Method Article
Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.
Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.
Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3'ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS'un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA molekülündemutasyonların ortaya çıkmasına neden olabilecek oksidatif bir stres durumuna neden olur 2,3,4,5. Hücrelerde, dokularda ve tüm organizmalarda oksidatif hasarın kademeli birikimi zamanla istikrarlı bir şekilde artar ve hücre ölüm programlarının, çeşitli patolojilerin ve yaşlanma sürecininindüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir 2,3,4,6.
Aerobik organizmalar, hücrelerde ve dokularda aşırı ROS birikiminin üstesinden gelmek için sürekli olarak verimli moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, süperoksit radikal dismutasyonunu moleküler oksijen ve hidrojen peroksite katalize eden süperoksit dismutaz (SOD) protein ailesinin üyelerini ve ayrıca hidrojen peroksitin daha sonra suya ve moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmek için antioksidan havuzu (glutatyon, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin 7,8) kullanan farklı katalazları ve peroksidazları içerir.
Bununla birlikte, birkaç rapor, ROS'un proliferasyon, farklılaşma ve hareketlilikdahil olmak üzere kritik hücre fonksiyonlarını düzenleyen moleküler devrelerin temel bileşenleri olarak rolünü desteklemektedir 2,3,4. Bu kavram, lipoksijenazlar, siklooksijenazlar ve NADPH oksidazlar 9,10 dahil olmak üzere aerobik organizmalarda özel ROS üreten mekanizmaların ilk tanımlanması ve karakterizasyonu ile daha da desteklenmektedir. Bu anlamda, ROS omurgalı embriyo gelişimi sırasında aktif bir rol sergiler 11,12,13 ve bu moleküllerin spesifik in vivo fizyolojik fonksiyonların düzenlenmesinde kilit rolleri, Drosophila14'te hematopoietik progenitörlerin farklılaşma programı, zebra balıklarında iyileşme indüksiyonu veya Xenopus kurbağa yavrularında kuyruk rejenerasyonu 15 dahil olmak üzere farklı deneysel sistemlerde bildirilmiştir . Memelilerde ROS, bir nörosfer modelinde16 nöral kök hücrelerin kendi kendini yenileme / farklılaşma potansiyelinde ve kolorektal kanser başlangıcı sırasında bağırsak kök hücre fonksiyonunun deregülasyonunda17 rol oynamıştır. Deride, ROS sinyalizasyonu epidermal farklılaşma ve cilt kök hücre nişinin ve saç folikülü büyüme döngüsünündüzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir 18,19.
Bu perspektifte, hem normal hem de patolojik koşullarda biyolojik sistemlerde ROS'un fizyolojik rollerini belirlemek için önemli bir deneysel sınırlama, bu moleküllerin hücrelerde ve dokularda kontrollü üretimini indüklemek için yeterli deneysel araçların bulunmamasıdır. Şu anda, çoğu deneysel yaklaşım, çoğunlukla hidrojen peroksit formunda eksojen ROS uygulamasını içermektedir. Yakın zamanda, endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncüllerinin uygulanmasına dayanan fare derisinde geçici, öldürücü olmayan bir in vivo endojen ROS üretimini açmak için deneysel bir yaklaşım uyguladık (PpIX; ör., aminolaevulinik asit veya metil türevi metilaminolevulinat) ve hücre içi moleküler oksijenden yerinde ROS oluşumunu indüklemek için numunenin kırmızı ışıkla daha fazla ışınlanması (Şekil 1). Bu fotodinamik prosedür, yerleşik kök hücre nişlerini uyarmak için etkili bir şekilde kullanılabilir, böylece dokunun rejeneratif programlarını aktive eder 19,20 ve ciltrejeneratif tıbbında yeni terapötik modalitelerin yolunu açar. Burada, saç folikülünün19,21 çıkıntı bölgesindeki uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) etiket tutucu hücrelerin (LRC'ler) sayısındaki artış olarak ölçülen, kök hücre nişlerinin uyarılmasının temsili örneklerini gösteren protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz ve ardından geçici olarak indüklenen rejenerasyon programlarının aktivasyonu (saç büyümesinin hızlanması ve yanık iyileşme süreçleri), C57Bl6 fare suşunun derisinde öldürücü olmayan ROS üretimi.
