Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu yeni iş akışı, kantitatif diferansiyel proteomik analiz için minimum başlangıç materyali ile Caenorhabditis elegans'tan SDS'de çözünmeyen proteinleri (çözünmez) verimli bir şekilde çıkarır ve izole eder. Protokol, yaşlanma mekanizmaları ve patolojileri hakkında biyolojik içgörüler elde etmek için çözünmez ve biyoinformatik analizi ölçmek için kapsamlı bir veriden bağımsız edinim kütle spektrometresi analizi kullanır.
Biz ve diğerleri, yaşlanma sürecinin proteom çapında çözünmeyen protein birikimi ile sonuçlandığını gösterdik. Çözünmeyen proteinleri kodlayan genlerin zamanın% 40'ından fazlasının parçalanması, C. elegans'ta yaşam süresinin uzamasına neden olur ve bu proteinlerin çoğunun yaşlanma sürecinin temel belirleyicileri olduğunu düşündürür. Bu çözünmeyen proteinlerin izolasyonu ve kantitatif olarak tanımlanması, yaşlanma sırasında meydana gelen temel biyolojik süreçleri anlamak için çok önemlidir. Burada, yeni bir etiketsiz kantitatif proteomik analiz yoluyla kütle spektrometrik iş akışlarını kolaylaştırmak için SDS'de çözünmeyen proteinlerin (çözünmez) C. elegans'tan daha verimli bir şekilde nasıl çıkarılacağını ve izole edileceğini ayrıntılarıyla anlatan değiştirilmiş ve geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu geliştirilmiş protokol, protein ekstraksiyonu için verimliliği büyük ölçüde artıran ve önceki protokollere göre (tipik olarak en az 40.000 solucan kullanarak) önemli ölçüde daha az başlangıç materyali (yaklaşık 3.000 solucan) kullanmamıza izin veren solucan lizisi için yüksek verimli bir sonikatör kullanır. Çözünmezin müteakip kantitatif proteomik analizi, protein keşfi ve tanımlanması için veriye bağlı edinim (DDA) ve kapsamlı ve daha doğru protein kantitasyonu için veriden bağımsız edinim (DIA) kullanılarak gerçekleştirildi. Kantitatif proteinlerin biyoinformatik analizi, C. elegans'ta diğer moleküler yöntemlerle kolayca takip edilebilecek potansiyel adaylar sağlar. Bu iş akışı ile rutin olarak 1000'den fazla proteini tanımlıyor ve 500'den fazla proteini ölçüyoruz. Bu yeni protokol, C. elegans ile verimli bileşik taramayı mümkün kılar. Burada, bu geliştirilmiş protokolü yabani tip C. elegans N2-Bristol suşuna doğruladık ve uyguladık ve yaşlı 10. gün N2 solucanlarının, 2. gün genç solucanlara göre daha fazla çözünmez birikimi gösterdiğini doğruladık.
Protein homeostazı yaşlanma ile giderek azalır ve protein agregasyonunun artmasına neden olur 1,2,3. Protein agregasyonu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz4 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir. Yaşlanma, protein agregasyonu ile ilişkili nörodejeneratif bozuklukların başlangıcı için temel bir risk faktörü olarak kabul edilir. Çözünmeyen agregalar oluşturmaya eğilimli proteinler genellikle hücresel toksisite ve doku disfonksiyonu ile bağlantılıdır, bu da diğer proteinlerintoplanmasını daha da hızlandırabilir 5,6,7. Alternatif olarak, çözünmeyen protein agregatları, proteinin toksik oligomerik formlarını sistemden uzaklaştırmak için hücresel savunma mekanizmalarını aktive edebilir. Çözünmeyen proteinleri kodlayan seçilmiş genlerin parçalanması, hem yaşa bağlı hastalık hem de normal yaşlanma bağlamında Caenorhabditis elegans'ın (C. elegans) ömrünü modüle eder 5,8,9. Bu nedenle, protein agregasyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek, yaşlanmayı anlamak için çok önemlidir ve sonuçta nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için yaklaşımlara yol açabilir.
