dilatasyonu ve bozulmayı, düzleşmiş epitel hücrelerini ve tübüler epitel hücrelerinin dökülmesini gösterir. (C-D) Serum kreatinin ve BUN sham ve bilateral IRI fare seviyesi. (E) Sahte ve bilateral IRI faresinin böbreğinde KIM1 ve NGAL'nin nispi ekspresyonunun RT-qPCR analizi. Veriler ortalama ± SD olarak sunuldu. İstatistiksel analiz Student t-testi kullanılarak yapıldı. P < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu yazıda, renal IRI modeli hakkında ayrıntılı bir prosedür sunduk ve daha sonra ABH ve ABH'nin KBH'ye ilerlemesi için sağlam bir model olduğunu vurguladık. Ek olarak, böbrek histolojisi ve fonksiyonu dahil olmak üzere iki ana böbrek hasarı kriterinin etkisini gösteriyoruz.

Tekrarlanabilir ve güvenilir bir model için cerrahi prosedürlerde birkaç kilit noktanın vurgulanması gerekir. Karın ameliyatı için, ameliyatla ilişkili travmayı en aza indirmek için böbreği açığa çıkarmak için orta hat insizyonu önerilir. Retroperitoneal yağ nedeniyle renal pedikülü tamamen diseksiyon yapmak zordur, bu nedenle renal pedikülü bir çift forseps ile böbrekten ileri geri soyun. Ayrıca, cerrahi işlemin stabilitesini korumak için aynı damar kelepçesinin uygulanması ve işlem sırasında damar kelepçesinde aşınma olup olmadığına dikkat edilmesi önerilir. Ek olarak, ameliyat sırasında böbrek hasarına katkıda bulunacak sıvı kaybı nedeniyle tuzlu su takviyesi vererek farelerin dehidrasyonunu önlemek de önemlidir.

IRI'nin cerrahi prosedürlerinde birkaç önemli sorun giderme yönteminin vurgulanması gerekir. İlk olarak, böbreği ve pedikülünü ayırırken böbrek kanamasını gidermek zordur. Kanamanın çoğu, sızıntı noktasının yeterince sıkıştırılmasıyla kontrol edilebilirken, kanama hacmi 0.5 mL> hemorajik şoka neden olabilir. Bu durumda, fareyi ötenazi yapın ve araştırmadan çıkarın. İkincisi, böbreğin eksik iskemisi dikkat edilmesi gereken başka bir husustur. İlk olarak, renal pedikülün tam olarak ayrılmaması daha az iskemik hasara yol açacaktır. Renal pedikül tamamen izole edilmezse, vasküler klemp eksik tıkanıklığa neden olabilir ve operatör böbreğin tam iskemisini doğrulamak için vasküler klempi değiştirebilir. İşlem sırasında aynı damar klempinin kullanılması ve aşınmış klempin yenilenmesi önerilir. Üçüncüsü, vasküler klemp çıkarıldıktan sonra renal reperfüzyon bozukluğu, vasküler lezyonlara veya kan pıhtısı oluşumuna bağlı olabilir, ötenazi yapabilir ve bu tür fareleri araştırmadan çıkarabilir.

IRI modelinde böbrek hasarının şiddetini etkileyen birkaç kritik değişken vardır. İskemi süresi ve vücut ısısı böbrek hasarının ana belirleyicileridir. Önceki çalışmalarda bildirildiği gibi, bilateral böbrek iskemisi sonrası 25-30 dakika boyunca tübüler yaralanmanın ilerleyici olduğu bulunmuştur. İskemik süre her 2 dakikada bir arttığından tübüler yaralanma önemli ölçüde şiddetlenir ve 60 dakikadan fazla iskemik süre akut tübüler nekroz¹⁶ ile sonuçlanabilir. Ek olarak, çekirdek vücut sıcaklığı, IRI modelindeki sonucu önemli ölçüde etkiler. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, daha yüksek vücut sıcaklığına (36-37 °C) sahip fareler daha belirgin bir etkiye sahipken, iskemi ^8,17 sırasında daha düşük sıcaklıklara (33-35 °C) sahip farelerde belirgin bir değişiklik gözlenmemiştir. Vücut sıcaklığının ABH'nin şiddeti üzerindeki etkisi metabolizmaya bağlıdır: (1) vücut sıcaklığının artması, iskemi sırasında hücre zarlarının zarar görmesine ve hücre içi enerji depolarının azalmasına neden olur; (2) daha yüksek vücut ısısı ile artan inosin ve hipoksantin seviyeleri, reperfüzyon üzerine serbest radikal üretiminin artmasına neden olur^18,19. İskemi süresi ve vücut ısısının yanı sıra, ABH'nin tutarlı bir IRI modeli için fare suşu, yaş, cinsiyet, vücut ağırlığı, dehidratasyon durumu, anestezi, ameliyat süresi vb. gibi çeşitli faktörler dikkate alınmalıdır^20,21. Yukarıdaki değişken faktörler deney düzeneğinde tutarlı olarak kabul edilmelidir.

Mevcut IRI-AKI modelinde birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, tutarlı ve güvenilir bir iskemik ABH modeli oluşturmak için iyi eğitimli ve yetenekli bir operatör şarttır ve teknik konular için sistematik cerrahi eğitimden yararlanılmalıdır. Ayrıca, fare IRI modelinde histolojik analizde böbrek hasarının şiddeti insan ABI^22'de nadiren gözlenir; İnsan ABI durumunu eşleştirmek için bu modelin daha fazla araştırılmasına ihtiyaç vardır. Ayrıca, fare suşu, IRI modelinde AKI'ye duyarlılığı da etkiler; Bireysel fare çizgileri için IRI-AKI koşullarının oluşturulması önemlidir.

Sonuç olarak, bilateral IRI-ABH modeli, patojenik araştırma ve tedavi yaklaşımları için göreceli ve tutarlı bir modeldir. Özellikle, bu IRI modelinin aktarılabilirliğini sağlamak için cerrahi prosedürlerde birkaç kritik nokta sağlanmıştır. Son olarak, iskemi süresi ve vücut sıcaklığının ana belirleyiciler olduğunu vurguluyoruz ve ayrıca IRI modelindeki varyasyonu etkileyen bazı ek faktörlerden de bahsediyoruz.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bu çalışmada gösterdikleri iş birliği için tüm katılımcılara teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma, Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LZ22H050001) ve Zhejiang eyaleti Weiqiang Lin'e Üst Düzey Yenilikçi Sağlık Yeteneklerinin Yetiştirilmesi için programından sağlanan finansmanla desteklenmiştir.