Tüm fare yetiştiriciliği ve deney prosedürleri, hayvan deneyleri ile ilgili yerel, ulusal, uluslararası mevzuat ve yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
1. Saç büyümesinin indüksiyonu, yanık indüksiyonu ve kuyruk derisi epitelindeki uzun süreli BrdU LRC'lerin tanımlanması
NOT: Aşağıda açıklanan deneysel tasarımlar için 10 günlük veya 7 haftalık C57BL/6 fareler, tercihen yavrular kullanın. Tüm deneysel prosedürlerde, hayvanlar% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturulacak veya belirtildiği gibi servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır.
2. Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretiminin indüksiyonu
NOT: Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in bir öncüsü kullanılarak fotodinamik bir tedavi, bu durumda metil-aminolevulinat (mALA) ve kırmızı ışık kullanılacaktır.
3. Deride ROS tespiti
Fare sırt ve kuyruk derisinde mALA öncüsünün topikal uygulaması, bu bileşiğin mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızımsı-pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde kıl folikülünde önemli bir PpIX birikimine neden olur (Şekil 2A, C). Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla (636 nm) 2.5−4 J /cm2'lik bir akıcılıkta ışınlanması, dokuda, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde geçici ROS üretimini teşvik eder (Şekil 2B, D).
Fare derisinde in vivo ölümcül olmayan ROS üretiminin açılması, foto tedavilerden iki gün sonra saç folikülünün şişkin bölgesinde somatik kök hücreler olarak kategorize edilen LRC'lerin sayısında önemli bir artışı teşvik eder (Şekil 3, sol paneller). Özellikle, LRC sayısındaki artış geçicidir ve tedavilerden 6 gün sonra normal seviyelere geri döner (Şekil 3, sağ panel). Bu bölge fare derisindeki ana kök hücre nişlerinden biri olduğundan, bu bölgedeki hücre proliferasyonunun geçici bir indüksiyonu esas olarak şişkin nişin ve yerleşik kök hücre proliferasyon ve farklılaşma programlarının fonksiyonel aktivasyonunu yansıtır22,23.
Çıkıntılı kıl folikülü nişinin ROS'a bağlı aktivasyonu ayrıca ciltteki fizyolojik tepkilerle ilişkilidir. Bu nedenle, geçici ROS üretimi, 2. derece yanıktan sonra cildin iyileşme sürecini önemli ölçüde hızlandırır (Şekil 4A,B). Hasarlı/kabuklu cilt alanının kademeli olarak azalmasının ölçülmesi, dokuda PpIX'e bağlı geçici ROS üretiminin neden olduğu yara iyileşmesi hızlanma sürecinin sağlamlığını ve istatistiksel önemini göstermektedir (Şekil 4C). Aynı şekilde, ölümcül olmayan ROS seviyeleri, saç folikülünün büyüme uyaranlarına yanıt vermek için refrakter olduğu bir faz olan ikinci koordineli telojen sırasında tıraştan sonra saç büyümesini güçlü bir şekilde destekler22,23, saç büyümesini uyarmak için yeni bileşiklerin ve / veya süreçlerin potansiyelini değerlendirmek için yeterli bir yol oluşturur. Özellikle, askorbik asit (AA) gibi antioksidan bileşiklerin kullanımı, hızlandırılmış saç büyümesi gösteren hayvan sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir azalmaya neden olur (Şekil 5B). Ek olarak, ciltteki DHF'nin floresan emisyonu ile ölçülen foto tedavilerden sonra ciltte ROS üretimi de antioksidan bileşikler tarafından önemli ölçüde azaltılır (Şekil 5C). Birlikte, bu sonuçlar, dokuda fizyolojik bir yanıt oluşturmak için PpIX bazlı fotoğraf tedavilerinden sonra ROS üretiminin kesinlikle gerekli olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Hem biyosentetik yolu kullanarak hücrelerde ve dokularda in situ ROS'un endojen fotodinamik üretiminin kontrollü olarak açılması için teorik arka plan. (A) Fotodinamik işlemler sırasında moleküler oksijen uyarımı ile sonuçlanan temel fotokimyasal reaksiyonların şematik gösterimi. Işığın uygun λ ile emilmesi üzerine, S0 temel durumundaki bir ışığa duyarlılaştırıcı molekül (PS), uyarılmış bir tekli durumS1'e geçiş yapar. Herhangi bir uyarılmış durum, enerjik olarak temel durumdan daha az tercih edildiğinden, molekül kısa bir süre sonra S0'a döner. Çoğu PS, S 1'den üçlü durum T1'e geçiş için yüksek bir kuantum verimliliğine sahiptir ve genellikle göreceli olarak uzun bir ömür ile karakterize edilir. Uyarılmış üçlü durumda aktive edilmiş PS, iki farklı yol aracılığıyla diğer moleküllerle reaksiyona girebilir. Tip I fotokimyasal reaksiyon, radikal türler oluşturmak için elektronların bitişik moleküllere aktarılmasıdır; bu radikallerin, süperoksit anyonu (•O2-), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (•OH) dahil olmak üzere ROS üretmek için moleküler oksijenle reaksiyona girmesi muhtemeldir. Tip II fotokimyasal reaksiyon, PDT'de kullanılan çoğu PS için baskın süreci temsil eder. Bu reaksiyon sırasında, enerjinin (elektronların değil) moleküler oksijene (temel durumdaki konfigürasyonu üçlü, 3O2 olan) transferi, radikal olmayan ancak oldukça reaktif singlet oksijenin (1O2) oluşumunu sağlar. Bu reaksiyonlar sırasında oluşan fotoürünler, sonunda hücre ölümüne neden olan veya potansiyel olarak hücre büyümesini uyarabilen oksidatif bir stresle sonuçlanan bir dizi biyokimyasal olayı tetikler. (B) 5-aminolevulinik asit (ALA), hem mitokondriyal hem de sitozolik hücresel bölmeleri içeren hem biyosentetik yolda doğal bir öncüdür. ALA sentaz enzim aktivitesi, bu yolun nihai ürünü olan serbest hemenin, glisin ve süksinil CoA'dan ALA sentezini inhibe ettiği bir negatif geri besleme kontrolü ile düzenlenir. Eksojen ALA veya türevi metil aminolevulinatın (mALA) uygulanması, düzenleyici geri bildirim sistemini atlar, böylece aşağı akış metabolitleri, özellikle protoporfirin IX (PpIX), hücrede ışığa duyarlılığa neden olan hücrede birikir. PpIX'e demir eklenmesinin katalizör enzimi olan ferroşelatazın hız sınırlayıcı özellikleri, bu endojen PS bileşiğinin birikimini teşvik eder. PBG = porfobilinojen. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: mALA ve kırmızı ışıkla fotodinamik tedavi, ciltte geçici ROS üretimini indükler. (A) Sırt derisinde mALA konu tedavisinden sonra endojen PpIX birikimi. Aynı hayvanda sol taraf kontrol olarak kullanıldı. (B) Sol panel: DHF-DA tarafından izlenen PpIX'e bağlı ROS (mALA+Light) üretimi. Sağ panel: sırt derisinde bağıl ROS üretiminin zaman seyri analizi; Her bir hayvanda mALA+Işığa karşı Işık bölgelerinin DHF-DA floresan emisyonunun nispi entegre yoğunluğu, ışınlamadan sonra farklı zamanlarda ölçüldü ve metodolojide açıklandığı gibi normalleştirildi. Ortalama ± SE temsil edildi (her zaman noktası için n = 4). (C) Kuyruk derisinde PpIX'in lokalizasyonu (floresan mikroskopi görüntüleri). (D) Saç folikülünün şişkin bölgesinde artmış ve sürekli bir birikim gösteren hET ile ortaya çıkan mALA + Işıktan sonra kuyruk derisinde ROS üretimi. Temsili konfokal mikroskopi görüntüleri (maksimum projeksiyonlar) gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deride in situ ROS üretiminin açılması, saç folikülü nişinin şişkin bölgesinde kök hücrelerin önemli ölçüde artmasını sağlar. Sol paneller: PpIX bazlı fototerapilerden 2 gün sonra fare kuyruğu derisi tüm yuvalarında BrdU etiket tutucu hücrelerin (LRC) lokalizasyonunu ve saç foliküllerinin şişkin bölgesinde LRC'nin belirgin artışını gösteren temsili konfokal mikroskopi görüntüleri (maksimum projeksiyonlar). Sağ panel: saç folikülü çıkıntı bölgesindeki LRC sayısının ölçülmesi. Ortalama + SE (n = 4) temsil edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deride in situ ROS üretiminin açılması