Nematod C. elegans , göreceli kısa bir yaşam süresi (yaklaşık 2 hafta), yetiştirme kolaylığı ve genetik manipülasyon gibi benzersiz özellikleri nedeniyle yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıklarda protein agregasyonunu incelemek için en yaygın kullanılan model organizmalardan biri haline gelmiştir.
Çözünmeyen proteinleri ekstrakte etme ve karakterize etme yeteneği, C. elegans modellerinde protein agregasyonu ile ilişkili yaşa bağlı değişikliklerin belirlenmesinde kritik bir rol oynamıştır. Protein agregasyonunun normal yaşlanma süreçlerine katkısını araştırmak için, biz5 ve diğerleri2, daha önce genç ve yaşlı C. elegans'ın çözünmezliğini ekstrakte ettik ve proteolitik olarak sindirdik, iTRAQ reaktifleri kullanılarak kimyasal olarak etiketlendi ('bağıl ve mutlak miktar tayini için izobarik etiketleme') ve daha sonra MS tabanlı yöntemler kullanılarak nicelleştirildi. İzobarik bir etiketleme yöntemi ve 120 mg ıslak solucan (yaklaşık 40.000 solucan) kullanarak, önemli miktarda protein çözünmez derinliği ve kapsama alanı elde edebildik5. Kantitatif analiz, tanımlanan 1200 proteinden 203'ünün, genç solucanlardan elde edilen benzer çözünmez fraksiyonlarına kıyasla yaşlı C. elegans'ın çözünmezliğinde önemli ölçüde zenginleştirildiğini göstermiştir5. Bağımsız olarak, David ve ark. normal yaşlanma ile protein agregatlarındaki değişiklikleri incelemek için bir iTRAQ LC-MS/MS iş akışı da kullandı2. Yaklaşık 300 mg solucanla başlayarak, iki biyolojik kopya kullanarak ~ 1000 çözünmeyen protein tanımladılar ve yaklaşık 1000 proteinden ~ 700'ünün genç solucanlara kıyasla yaşla birlikte 1.5 kat veya daha fazla biriktiğini belirlediler2. Genel olarak, bu bağımsız sonuçlar, yaygın protein çözünmezliği ve agregasyonunun normal yaşlanmanın doğal bir parçası olduğunu ve hem yaşam süresini hem de nörodejeneratif hastalık insidansını etkileyebileceğini göstermektedir 2,5.
Çözünmezi incelemek, çevresel etkilerin yaşlanma sürecini nasıl hızlandırabileceğini veya yavaşlatabileceğini belirlememize izin vermişti. Klang ve ark. metallostazın uzun ömürlülükteki rolünü araştırmak için C. elegans'ta etiketsiz proteomik iş akışları oluşturdu10. Bu çalışmada, insolublom 10'u çıkarmak için en az40.000 solucan kullanıldı. Veriler, demir, bakır, kalsiyum ve manganez seviyelerinin yaşlanmayla birlikte arttığını ve solucanların yüksek demir içeren bir diyetle beslenmesinin, çözünmeyen proteinlerin yaşa bağlı birikimini önemli ölçüde hızlandırdığını göstermiştir10. D vitamininin C. elegans'ın çözünmezliği üzerindeki etkilerini incelemek için aynı iş akışı kullanılarak, genç solucanlarda 38 protein (2. gün) ve yaşlı solucanlarda (8. gün) 721 protein ölçüldü. D vitamini beslemesi, yaşlı solucanların çözünmezliğini 721'den 371 proteine önemli ölçüde azalttı11. Daha fazla araştırma, D vitamini ile beslenmenin yaşla birlikte protein çözünmezliğini baskıladığını, protein homeostazını desteklediğini ve C.elegans N2 yabani tip solucanlarda yaşam süresini uzattığını ortaya koydu11. Bu nedenle, insolublomu incelemek, yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkların yeni modülatörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.
Çözünücü maddenin incelenmesi, yaşlanma sürecinin anlaşılmasında paha biçilmez olsa da, büyük miktarlarda başlangıç numunesi materyali toplama gereksinimi nedeniyle engellenmiştir. Groh ve ark. yakın zamanda yaşlanma ile birlikte C. elegans'taki doğal protein agregasyon değişikliklerini incelemek için etiketsiz bir proteomik miktar tayini iş akışı tanıttı; Bununla birlikte, büyük miktarlarda başlangıç materyali (350 mg yer solucanı) gerektiriyordu12. Bu raporda, geliştirilmiş yeni bir ekstraksiyon ve izolasyon protokolü oluşturduk (Şekil 1). Solucan lizisi sırasında yüksek verimli sonikatörün kullanılması, ekstraksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırdı ve daha sonra ihtiyaç duyulan başlangıç materyali miktarını 40.000'den 3.000 solucana düşürdü. Bu yeni insolublome izolasyon protokolünü, etiketsiz, veriden bağımsız edinim (DIA) kütle spektrometrik iş akışıyla birleştirmek, protein derinliğini ve kapsamını önemli ölçüde iyileştirdi. Burada sunulan protokol uygun maliyetlidir ve diğer model sistemlerde çözünmez analizlerinin performansına izin vermek için kolayca değiştirilebilir.
NOT: Deneysel prosedürün daha iyi anlaşılması için, iş akışının şeması için Şekil 1'e bakın.
1. Senkronize yaşlanma C. elegans'ın kitle kültürü
2. Solucanlardan SDS'de çözünmeyen fraksiyonun ekstraksiyonu
3. MS analizi için proteinleri izole etmek için tripsin proteaz ile jel içi sindirim
4. Sindirilmiş peptitlerin C18 tuzdan arındırma ucu ile tuzdan arındırılması
5. DDA ve DIA kullanılarak sindirilmiş peptitlerin kütle spektrometresi analizi
NOT: Numuneler, DDA veya DIA LC-MS/MS yöntemleri kullanılarak analiz edilebilir. Bu çalışmada numuneler, yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine bağlı bir nano-LC 2D HPLC sistemi kullanılarak analiz edilmiştir.
6. Veri analizi
NOT: Belirli veri analizi ayarları, belirli deneysel koşullara göre uyarlanmalıdır. Örneğin, seçilen protein veri tabanı (fasta dosyası), numunenin hazırlandığı türe bağlı olacaktır (bu protokolde C. elegans kullandık).
Geleneksel solucan lizis yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin, prob bazlı sonikasyon ve boncuk çırpıcı yöntemleri, metal ucun veya boncukların doğrudan numunelerle temasına izin vererek aşırı ısı üretir, bu da değişken protein geri kazanımları ve protein denatürizasyonu ile sonuçlanır. Sıvı azot öğütme ve ardından lizis tamponunda sonikasyon, zaman alıcı olabilir ve çok sayıda solucan gerektirir. Geleneksel solucan parçalama yöntemlerinin sınırlamaları nedeniyle, iTRAQ etiketleme yöntemleri veya çözünmez hakkında nicel bilgi elde etmek için C. elegans model sisteminde tarihsel olarak kullanılan etiketsiz yöntemler gibi önceki MS iş akışları, büyük miktarda başlangıç materyali girişi gerektirir (en az 40.000 solucan). Bu sayıda solucanı elde etmek için zahmetli bir solucan kültürü çalışması gereklidir. Ayrıca, etiketleme yöntemleri pahalı izobarik kimyasal etiketler gerektirir. Etiketsiz miktar tayini yöntemleri uygun maliyetlidir ve daha kolay ve daha anlaşılır numune hazırlama ve etiketleme yöntemlerine sahiptir, ancak yeterli MS analiz kapsamı elde etmek için önemli ölçüde çok sayıda solucan gerektirir.
Kullandığımız sonikatör, çapraz kontaminasyon14 olmadan sıcaklık kontrollü bir su banyosu sonikatöründe aynı anda birden fazla solucan örneğini parçalayarak solucan lizizinin verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde arttırır, böylece gerekli başlangıç solucan materyali miktarını önemli ölçüde azaltır. Yüksek verimli sonikasyon yöntemini ve kantitatif DIA etiketsiz MS yaklaşımını birleştirerek, ~ 3.000 solucan kullanarak yaşlı ve genç solucanların çözünmezliğini sağlam bir şekilde ölçebildik. Burada protokolün etkinliğini test ettik ve doğruladık ve vahşi tip bir solucan türü olan N2-Bristol C. elegans'tan yaşlı ve genç solucanların çözünmezliğini karşılaştırdık. Bu protokolü, ~ 3.000 yaşlı ve genç N2 C. elegans'tan (her koşul için iki biyolojik kopya) çözünmezi çıkarmak ve izole etmek için uyguladık, ardından dört kutuplu bir uçuş süresi kütle spektrometresi veya protein tanımlama ve miktar tayini için veriye bağlı edinim (DDA) ve veriden bağımsız edinimlerin (DIA/SWATH) bir kombinasyonunu kullanan diğer MS sistemleri ile MS analizi yaptık. Çözünmeyen proteinler ilk olarak, her bir çözünmez numunesindeki protein miktarını belirlemek için bir Bis-Tris %4-12 gradyan jeli üzerinde analiz edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, N2 yaşlı solucanlardan (şerit 2 ve 3, biyolojik çoğaltma deneyleri) alınan çözünmez örneği, N2 genç solucanlarından alınan örneklerden (şerit 1 ve 4, biyolojik çoğaltma deneyleri) önemli ölçüde daha fazla protein içerir.
Jel içi sindirimden sonra, çözünmeyen maddenin protein profilleri HPLC-MS ile analiz edildi. Bu iş akışını kullanarak, genellikle 1000-1500 proteini tanımlayabilir ve yüksek tekrarlanabilirlik ile SDS'de çözünmeyen fraksiyondan 500-1.000 proteini ölçebiliriz (yayınlanmamış veriler). Burada, DIA verilerini analiz ederek ve fazlalığı ortadan kaldırarak N2-Bristol C. elegans'ın çözünmezinden 989 proteini ölçebildik: 768 protein önemli ölçüde zenginleştirildi ve 27 protein, en az 1.5'lik bir kat değişikliği ve 0.01'den daha düşük bir Q değeri kullanılarak genç (2. gün) ile karşılaştırıldığında, yaşlı N2 solucanının (10. gün) çözünmezinde önemli ölçüde azaldı (Şekil 3A). Histogram grafiğinde görüldüğü gibi (Şekil 3B), önemli ölçüde değişmiş proteinlerin kat değişimi normal bir dağılım gösterir. Yaşlı solucanların insolublom için önemli ölçüde zenginleştirildiği gösterildi: Gözlenen en büyük değişiklik, insolublomdaki nispi protein bolluğunun yaşlı solucanlarda genç solucanlara göre 592 kat daha yüksek olduğunu gösterdi; Ve 32 protein için, insolublomdaki nispi protein bolluğu, yaşlı ve genç solucanlarda >250 kat daha yüksekti, bu da yaşla birlikte dramatik insolublom değişikliklerini gösteriyordu.
Yaşlı solucanlarda önemli ölçüde artan ve solucan tabanı (WS271) tarafından tanımlanan çözünmeyen proteinlerin listesi çıkarıldıktan sonra, bunların yaşlanma ile nasıl ilişkili olduğuna dair biyolojik içgörüler elde etmek için yaşlı çözünmez içinde zenginleştirilmiş yolları belirlemek için KEGG yolu ve Gen Ontolojisi (GO) analizi yapıldı. Bu çalışmada tanımlanan proteinlerin KEGG yolu analizi, ribozomlar, mitokondri, proteazom ve splisozom içeren çeşitli yolların zenginleşmesini göstermektedir (Şekil 4A). Gen ontolojisi analizi, yaşlı solucanlardan gelen çözünmezin, mitokondriyal, gelişimsel, yetişkin ömrünün belirleyicileri ve ribozomal proteinler dahil olmak üzere belirli kategorilerde birçok protein içerdiğini göstermektedir (Şekil 4B ve Ek Tablo 1A). Daha sonra, bu çalışmada tanımlanan proteinlerin listesini, Venn diyagramlarında gösterildiği gibi, David ve ark.2 ve Mark ve ark.11'in daha önce yayınlanmış çalışmalarıyla karşılaştırdık (Şekil 5A, 5B). Karşılaştırma, tanımlanan proteinler 394/721 ve 444/721'in sırasıyla David ve arkadaşları (Şekil 5A) ve Mark ve arkadaşları (Şekil 5B) çalışmaları ile anlamlı bir örtüşme olduğunu gösterdi. Bu çalışmadan elde edilen çözünmezin KEGG analizi ile ortaya çıkan biyolojik yollar da geçmişte tanımlanmıştır ve böylece metodolojimiz doğrulanmıştır (Ek Tablo 1B). Bu yolakların ve proteinlerin tanımlanması, yaşlanma bağlamındaki işlevleriyle ilgili olarak daha fazla biyolojik araştırma için aday olarak hizmet edebileceklerini düşündürmektedir.
Özetle, verimli sonikasyon yönteminin kullanılması, önemli ölçüde daha az başlangıç solucan materyali ile yüksek protein kapsamı elde etmek için iyi kontrol edilen sıcaklıklara ve azaltılmış çapraz kontaminasyona sahip bir ortamda aynı anda birden fazla solucan örneğinin parçalanmasını sağlar. Verimli sonikasyon yöntemini DIA etiketsiz bir protein niceleme iş akışı ile birleştirmek, çözünmeyen solucan proteinlerinin nicelleştirilmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamıştır.
Şekil 1. Protokolün deneysel iş akışı. C. elegans farklı günlerde kültürlenmiş ve toplanmıştır. Bir sonikatör ile solucan lizizinden sonra,% 1 SDS'de çözünmeyen protein fraksiyonu (çözünmez) ekstrakte edildi ve lizattan izole edildi. Çözünmez daha sonra jel içi tripsin sindirimi yoluyla sindirildi ve DIA kütle spektrometresi ile ölçüldü, ardından biyoinformatik analiz yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Çözünmeyen şişmanın SDS-PAGE jeli, N2-Bristol suşunun genç ve yaşlı solucanlarını izole etti. N2-Bristol suşunun genç ve yaşlı solucanlarının çözünmezleri, mevcut protein miktarını belirlemek için SDS-PAGE ile analiz edildi. SDS-PAGE jeli, protein bantlarını görselleştirmek için bir floresan protein boyası ile boyandı. Şerit 1 ve 4: Genç N2 solucanlarının iki biyolojik kopya deneyinden elde edilen çözümsüzlük (2. Gün). Şerit 2 ve 3: Yaşlı N2 solucanlarının iki biyolojik kopya deneyinden elde edilen çözümsüzlük (10. gün). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Protein adayları, yaşlı ve genç insolublomda ve bunların kıvrım değişim dağılımlarında önemli değişiklik gösterdiği tespit edildi. (A) Yaşlı ve genç N2-Bristol solucanlarının çözünmezliğinin ölçülmesi için yanardağ grafiği. Mutlak kat değişimi >=1.5 ve Q değeri <0.01 olan adaylar kırmızı nokta olarak gösterilir. (B) Yaşlı ve genç solucan örneklerinde önemli ölçüde zenginleştirilmiş SDS'de çözünmeyen proteinlerin kıvrım değişimi dağılımı için histogram grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. KEGG yolu ve Gen Ontolojisi (GO) analizi. (A) Üstte gösterilen oldukça önemli yol ile p değerine göre düzenlenmiş gün-10 çözünmez KEGG yolu analizi. (B) Gen Ontolojisi analizi, yaşlı solucanların çözünmezliğinin, mitokondriyal, gelişimsel, yetişkin ömrünün belirleyicileri ve ribozomal proteinler dahil olmak üzere belirli kategorilerdeki birçok protein için zenginleştirildiğini göstermektedir. Dağılım grafiği görünümü, GO terimlerini, daha benzer terimlerin birbirine daha yakın konumlandırıldığı bir "anlamsal uzayda" görselleştirir. Kabarcığın rengi, STRING analizinde elde edilen p değerini yansıtırken, boyutu UniProt-GOA veritabanındaki GO teriminin genelliğini yansıtır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Bu çalışmayı (A) David ve ark.2 ve (B) Mark ve ark.11 çalışmaları ile karşılaştıran 10. gün çözünmez proteini örtüşmesi tespit etti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1 (Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgili). (A) Gen ontolojisi (biyolojik süreç) STRING veritabanı ile analiz edilmiştir. (B) Bu çalışmada tanımlanan proteinlerin ve KEGG yolaklarının ayrıntılı listesi, yayınlanmış çalışma ile örtüşmelerini gösteren renk kodları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu protokolde, C. elegans'tan çözünmeyen proteinlerin ekstraksiyonu için geliştirilmiş bir numune hazırlama yöntemi rapor edilmiştir. Geleneksel solucan lizizini (örneğin, prob sonikasyonu veya boncuk çırpıcı teknikleri) verimli sonikatör ile değiştirerek, çözünmeyen protein ekstraksiyonunun verimini artırdık ve etiketsiz MS analizi için gereken solucan sayısını 40.000 solucandan 3.000 solucana düşürdük. DDA verilerinden protein tanımlaması için bir veritabanı arama motoru kullanıldı ve 'DIA Kantitatif Analiz Yazılımı' ve ilgili DDA veritabanı arama sonuçları (veritabanı arama motoru tarafından oluşturulan FDR dosya raporlarının içe aktarılması) kullanılarak C. elegans spektral kütüphanesi oluşturuldu. Yaşlı ve genç C. elegans insolublome verilerinin nispi nicelleştirilmesi, yeni DIA veri setini ve oluşturulan spektral kütüphaneyi işlemek için 'DIA Kantitatif Analiz Yazılımı' kullanılarak gerçekleştirildi.
Protokolde birkaç adım kritik öneme sahiptir. C. elegans'ın kısa ömrü, memeli hücreleri gibi diğer ökaryotlara kıyasla yaşlanmayı incelemek için ideal bir sistem haline getirir, ancak yaşlanma ile ilgili fenomeni incelerken homojen bir solucan popülasyonunu izole etmek çok önemlidir. Bu protokolde senkronize yaşlanan solucanlar elde etmek için FUDR kullanıldı. Etkinliğini sağlamak için solucanları L4 aşamasının başlarında FUDR içeren NGM tohumlu plakaya aktarmak önemlidir. Verimli sonikatör kullanılarak solucan lizisi sırasında, numunelerin aşırı ısınmasını önlemek için su banyosu sıcaklığı 4 ° C'ye ve sonikasyon 30 s AÇIK ve 30 s KAPALI'ya ayarlanmalıdır. 10 döngü (10 dakika) boyunca ilk sonikasyon turundan sonra, tüm solucanların verimli bir şekilde parçalandığından emin olmak için mikroskop altında kontrol etmek önemlidir. Değilse, daha fazla sonikasyon döngüsüne ihtiyaç vardır. Jel içi sindirim işlemi sırasında, her bir jel dilimi uygun boyutta (<1 mm2) parçalara ayrılmalıdır - çok küçükse, numune hazırlama sürecinde kaybolabilirler ve çok büyüklerse, sindirim yetersiz olabilir.
Çok daha az başlangıç malzemesine duyulan ihtiyaç, çözünmeyen analizler için numune elde etmek için solucan kültürü ile ilişkili zahmetli çalışmayı önemli ölçüde azaltır. Bununla birlikte, %1 SDS'de çözünmeyen protein fraksiyonunun ekstraksiyonu ve izolasyonu, birden fazla yıkama adımını içerir ve numune kaybını önlemek ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için dikkatli numune kullanımı gereklidir. MS analizi için üretilen malzeme miktarı, sonraki DDA ve DIA analizi için ~ 3 enjeksiyon için yeterlidir, ancak gelecekteki deneyler için tasarruf etmek için yeterli değildir. Ayrıca, potansiyel olarak kafa karıştırıcı etkilerine15 rağmen, yaşlanma sürecinde solucanları sterilize etmek için mümkün olan en düşük FUdR konsantrasyonunu kullandık. Gelecekteki çalışmalar, steril mutantlar kullanarak veya solucanları manuel olarak aktararak ve toplayarak FUdR kullanımını engelleyebilir.
Solucan lizisi için yüksek verimli sonikatörün kullanılması, çözünmezin verimli bir şekilde ekstraksiyonuna izin vererek, iyi protein kapsamına ve büyük ölçüde azaltılmış sayıda solucan kullanarak çözünmeyen blomu ölçmek için uygun maliyetli, etiketsiz DIA MS analizine izin verir. İş yükünü önemli ölçüde azaltır ve deney başına daha fazla koşulun taranmasına olanak tanır. Ek olarak, etiketsiz MS DIA iş akışı uygun maliyetlidir ve iTRAQ, TMT veya SILAC dahil olmak üzere etiketleme yöntemleriyle karşılaştırılabilir seviyelerde protein derinliği ve kapsamı sağlar. C. elegans modeli, yaşlanma araştırmaları için hızlı bir tarama sistemidir. İş akışı, bu ve diğer organizmalarda yaşlanma ve yaşa bağlı hastalık araştırmalarını incelemek için kolayca değiştirilebilir ve uygulanabilir. Örneğin, devam eden çalışmalarda, gelecekteki yüksek verimli ilaç taraması için farklı ilaç müdahaleleri olsun veya olmasın, Abeta, tau ve ikili Abeta/tau solucanları dahil olmak üzere çeşitli Alzheimer hastalığı (AD) C. elegans modellerinde çözünmez ve proteostazın protein profillerini araştırmak için bu iş akışını uyguluyoruz.
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Bu çalışma, bir TripleTOF sistemi (1S10 OD016281, Buck Institute), NIH hibesi, RF1 AG057358 (GJL, JKA) ve NIH hibe U01AG045844 (GJL) için bir NIH ortak enstrümantasyon hibesi ile desteklenmiştir. XX, bir T32 doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir (NIH hibesi 5T32AG000266, PI: Judith Campisi ve Lisa Ellerby). MC, Larry L. Hillblom Vakfı'ndan doktora sonrası bir burs ile desteklenmektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains used | |||
Esherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
N2 (Bristol) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Buffer/Solution | |||
NGM (Nematode Growth Media) | Recipe: 3 g/L NaCl, 23 g/L agar; 2.5 g/L peptone; 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4 | ||
S-basal solution | Recipe: 5.85 g/L NaCl, 1g/L K2HPO4, 6 g/L KH2PO4, H2O to 1 L | ||
Sodium hypochlorite bleach solution | Recipe: Mix 0.5 mL 5 N NaOH with 1 ml Sodium hypochlorite (5%) and make volume to 5 mL with H20. | ||
Material/ Equipment | |||
Agar | Difco Granulated Agar, BD Biosciences | 90000-782 | |
Bioruptor Plus sonication device | Diagenode, USA | B01020001 | |
Cholesterol | Sigma | c8503 | |
2'-deoxy-5-fluorouridine | VWR | TCD2235 | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356350-1000ML | |
LB broth, Miller | Millipore Sigma | 60801-450 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS? | Sigma | L4509-250G | |
Sodium chloride | Sigma | 59888 | |
M880 Ultrasonic bath, 117 V, holds 5.5 gallons | VWR, USA | 89375-458 | |
Magnesium sulphate | Sigma | M506 | |
Magnesium chloride | Sigma | 208337 | |
NGM agar plate | VWR Disposable Petri Dishes | 25384-342 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
NuPAGE protein gels, 4-12% | Invitrogen | NP 0335BOX | |
Protease inhibiotr cocktail (PIC) | Roche | 11836170001 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Sodium hypochlorite 5% | VWR | JT9416-1 | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S12000 | |
MS Section | |||
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS | Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA | 36XL66 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9830 (1 kg) | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
Methanol, HPLC Grade | Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA | 34885 | |
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (pre-column chip) (200 um x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 300 A) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
Nano cHiPLC ChromXP 75 um by 15cm, C18-CL, 3 um, 120 A (analytical column chip) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOP 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | Per quote | |
ProteinPilot 5.0 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model # 845 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA | 600-30-76 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır