Modello bilaterale di ischemia-riperfusione renale per danno renale acuto nei topi

Il modello di danno da ischemia-riperfusione (IRI) può essere utilizzato in diverse fasi dello sviluppo del danno renale acuto (AKI), specialmente durante la progressione da AKI a malattia renale cronica (CKD). Qui, descriviamo la procedura per lo sviluppo del modello IRI nei topi tramite un approccio trans-addominale, bloccando i peduncoli renali tramite una clip vascolare per indurre il danno ischemico.

Il danno renale acuto (AKI) è definito come un rapido declino della funzione renale, in cui la disfunzione renale persistente progredisce gradualmente verso la malattia renale cronica (CKD) a causa della perdita irreversibile di nefroni e della loro riparazione disadattiva. Negli ultimi anni, l'incidenza dell'AKI è aumentata per quanto riguarda diverse eziologie, tra cui deplezione di volume, sepsi, nefrotossicità, lesioni muscolari e traumi maggiori, in cui la lesione da ischemia-riperfusione (IRI) rappresenta la maggior parte degli episodi. Lo sviluppo del modello IRI nei topi è indotto dal clampaggio chirurgico dei peduncoli renali, che fornisce strumenti potenti e controllabili per modelli preclinici di AKI. È importante sottolineare che il modello IRI viene implementato in diverse fasi dello sviluppo dell'AKI, in particolare nei processi da AKI a CKD. Nonostante il modello IRI sia ampiamente praticato in molti laboratori, una serie di variabili influenzano ancora i risultati di questo modello. Qui, descriviamo la procedura di sviluppo del modello IRI per fornire un metodo ripetibile e affidabile ai ricercatori per esplorare la patogenesi sottostante nello sviluppo di AKI e la progressione di AKI in CKD.

Il danno renale acuto (AKI) è una sindrome clinica grave con morbilità e mortalità significative, definite come un aumento della creatinina sierica di ≥ 0,3 mg/dL (26,5 μM/L) entro 48 ore o un aumento della creatinina sierica a ≥ 1,5 volte il basale entro 7 giorni, o volume delle urine < 0,5 mL/kg/h per 6 ore^{1, 2,3}. Nonostante decenni di ricerca, manca una terapia efficace per l'AKI in grado di alleviare il danno renale o accelerare il recupero renale e una percentuale considerevole di pazienti con AKI progredisce verso la malattia renale cronica (CKD)^4,5,6. Molecole e percorsi complessi sono coinvolti nell'AKI e nella sua progressione in parte, quindi i modelli preclinici forniscono potenti strumenti per svelare queste complessità per lo sviluppo di modalità terapeutiche efficienti.

Clinicamente, la lesione da ischemia-riperfusione (IRI) è la principale causa di AKI in varie condizioni, tra cui interventi chirurgici cardiaci ed epatici, shock circolatorio, deplezione di volume, sepsi, occlusione o ostruzione vascolare renale, trapianto di rene e così via⁷. Il modello di topo IRI-AKI è in uso dagli anni '60; Questo modello è stato sviluppato mediante clampaggio chirurgico dei peduncoli renali con pinze non traumatiche nei topi che hanno portato all'ischemia e seguito da riperfusione del flusso sanguigno renale rimuovendo le pinze. Il modello IRI-AKI è tipicamente caratterizzato da morte delle cellule tubulari renali e danno progressivo al tessuto renale. L'IRI è uno dei modelli più comuni utilizzati per la patogenesi e l'intervento terapeutico nell'AKI per diversi motivi: (1) La semplicità e la sicurezza della procedura chirurgica migliorano il tasso di sopravvivenza e il tasso di successo del modello IRI-AKI⁸; (2) Poiché l'ischemia è una delle principali eziologie nell'AKI umana, il modello IRI-AKI è meglio utilizzato per valutare l'evento clinico^{AKI 9}; (3) Il modello IRI potrebbe presentare danni renali e cambiamenti istopatologici in diversi stadi di AKI, che è applicabile anche allo studio della progressione da AKI a CKD¹⁰. A seconda del disegno sperimentale, i modelli di AKI indotta da IRI includono IRI bilaterale, IRI unilaterale con rene controlaterale intatto e IRI unilaterale con nefrectomia controlaterale simultanea. In particolare, il modello IRI bilaterale è considerato più rilevante per le condizioni patologiche umane di AKI perché entrambi i reni sono stati colpiti dall'afflusso di sangue¹¹. Il modello IRI è applicabile per simulare gli effetti della riduzione del flusso sanguigno renale dopo trapianto di rene, bypass cardiaco, chirurgia vascolare renale o nephron-sparing, nonché nel contesto dell'ipotensione⁹. Qui, descriviamo la procedura per un modello IRI bilaterale per fornire un metodo coerente e affidabile ai ricercatori per esplorare la patogenesi sottostante nell'AKI indotta da ischemia.

Topi maschi C57BL/6J di 8 settimane di età e del peso di 25 g sono stati utilizzati per stabilire il modello AKI mediante ischemia-riperfusione bilaterale. Come da studi precedenti, manteniamo la temperatura corporea a circa 36,5 °C-37 °C e la durata dell'ischemia renale è di 30 minuti nell'intervento IRI^12,13. Erano necessari un totale di 6 topi per ogni gruppo e i topi azionati da sham fungevano da controlli. Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università di Zhejiang per proteggere il benessere degli animali. Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state eseguite seguendo le linee guida e i principi etici dell'Università di Zhejiang.

1. Preparazione pre-operatoria

1. Sterilizza ad alta pressione tutti gli strumenti chirurgici.
2. Preparare la soluzione anestetica aggiungendo 2 ml di ketamina e 0,4 ml di xilazina in 7,6 ml di soluzione fisiologica sterile. Anestetizzare il topo con una miscela di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Valutare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Posizionare il topo anestetizzato sulla coperta omeotermica per assicurarsi che le sue vie aeree rimangano libere. Mantenere la temperatura corporea nell'intervallo 36,5-37 °C.
4. Copri gli occhi del topo con unguento per gli occhi all'1% di tetraciclina cloridrato per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
5. Radere i peli dell'addome con un tagliacapelli e pulire la pelle dell'area chirurgica con una soluzione di iodio povidone per 3x.

2. Chirurgia

1. Praticare un'incisione mediana addominale di circa 1-1,5 cm con le forbici chirurgiche attraverso la pelle e lo strato muscolare e aprire la cavità addominale con un divaricatore.
2. Esporre il rene spostando il grasso retroperitoneale e spingendo l'intestino e gli altri organi verso il fuorigioco con un batuffolo di cotone. Il rene si trova nello spazio retroperitoneale, a circa 0,5 cm lateralmente alla colonna vertebrale e sotto la^13a costola.
3. Sezionare il peduncolo renale con una pinza a punta fine per separare e rimuovere la fascia e il tessuto adiposo ed esporre i peduncoli renali sinistri.
4. Bloccare i peduncoli renali con una clip vascolare utilizzando una pinza di tenuta e assicurarsi che il danno vascolare sia il più lieve possibile. Evitare di bloccare il grasso ridondante del seno renale, che può portare a un'ischemia renale incompleta.
5. Impostare la durata dell'ischemia renale, iniziando con il clampaggio per 30 minuti. La caratteristica dell'ischemia di successo è che il rene passa gradualmente dal rosso al viola intenso in pochi minuti.
6. Spostare il rene nello spazio retroperitoneale. Ripetere la procedura sul lato controlaterale per esporre e bloccare i peduncoli renali destri.
7. Registrare il tempo di ischemia su ciascun lato separatamente per assicurarsi che entrambi i reni ricevano l'esatta durata dell'ischemia. Riaprire l'incisione e rilasciare la clip vascolare al termine della durata dell'ischemia.
8. Riposizionare il rene nello spazio retroperitoneale, quindi suturare il muscolo e la pelle strato per strato con la sutura Vicryl 4-0.
   NOTA: Le procedure chirurgiche devono essere eseguite in condizioni sterili. Pulire il tavolo operatorio e gli strumenti con etanolo al 75% durante il funzionamento, quando necessario.

3. Assistenza post-operatoria

1. Somministrare 0,5-1 ml di soluzione fisiologica calda e sterile mediante iniezione intraperitoneale per compensare la perdita di liquidi.
2. Mantenere la decubito sternale con attenzione fino a quando il topo non ha riacquistato sufficiente coscienza. Metti il topo sulla coperta omeotermica fino a quando non riprende piena coscienza, quindi torna nella sua gabbia. Non restituire il topo alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
3. Somministrare buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg ogni 12 ore per i primi 3 giorni per alleviare il dolore post-operatorio. Monitora i topi chirurgici ogni giorno.

4. Valutazione del modello

1. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)
   1. Eutanasia degli animali con pentobarbital sodico mediante iniezione intraperitoneale nei giorni 1, 3, 7 o 14 dopo l'IRI.
   2. Fissare i tessuti renali freschi con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte e conservare in etanolo al 75% a 4 °C.
   3. Dopo la disidratazione e l'inclusione, tagliare i campioni ottenuti in uno spessore di 8 μm per la colorazione.
   4. Decerare le sezioni di tessuto in xilene, quindi reidratare con concentrazioni decrescenti di etanolo.
   5. Colorare le sezioni di tessuto con ematossilina ed eosina.
   6. Disidratare le sezioni di tessuto aumentando le concentrazioni di etanolo e xilene.
2. Dosaggio della funzionalità renale
   1. Raccogliere campioni di sangue utilizzando il metodo di raccolta del sangue del bulbo oculare dopo l'anestesia.
   2. Centrifugare campioni di sangue a 12000 x g per 10 minuti per separare il siero.
   3. Determinare la creatinina sierica e l'azoto ureico nel sangue (BUN) mediante l'analizzatore automatico di chimica a secco per monitorare la funzionalità renale.
3. PCR in tempo reale (RT-PCR)
   1. Estrarre l'RNA totale dai tessuti renali utilizzando un kit di estrazione rapida dell'RNA, quindi sintetizzare il cDNA con un kit di miscelazione per trascrittasi inversa. Eseguire la RT-PCR con il kit SYBR Green Premix ed eseguire l'esecuzione sullo strumento RT-PCR. Le sequenze di primer qui utilizzate sono state riportate prima del¹⁴: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; inverso 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL in avanti, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; rovescio 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH in avanti, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; inverso 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Stato del rene durante l'intervento chirurgico

La caratteristica dell'ischemia di successo è che il rene cambia gradualmente da rosso a viola intenso entro 1-2 minuti e la riperfusione di successo è caratterizzata dal rene che passa gradualmente dal viola intenso al rosso entro 1-2 minuti.

Istologia del rene dopo l'intervento chirurgico

L'HE e la colorazione con acido periodico di Schiff (PAS) sono i modi diretti per verificare il danno renale acuto. Nel modello di lesione da ischemia-riperfusione, il sito danneggiato dominante è il segmento S3 dei tubuli prossimali. Le manifestazioni classiche del danno tubulare renale includono grave dilatazione e rottura del tubolare, perdita del bordo della spazzola, detriti desquamati e apoptosi cellulare. Il danno tubolare viene valutato anche dalla percentuale di tubuli danneggiati in modo cieco: punteggio 0, nessun danno; punteggio 1, <25% di tubuli danneggiati; punteggio 2, 25%-50% tubuli danneggiati; punteggio 3, 50%-75% tubuli danneggiati; Punteggio 4, >75% Tubuli danneggiati. Abbiamo confermato le caratteristiche alterazioni patologiche del punteggio di lesione tubulare renale e dell'elevato punteggio di lesione tubulare nell'AKI indotta da ischemia (Figura 1A-B).

Funzione del rene dopo l'intervento chirurgico

Un declino della funzionalità renale può essere valutato da livelli elevati di creatinina sierica e azotemia, che sono stati rilevati da un analizzatore automatico di chimica secca (Figura 1C-D).

Lesione del tubulo renale dopo l'intervento chirurgico

La lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (NGAL) e la molecola di danno renale-1 (KIM1) sono biomarcatori ben consolidati e sensibili per valutare la disfunzione tubulare renale per l'identificazione precoce di AKI¹⁵. Infatti, abbiamo osservato che l'espressione dei marcatori di lesione tubulare precoce NGAL e KIM1 era elevata nell'AKI indotta da ischemia (Figura 1 E).

Figura 1: Istologia e funzione del rene nel modello IRI bilaterale. (A-B) La colorazione ematossilina-eosina (HE) e la colorazione periodica con acido-Schiff (PAS) delle sezioni renali hanno mostrato danno renale nel modello IRI bilaterale (barre di scala, 100 μm) e quantificazione del punteggio di lesione tubulare. Le frecce mostrano la perdita del bordo tubolare a spazzola, la dilatazione e la rottura tubulare, l'appiattimento delle cellule epiteliali e la desquamazione delle cellule epiteliali tubulari. (C-D) Creatinina sierica e livello di azotemia del topo sham e IRI bilaterale. (E) Analisi RT-qPCR dell'espressione relativa di KIM1 e NGAL nel rene di topi sham e IRI bilaterali. I dati sono stati presentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-test di Student. P < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo articolo, abbiamo fornito una procedura dettagliata sul modello IRI renale, evidenziando successivamente che si tratta di un modello robusto per la progressione di AKI e AKI a CKD. Inoltre, dimostriamo l'impatto dei due principali criteri di danno renale, tra cui l'istologia e la funzione renale.

Diversi punti chiave nelle procedure chirurgiche devono essere enfatizzati per un modello ripetibile e affidabile. Per la chirurgia addominale, si consiglia un'incisione sulla linea mediana per esporre il rene per ridurre al minimo il trauma associato all'intervento chirurgico. È difficile sezionare interamente il peduncolo renale a causa del grasso retroperitoneale, quindi staccare il peduncolo renale dal grasso con un paio di pinze attraverso il rene avanti e indietro. Inoltre, si consiglia di applicare lo stesso morsetto vascolare per mantenere la stabilità del processo chirurgico e prestare attenzione all'eventuale usura del morsetto vascolare durante la procedura. Inoltre, è anche importante prevenire la disidratazione dei topi somministrando un'integrazione salina, a causa della perdita di liquidi che contribuirebbe al danno renale durante l'intervento chirurgico.

Diversi importanti metodi di risoluzione dei problemi devono essere enfatizzati nelle procedure chirurgiche di IRI. Innanzitutto, è difficile risolvere il sanguinamento renale durante la separazione del rene e del suo peduncolo. La maggior parte del sanguinamento può essere controllata comprimendo adeguatamente il punto di trasudamento, mentre un volume di sanguinamento > 0,5 ml può indurre shock emorragico. In questo caso, sopprimere ed escludere il topo dalla ricerca. In secondo luogo, l'ischemia incompleta del rene è un altro aspetto a cui prestare attenzione. In primo luogo, una separazione incompleta del peduncolo renale porterebbe a un danno ischemico minore. Se il peduncolo renale non è completamente isolato, il clamp vascolare può causare un'occlusione incompleta e l'operatore può cambiare il clamp vascolare per confermare la completa ischemia del rene. Si consiglia di utilizzare lo stesso morsetto vascolare durante la procedura e di sostituire il morsetto usurato. In terzo luogo, il disturbo da riperfusione renale dopo la rimozione del morsetto vascolare può essere dovuto a lesioni vascolari o formazione di coaguli di sangue, eutanasia ed escludere tali topi dalla ricerca.

Diverse variabili critiche influenzano la gravità del danno renale nel modello IRI. Il tempo di ischemia e la temperatura corporea sono i principali determinanti del danno renale. Come riportato da studi precedenti, è stato riscontrato che il danno tubulare è progressivo dopo ischemia renale bilaterale per 25-30 minuti. La lesione tubulare si aggrava in modo significativo poiché la durata ischemica aumenta ogni 2 minuti e una durata ischemica superiore a 60 minuti può provocare necrosi tubulare acuta¹⁶. Inoltre, la temperatura corporea interna influisce in modo significativo sull'esito nel modello IRI. Non sorprende che i topi con temperature corporee più elevate (36-37 °C) abbiano un effetto più pronunciato, mentre non sono stati osservati cambiamenti evidenti nei topi con temperature più basse (33-35 °C) durante l'ischemia ^8,17. L'effetto della temperatura corporea sulla gravità dell'AKI è collegato al metabolismo: (1) l'aumento della temperatura corporea provoca il danneggiamento delle membrane cellulari e la diminuzione delle riserve di energia intracellulare durante l'ischemia; (2) L'aumento dei livelli di inosina e ipossiantina con una temperatura corporea più elevata produce un aumento della produzione di radicali liberi in seguito alla riperfusione^18,19. Oltre alla durata dell'ischemia e alla temperatura corporea, diversi fattori dovrebbero essere presi in considerazione per un modello IRI coerente di AKI, come il ceppo del topo, l'età, il sesso, il peso corporeo, lo stato di disidratazione, l'anestesia, il tempo dell'intervento chirurgico e così via^20,21. I fattori variabili di cui sopra devono essere considerati coerenti nella configurazione sperimentale.

L'attuale modello IRI-AKI presenta alcune limitazioni. In primo luogo, un operatore ben addestrato e abile è essenziale per stabilire un modello coerente e affidabile di AKI ischemico e per le questioni tecniche dovrebbe essere utilizzata una formazione chirurgica sistematica. Inoltre, la gravità del danno renale all'analisi istologica nel modello IRI murino è raramente osservata nell'AKI²² umano; è necessaria un'ulteriore esplorazione di questo modello per abbinare lo stato dell'AKI umano. Inoltre, il ceppo di topo influisce anche sulla suscettibilità all'AKI nel modello IRI; è importante stabilire le condizioni IRI-AKI per le singole linee di topi.

In conclusione, il modello bilaterale IRI-AKI è un modello relativo e coerente per l'indagine patogenetica e gli approcci terapeutici. In particolare, vengono forniti diversi punti critici nelle procedure chirurgiche per garantire la trasferibilità di questo modello IRI. Infine, evidenziamo che il tempo di ischemia e la temperatura corporea sono i principali determinanti, e citiamo anche alcuni fattori aggiuntivi che influenzano la variazione all'interno del modello IRI.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Esprimiamo il nostro apprezzamento a tutti i partecipanti per la loro collaborazione nel presente studio. Questo studio è stato supportato dal finanziamento della Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LZ22H050001) e dal programma provinciale di Zhejiang per la coltivazione di talenti di salute innovativa di alto livello a Weiqiang Lin.