yanık iyileşmesini hızlandırır. (A) Kontrol numunelerine kıyasla tedavi edilen hayvanlarda yanık yaralı bölgelerde mALA tarafından indüklenen PpIX üretimi. (B) mALA+Işıkla tedavi edilen ve kontrol edilen hayvanlarda yanık iyileştirici evrimi. (C) mALA+Işıkla tedavi edilen hayvanlarda hızlandırılmış yanık iyileşmesini gösteren yanmış alanların (sol panel) zaman seyri ölçümü; iyileşmemiş alanın ortalama + SE (n = 4) temsil edilir. Her iki zaman seyri eğrisi arasındaki istatistiksel farklılıkları gösteren eğri altı alan analizi (sağ panel) (p ≤ 0.06). Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Deride in situ ROS üretiminin açılması saç büyümesini uyarır. (A) Üst sıra: Işık kontrol bölgesi (sol taraf) ile karşılaştırıldığında refrakter telojen faz sırasında mALA+Light (dorsal derinin sağ tarafı) ile saç büyümesinin indüksiyonu. Alt sıra: Hem ciltte ROS üretimi hem de mALA+Light'ın neden olduğu saç büyümesinin hızlanması, askorbik asit (AA) antioksidan tedavisi ile inhibe edilir. (B) Antioksidan AA'nın yokluğunda veya varlığında kontrol bölgesine kıyasla mALA-PT'de hızlandırılmış saç büyümesi gösteren hayvanların yüzdesinin ölçülmesi (3 bağımsız deneyde n = 4). (C) MALA-PT (n = 4) sırasında AA tarafından indüklenen dorsal deride ROS üretim inhibisyonunun miktarının belirlenmesi. Her durumda, çubuklar ortalama + SE'yi temsil eder. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler üzerinde önemli bir ilerleme oluşturur ve dokuda/numunede kontrollü ve yerel ROS üretimine izin verir.
Aminolevulinat bazlı öncülerin, hücrelerin içinde PpIX birikimini teşvik etmek için fazla uygulandığı göz önüne alındığında, bu metodolojideki kritik bir adım, dokuda hasar eşiğinin altındaki ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için yeterli bir ışık dozunun oluşturulmasıdır, ancak güçlü bir uyarıcı etki gösterir. Şu anda, hücrelerde ve dokularda üretilen herhangi bir ROS tipinin tam miktarını doğrudan ölçmek için mevcut bir teknoloji yoktur. Metodolojimizde, belirli bir ışık dozu, üretilen ROS miktarı ve belirli bir biyolojik etki (örneğin, hücre ölümü veya hücre çoğalması) arasında doğrudan bir ilişki kurmak hala mümkün değildir. Bu nedenle, herhangi bir deneysel model için ışık dozu (akıcılık), her durum için tercih edilen nitel veya yarı nitel parametreler kullanılarak araştırmacı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Fare derisi söz konusu olduğunda, hücre ölümü ve doku hasarı ile önemli ve geçici bir proliferatif dalganın indüksiyonu arasında kolayca ölçülebilir bir geçiş seçiyoruz.
Burada sunulan metodolojinin, yanık iyileşmesi ve saç folikülü büyümesi dahil olmak üzere farklı süreçlerde cilt yenilenmesinin iyileştirilmesinde çok etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu gözlemler, tesadüfi veya kronik yanıkların ve yaraların tedavisi veya farklı patolojiler için kliniklerde bu teknolojinin terapötik uygulamalarının uygulanmasının önünü açmaktadır: cilt ve özellikle kusurlu bir kök hücre işleyişini içeren saç folikülü.
Bu çalışmada açıklanan prosedürlerin tüm ticari uygulamaları, EC, MIC ve JE tarafından yazılan ve ticari kullanım için Derma Innovate SL'ye lisanslanan bir CSIC-UAM patenti (EP2932967A1) ile korunmaktadır. JE ve JJM, Derma Innovate SL'de danışmanlık pozisyonuna sahiptir.
Bu çalışma, İspanya'dan Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1'den JE'ye) ve Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458'den JE'ye) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. EC, Atracción de Talento Investigador hibesi 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid ve UAM) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır