Method Article
Целью этого протокола является индуцирование транзиторной in vivo продукции нелетальных уровней активных форм кислорода (АФК) в коже мышей, что способствует дальнейшему развитию физиологических реакций в тканях.
В данной статье мы опишем протокол индуцирования переключаемой фотогенерации in vivo эндогенных активных форм кислорода (АФК) в коже мышей. Эта транзиторная продукция АФК in situ эффективно активирует пролиферацию клеток в нишах стволовых клеток и стимулирует регенерацию тканей, что сильно проявляется через ускорение процессов заживления ожогов и роста волосяных фолликулов. Протокол основан на регулируемом фотодинамическом лечении, которое обрабатывает ткань предшественниками эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX и далее облучает ткань красным светом при строго контролируемых физико-химических параметрах. В целом, этот протокол представляет собой интересный экспериментальный инструмент для анализа биологии АФК.
Активные формы кислорода (АФК) являются результатом химического восстановления молекулярного кислорода с образованием воды и включают синглетный кислород, супероксид-анион, перекись водорода и гидроксильный радикал 1,2,3. АФК имеют очень короткий срок службы из-за их чрезвычайно химически активной природы. У аэробных организмов АФК случайно образуются внутри клеток как основной побочный продукт аэробного дыхания (цепь переноса электронов) в митохондриях. Временное накопление высоких уровней АФК в клетке приводит к окислительному стрессу, который может спровоцировать необратимую инактивацию белков, липидов и сахаров и введение мутаций в молекулу ДНК 2,3,4,5. Постепенное накопление окислительных повреждений в клетках, тканях и целых организмах неуклонно возрастает с течением времени и связано с индукцией программ клеточной гибели, некоторыми патологиями и процессом старения 2,3,4,6.
Аэробные организмы неуклонно развивают эффективные молекулярные механизмы для борьбы с избыточным накоплением АФК в клетках и тканях. Эти механизмы включают членов семейства белков супероксиддисмутазы (СОД), которые катализируют радикальную дисмутацию супероксида в молекулярный кислород и перекись водорода, а также различные каталазы и пероксидазы, которые используют антиоксидантный пул (глутатион, НАДФН, пероксиредоксин, тиоредоксин 7,8) для катализа последующего превращения перекиси водорода в воду и молекулярный кислород.
Тем не менее, в нескольких отчетах подтверждается роль АФК в качестве ключевых компонентов молекулярных цепей, регулирующих важнейшие функции клеток, включая пролиферацию, дифференцировку и подвижность 2,3,4. Эта концепция также подтверждается первоначальной идентификацией и характеристикой специализированных механизмов, продуцирующих АФК в аэробных организмах, включая липоксигеназы, циклооксигеназы и НАДФН-оксидазы 9,10. В этом смысле АФК играют активную роль в развитии эмбрионов позвоночных 11,12,13, и ключевые роли этих молекул в регуляции специфических физиологических функций in vivo были описаны в различных экспериментальных системах, включая программу дифференцировки гемопоэтических предшественников у дрозофилы14, индукцию заживления у рыбок данио или регенерацию хвоста у головастиков Xenopus 15. У млекопитающих АФК участвуют в потенциале самообновления/дифференцировки нейральных стволовых клеток в нейросферной модели16 и в дерегуляции функции кишечных стволовых клеток во время инициации колоректального рака17. В коже передача сигналов АФК связана с эпидермальной дифференцировкой и регуляцией ниши стволовых клеток кожи и циклом роста волосяных фолликулов18,19.
С этой точки зрения, основным экспериментальным ограничением для определения физиологической роли АФК в биологических системах, как в нормальных, так и в патологических условиях, является отсутствие адекватных экспериментальных инструментов для индуцирования контролируемой продукции этих молекул в клетках и тканях, точно напоминающих их физиологическую продукцию в качестве вторичных сигнальных мессенджеров. В настоящее время большинство экспериментальных подходов предполагают введение экзогенных АФК, в основном в виде перекиси водорода. Недавно мы реализовали экспериментальный подход к включению транзиторной, нелетальной in vivo продукции эндогенных АФК в коже мышей, основанный на введении предшественников эндогенного фотосенсибилизатора протопорфирина IX (PpIX; например, аминолаэвулиновой кислоты или ее метилпроизводного метиламинолевулината) и последующем облучении образца красным светом для индуцирования in situ образования АФК из внутриклеточного молекулярного кислорода (рис. 1). Эта фотодинамическая процедура может быть эффективно использована для стимуляции резидентных ниш стволовых клеток, тем самым активируя регенеративные программы тканей19,20 и открывая путь для новых терапевтических методов в регенеративной медицине кожи. Здесь мы представляем подробное описание протокола, показывающее репрезентативные примеры стимуляции ниш стволовых клеток, измеряемой как увеличение количества долговременных клеток, удерживающих метку 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) в области выпуклости волосяного фолликула19,21, и последующей активации программ регенерации (ускорение роста волос и процессов заживления ожогов), индуцированных транзиторными, нелетальная продукция АФК в коже мышей линии C57Bl6.
Все процедуры по разведению мышей и экспериментам должны проводиться в соответствии с местным, национальным, международным законодательством и рекомендациями по экспериментам на животных.
1. Индукция роста волос, индукция ожога и идентификация долгосрочных BrdU LRC в эпителии кожи хвоста в целом
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 10-дневных или 7-недельных мышей C57BL/6, предпочтительно однопометников, для экспериментального дизайна, описанного ниже. Во всех экспериментальных процедурах животные обезболиваются ингаляцией 3% изофлурана или эвтаназией при вывихе шейки матки, как показано.
2. Индукция транзиторной продукции нелетальных уровней АФК в коже мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования транзиторной продукции нелетальных уровней АФК в коже мышей будет использоваться фотодинамическая обработка с использованием предшественника эндогенного фотосенсибилизатора PpIX, в данном случае метил-аминолевулината (mALA), и красного света.
3. Обнаружение АФК в коже
Местное введение предшественника мАЛК в кожу спины и хвоста мыши приводит к значительному накоплению PpIX во всей ткани и, что заметно, в волосяном фолликуле, о чем свидетельствует красновато-розовая флуоресценция этого соединения при возбуждении синим светом (407 нм) (рис. 2A,C). Последующее облучение обработанной ткани красным светом (636 нм) с флюенсом 2,5−4 Дж/см2 способствует преходящей продукции АФК в ткани, особенно в области выпуклости волосяного фолликула (рис. 2, Б, Г).
Включение нелетальной продукции АФК в коже мышей in vivo способствует значительному увеличению количества ЦУР, классифицируемых как соматические стволовые клетки, в области выпуклости волосяного фолликула через два дня после фотообработки (рис. 3, левые панели). Примечательно, что увеличение числа ЦУР носит временный характер и восстанавливается до нормального уровня через 6 дней после лечения (рис. 3, правая панель). Поскольку эта область является одной из основных ниш стволовых клеток в коже мышей, транзиторная индукция клеточной пролиферации в этой области в основном отражает функциональную активацию выпуклой ниши и резидентных программ пролиферации и дифференцировки стволовых клеток22,23.
АФК-зависимая активация выпуклой ниши волосяного фолликула также связана с физиологическими реакциями кожи. Таким образом, преходящая выработка АФК заметно ускоряет процесс заживления кожи после ожога2-й степени (рис. 4, А, Б). Количественная оценка постепенного уменьшения поврежденного/покрытого струпом участка кожи демонстрирует устойчивость и статистическую значимость процесса ускорения заживления ран, индуцированного PpIX-зависимой транзиторной продукцией АФК в тканях (рис. 4C). Точно так же нелетальные уровни АФК сильно способствуют росту волос после бритья во время второго скоординированного телогена (Рисунок 5А), фазы, во время которой волосяной фолликул рефрактерен к ответу на стимулы роста22,23, что представляет собой адекватный способ оценки потенциала новых соединений и/или процессов для стимуляции роста волос. Примечательно, что использование антиоксидантных соединений, таких как аскорбиновая кислота (АК), приводит к статистически значимому сокращению числа животных, демонстрирующих ускоренный рост шерсти (рисунок 5B). Кроме того, выработка АФК в коже после фотообработки, количественно определяемая флуоресцентным излучением DHF в коже, также значительно снижается за счет антиоксидантных соединений (рис. 5C). Вместе эти результаты показывают, что выработка АФК после фотообработки на основе PpIX строго необходима для того, чтобы вызвать физиологическую реакцию в тканях.
Рисунок 1: Теоретические основы контролируемого включения эндогенного фотодинамического производства АФК in situ в клетках и тканях с использованием гемового биосинтетического пути. (А) Схематическое изображение основных фотохимических реакций, приводящих к возбуждению молекулярного кислорода при фотодинамической обработке. При поглощении света с соответствующим λ молекула фотосенсибилизатора (ФС) в основном состоянииS0 претерпевает переход в возбужденное синглетное состояниеS1. Поскольку любое возбужденное состояние энергетически менее предпочтительно, чем основное состояние, молекула возвращается кS0 через короткий промежуток времени. Большинство ФС обладают высокой квантовой эффективностью при переходе из S1 в триплетное состояниеT1, обычно характеризующееся относительно длительным временем жизни. Активированный ФС в возбужденном триплетном состоянии может вступать в реакцию с другими молекулами по двум различным путям. Фотохимическая реакция I типа представляет собой перенос электронов на соседние молекулы с образованием радикальных частиц; эти радикалы, вероятно, вступают в реакцию с молекулярным кислородом с образованием АФК, включая супероксид-анион (•O2-), перекись водорода (H2O2) и гидроксильный радикал (•OH). Фотохимическая реакция II типа представляет собой доминирующий процесс для большинства ФС, используемых в ФДТ. Во время этой реакции передача энергии (не электронов) молекулярному кислороду (конфигурация которого в основном состоянии представляет собой триплет, 3O 2) приводит к образованию нерадикального, но высокореакционноспособного синглетного кислорода (1O2). Фотопродукты, образующиеся во время этих реакций, запускают каскад биохимических событий, приводящих к окислительному стрессу, который в конечном итоге вызывает гибель клеток или потенциально может стимулировать их рост. (B) 5-аминолевулиновая кислота (АЛК) является естественным предшественником в пути биосинтеза гема, который включает как митохондриальные, так и цитозольные клеточные компартменты. Активность фермента АЛК-синтазы регулируется контролем отрицательной обратной связи, посредством которого свободный гем, конечный продукт этого пути, ингибирует синтез АЛК из глицина и сукцинила КоА. Введение экзогенной АЛК или ее производного метиламинолевулината (мАЛК) обходит регуляторную систему обратной связи, так что последующие метаболиты, особенно протопорфирин IX (PpIX), накапливаются в клетке, индуцируя фотосенсибилизацию. Ограничения скорости феррохелатазы, фермента-катализатора вставки железа в PpIX, способствуют накоплению этого эндогенного соединения PS. ПБГ = порфобилиноген. Эта цифра была изменена из Carrasco et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фотодинамическая обработка мАЛК и красным светом индуцирует преходящую продукцию АФК в коже. (А) Накопление эндогенного PpIX после топического лечения мАЛК в коже спины. Левая сторона у того же животного использовалась в качестве контроля. (B) Левая панель: PpIX-зависимое производство АФК (mALA+Light), контролируемое DHF-DA. Правая панель: анализ динамики относительной продукции АФК в коже спины; относительная интегральная плотность флуоресцентного излучения DHF-DA областей mALA+Light versus Light у каждого животного была количественно определена в разное время после облучения и нормализована, как описано в методике. Представлено среднее ± SE (n = 4 для каждого момента времени). (C) Локализация PpIX в коже хвоста (изображения флуоресцентной микроскопии). (D) Выработка АФК в коже хвоста после mALA+Light, выявленная с помощью hET, показывает повышенное и устойчивое накопление в области выпуклости волосяного фолликула. Показаны репрезентативные изображения конфокальной микроскопии (максимальные проекции). Масштабная линейка = 100 мкм. Эта цифра была изменена из Carrasco et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Включение in situ продукции АФК в коже способствует значительному увеличению количества стволовых клеток в области выпуклости ниши волосяного фолликула. Слева панели: репрезентативные изображения конфокальной микроскопии (максимальные проекции), показывающие локализацию клеток, удерживающих метку BrdU (LRC) в цельных слоях кожи хвоста мыши, и явное увеличение LRC в области выпуклости волосяных фолликулов через 2 дня после фотообработки на основе PpIX. Правая панель: количественная оценка количества LRC в области выпячивания волосяного фолликула. Представлено среднее значение + SE (n = 4). Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра была изменена из Carrasco et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Включение in situ выработки АФК в коже ускоряет заживление ожогов. (A) Продукция PpIX, индуцированная мАЛК в областях, пострадавших от ожогов, у обработанных животных по сравнению с контрольными образцами. (B) Эволюция заживления ожогов у животных, обработанных mALA+Light, и контрольных животных. (C) Количественная оценка обожженных участков во времени (левая панель), показывающая ускоренное заживление ожогов у животных, получавших мALA+свет; представлено среднее значение + SE (n = 4) незажившего участка. Анализ площади под кривой (правая панель), демонстрирующий статистические различия между обеими кривыми временного хода (p ≤ 0,06). Эта цифра была изменена из Carrasco et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Включение in situ выработки АФК в коже стимулирует рост волос. (A) Верхний ряд: Индукция роста волос во время рефрактерной фазы телогена с помощью mALA+Light (правая сторона дорсальной кожи) по сравнению со световой контрольной областью (левая сторона). Нижний ряд: Как выработка АФК в коже, так и ускорение роста волос, вызванное mALA+Light, подавляются антиоксидантной терапией аскорбиновой кислотой (АК). (B) Количественная оценка процента животных, у которых наблюдался ускоренный рост волос в mALA-PT по сравнению с контрольной областью в отсутствие или в присутствии антиоксиданта AA (n = 4 в 3 независимых экспериментах). (C) Количественная оценка ингибирования продукции АФК в дорсальной коже, индуцированного АА во время mALA-PT (n = 4). Во всех случаях столбцы представляют собой среднее значение + SE. Эта цифра была изменена из Carrasco et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В данной работе мы представляем методологию, которая позволяет осуществлять транзиторную активацию продукции эндогенных АФК in vivo в коже мышей с физиологическими эффектами. Методика основана на фотодинамической процедуре индуцирования контролируемой и локальной стимуляции эндогенного фотосенсибилизатора PpIX (рис. 1B). Этот экспериментальный подход является интересным инструментом для изучения биологии АФК in vivo экспериментальных систем, представляя собой значительный шаг вперед по сравнению с методологиями, использующими внешние источники АФК (обычно перекись водорода) и позволяющим контролировать и локально производить АФК в ткани/образце.
Учитывая, что предшественники на основе аминолевулината вводятся в избытке, чтобы способствовать накоплению PpIX внутри клеток, критическим шагом в этой методологии является установление адекватной дозы света, чтобы индуцировать транзиторную продукцию уровней АФК в тканях ниже порога повреждения, но демонстрирующих сильный стимулирующий эффект. В настоящее время не существует доступных технологий, позволяющих напрямую количественно определить точное количество любого типа АФК, которое вырабатывается в клетках и тканях. В нашей методологии до сих пор невозможно установить прямую корреляцию между данной дозой света, точным количеством производимых АФК и данным биологическим эффектом (например, гибелью клеток или пролиферацией клеток). По этой причине доза света (флюенс) для любой конкретной экспериментальной модели должна быть установлена исследователем эмпирически, используя качественные или полукачественные параметры выбора для каждой ситуации. В случае с кожей мыши мы выбираем легко измеримый переход между гибелью клеток и повреждением тканей и индукцией значительной и преходящей пролиферативной волны.
Методология, представленная здесь, доказала свою высокую эффективность в улучшении регенерации кожи в различных процессах, включая заживление ожогов и рост волосяных фолликулов. Эти наблюдения прокладывают путь к внедрению терапевтического применения этой технологии в клиниках для лечения случайных или хронических ожогов и ран или различных патологий кожи и, в частности, волосяного фолликула, связанного с дефектным функционированием стволовых клеток.
Все коммерческие применения процедур, описанных в этой работе, защищены патентом CSIC-UAM (EP2932967A1), авторами которого являются EC, MIC и JE, и лицензированы Derma Innovate SL для коммерческого использования. JE и JJM являются консультантами в Derma Innovate SL.
Эта работа была поддержана грантами Министерства экономики и конкуренции (RTC-2014-2626-1 для JE) и Института Салуда Карлоса III (PI15/01458 для JE) Испании. ЕК получила поддержку гранта Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid и UAM).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены