Придаточные корни тополя, индуцированные возбудителями стеблевого рака: экспериментальная система для изучения биологии корней и процессов, связанных с реакцией на свет

В данной работе мы представляем протокол индуцирования образования придаточных корней (АР) через путь инокуляции грибкового патогена флоэмы или эпидермиса, который подходит для изучения биологии корней и физиологических процессов, связанных со световой реакцией у тополя.

Valsa sordida и Botryosphaeria dothidea являются двумя важнейшими некротрофными грибковыми патогенами, которые повреждают многие растения-хозяева, особенно виды рода Populus. Эти два грибковых патогена встречаются в основном в ветвях, стеблях и ветвях тополя, вызывая классические симптомы, такие как поражения язвой, отмирание полога и увядание. Инокуляция патогенов является наиболее эффективным способом изучения механизма заболевания растений. Помимо повреждений язвой вокруг мест прививки на стеблях, у видов тополей наблюдался новый феномен развития - обильные придаточные корни (AR) ярко-красного цвета, после прививки стеблевого патогена. В этом исследовании мы описали метод индуцирования ARs с использованием грибковых патогенов у тополей. Решающим этапом этого метода является посев возбудителя после манипуляции (флоэмы или эпидермиса) с опоясыванием. Вторым важным этапом является нанесение увлажняющего материала. По сравнению с увлажняющей манипуляцией с помощью парапленки, обертывание инокулированных участков полиэтиленовой полиэтиленовой (ПЭ) полиэтиленовой пленкой может дать красочные, многочисленные и прочные АР через 20 дней после опоясывания-инокуляции. Наконец, белые AR прорастали из инокулированных колец в стеблях тополя после обработки затенением (обертывания стеблей алюминиевой фольгой). Этот метод представляет собой новую экспериментальную систему для изучения развития корней и морфогенеза, которая имеет решающее значение для понимания биологии развития корней, морфогенеза и реакции на стресс от болезни. Кроме того, в сочетании с лечением затенением, это исследование может обеспечить удобную экспериментальную систему для изучения процессов, связанных со световой реакцией, например, биосинтеза флавоноидов, антоцианов или других связанных метаболитов, а также генов или транскрипционных факторов, участвующих в этих процессах.

Рак стебля тополя, вызванный некротрофными грибковыми патогенами, Valsa sordida и Botryosphaeria dothidea, являются двумя важнейшими болезнями деревьев в Северном Китае, которые нанесли серьезный ущерб развитию экологических и экономических плантаций тополей. Болезни тополя при раке всегда возникают на коре стволов и ветвей, в то время как язвы являются их типичными симптомами. После начала болезней расширяющиеся поражения афтозным стоматином прогрессировали во флоэме, камбии и ксилеме хозяев. Далее они влияли на транспорт усваиваемых продуктов и воды по сосудистой системе. Тем не менее, каким образом патогены рака препятствуют транспортировке флоэмы и ксилемы, остается неясным.

Для выявления механизмов транспортировки углеводов и воды в тополях, инфицированных возбудителями рака, нами были предложены методы опоясывания флоэмой или эпидермиса ^1,2, сочетающие в себе классические манипуляции с огородным поясом и метод инокуляции возбудителя (инокуляция с блокированием мицелия). Эти методы могут моделировать процесс заражения и закупорку воды и углеводов, вызванную патогенами афтозного стоматита.

Наше исследование показало, что грибковые патогены вызывают отмирание полога тополя, первоначально вызывая углеродное голодание, а не отказ гидравлики^. Удивительно, но мы наблюдали особый ризогенез на стеблях тополя, который был связан с инокуляцией возбудителей стеблевого рака: обильные красные придаточные корни (ARs) растут из нижнего конца верхних стеблей (напротив верхнего края флоэмы или опоясывающих колец эпидермиса). Более того, наши эксперименты показали, что продукция АР является универсальной при взаимодействии патогенов тополя и рака. Они могут быть получены из видов тополей или клонов в разном возрасте (1, 2 или даже 6 лет) и могут быть индуцированы различными патогенами рака (V. sordida и B. dothidea) или их изолятами. Кроме того, мы изучили механизмы окраски тополиных ARs, и результаты показали, что он связан с биосинтезом флавоноидов и антоцианов, а также с регуляцией экспрессии генов, связанных со светом генов (или генных модулей) в условиях освещения⁶. Таким образом, эти АР тополя, индуцированные патогенами, могут быть использованы в качестве стабильной и идеальной экспериментальной системы для изучения взаимодействия растений и патогенов, биологии корней, а также функции и экспрессии генов, связанных со светом.

В этом исследовании мы представим и предоставим протокол для создания экспериментальной системы ARs тополя с помощью опоясывающего пути инокуляции; кроме того, мы указываем на важнейшие факторы, влияющие на образование АР, и подробно останавливаемся на потенциальном применении опоясывающей инокуляции в изучении биологии корней тополя и других физиологических процессов, связанных с реакцией на свет.

1. Индукция АР тополя путем опоясывающей инокуляции

1. Культура возбудителя грибкового рака
   1. Растворите 6 г картофельного экстракта, 20 г декстрозы и 20 г агара в 1000 мл воды для приготовления среды картофельного агара декстрозы (PDA). Стерилизуйте среду при температуре 121,1 °C в течение 30 минут и разлейте среду в чашки Петри (диаметром 9 см), каждая чашка содержит около 20 мл среды PDA.
   2. Инокулируйте активированный куб мицелия гриба (~0,5 см) в центр чашки Петри PDA.
   3. Инкубируйте инокулированные планшеты PDA в темноте при температуре 28 °C в течение 7-10 дней.
   4. Инкубированную среду КПК с грибковым мицелием разрезать на ремни (1,2 см в ширину; около 3-6 см в длину).
2. Заготовка материалов из тополя
   1. Выберите 1-2-летние, сильнорастущие саженцы тополя.
   2. Выбирайте зрелые стебли/ветви саженцев тополя (1-2 см в диаметре, без болезней и заражения вредителями).
   3. Промойте места прививки (около 30 см над землей или основанием ветвей) стеблей/ветвей тополя; Стерилизуйте стебли/ветви 75% спиртовым раствором.
3. Индукция АР с помощью флоэмного опоясывания-инокуляции
   1. Тщательно опоясайте эпидермис и флоэму стерилизованных стеблей/ветвей тополя, удалите опоясанные кольца флоэмы (шириной 1 см, включая частичный камбий) и обнажите белые внутренние ткани камбия/ксилемы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.2-1.3.4 подробно описывают альтернативные методы инокуляции.
   2. Полностью покройте область опоясывания ремнями мицелия (шириной 1,2 см) в качестве флоэмного опоясывающего инокуляционного лечения (ОФ). Гифы гриба обращены к обнаженной ксилеме.
   3. Соскребите и повредите обнаженную внутреннюю ткань камбия стерилизованными ножами, а затем привите ремни PDA (шириной 1,2 см) на области опоясывания в качестве процедуры удаления камбия (GR).
   4. Опоясывайте участки непосредственно некультивированными лентами PDA среднего размера (шириной 1,2 см) в качестве контрольного опоясывающего материала (GC).
   5. Оберните привитые стебли/ветви эластичной, бесцветной и прозрачной прививочной лентой (или полиэтиленовой пленкой). Оберните 4 слоя, чтобы сохранить влагу.
   6. Привяжите привитые стебли/ветки (металлическими, пластиковыми или деревянными) палками (более 50 см), чтобы защитить их от бурелома.
   7. В ходе эксперимента культивируйте опоясанные тополиные материалы с регулярным поливом.
   8. Наблюдайте со стороны и фиксируйте образование тополиных AR через 14-30 дней после прививки.
4. Индукция АР через эпидермис, опоясывание-инокуляция
   1. Выберите и подготовьте инокулированные материалы, как описано в шаге 1.2.
   2. Аккуратно опоясайте эпидермис стеблей/ветвей тополя.
   3. Удалите кольца эпидермиса (1,0 см в ширину) и обнажите зеленую ткань флоэмы.
   4. Слегка и вертикально соскребите ткань флоэмы четыре раза и обнажите внутреннюю структуру флоэмы.
   5. Прививайте опоясанную область эпидермиса с помощью мицелия гриба (eGP) и ремней PDA (eGC). Выполните инокуляционные манипуляции, аналогичные шагам 1.3.2-1.3.4.
   6. Оберните привитые стебли прививочной лентой (или полиэтиленовой пленкой), как описано в пункте 1.3.5.
   7. Управляйте тополями и наблюдайте за AR, как описано в шагах 1.3.6-1.3.8.

2. Создание экспериментальной системы для исследования световых генов методом опоясывающей инокуляции

1. Индуцировать АР тополя с помощью метода опоясывания флоэмы (шаги 1.3.2-1.3.4).
2. В качестве альтернативы можно индуцировать АР тополя, используя метод опоясывающей эпидермиса инокуляции, как описано в шаге 1.4.5.
3. Оберните инокулированные патогенами участки стеблей/ветвей тополя (15 см в высоту) алюминиевой фольгой (обработка от затенения, S) или без пленки из алюминиевой фольги (световая обработка, L).
4. Подвяжите стебли/ветви к палкам длиной >50 см, чтобы защитить их от буреломов. Регулярно выращивайте тополя и ухаживайте за ними, а также поддерживайте их в хорошем орошении во время эксперимента, как описано в шагах 1.3.6-1.3.7.
5. Удалите алюминиевую фольгу со стеблей через ~20 дней после прививки.
6. Немедленно осмотрите и сфотографируйте закрашенные (S) и незакрашенные тополя из алюминиевой фольги ARs (L).
7. Выращивайте затененные тополя AR при солнечном свете или других искусственных источниках света/условиях.
8. Снимите прививочные ленты (или полиэтиленовые пленки) и соберите АР тополя через 1-5 дней после воздействия света.
9. Оберните все AR образцы алюминиевой фольгой. Для тополиных AR, подвергшихся обработке затенением, образцы собирают в темноте.
10. Замочите образцы АР в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C для дальнейшего исследования.
11. Соберите освещенные или неэкспонированные АР тополя (проводимые в темноте) после обертывания их алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C для морфологических и других анализов in situ .

На рисунке 1 показан рабочий процесс возбудителей стеблевого рака, вызывающих придаточные корни с помощью опоясывающей инокуляции. Проведенные здесь эксперименты показали, что как возбудители стеблевого рака, V. sordida, B. dothidea, так и их изоляты (из разных хозяев, регионов или патогенности) могут индуцировать образование АР у видов тополей. В этом протоколе мы использовали изолят V. sordida CZC, CFCC86775, а B. dothidea изоляты SD50 и SD81 для получения АР у P. alba var. pyramidalis. В содида CZC является типичным используемым патогеном и был депонирован в Китайском центре сбора общих микробиологических культур (CGMCC 40575); V. sordida isolate CFCC86775 был приобретен в Китайском центре сбора лесных культур, в то время как два изолята SD были собраны с тополей в провинции Шаньдун и переданы на хранение в нашу лабораторию. Как показано на Рисунке 2, каллус образовался в области опоясывания (Рисунок 2А, панель 1), и несколько АР образовались при обработке позолотой и удалением камбия (Рисунок 2А, панель 2), в то время как красные, обильные волокнистые корни образовались после обработки опоясыванием флоэмами (Рисунок 2А, панели 3-6). Мы также отметили, что ARs индуцировались у различных видов или клонов тополей, таких как P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3' или других гибридных тополей). Однако в этом протоколе AR образуются только на стеблях 1-летнего P. alba var. pyramidalis. Наконец, как показано на рисунке 2 на рисунке 7, структуры ARs также индуцировались в стволах 6-летнего P. alba var. pyramidalis после опоясывающей флоэмами инокуляции патогеном V. sordida. Диаметр ствола тополя составляет около 6-7 см, а длина самых длинных мочковатых корней была длиннее 7,0 см.

Как показано на рисунке 2, красные сегменты были получены в затеняющих тополях после воздействия солнечного света, от белых молочных или светло-красных AR, полученных на тополях, обернутых алюминиевой фольгой (Рисунок 2B, панель 1), до красных AR через 3 дня (Рисунок 2B, панель 4). Более того, мы также заметили, что красные пигменты образуются в течение короткого периода времени после воздействия света, и анализ экспрессии генов показал, что биосинтез пигментов (в основном цианидин-3-О-глюкозид) происходит непосредственно из их антоцианидиновых субстратов, а не биосинтез de new с начала метаболического пути фенилпропана⁶.

В этом протоколе оба метода опоясывания (флоэма и опоясывание эпидермиса) могут вызывать образование АР на стеблях тополя после инокуляции патогена. Наблюдалось меньшее количество ветрозащитных полос и меньшее влияние на физиологию (например, на перенос воды и углеводов) у тополей, опоясанных эпидермисом; однако, кажется, что производство AR немного быстро и эффективно при опоясывании флоэмы. Поэтому при исследовании АР тополя рекомендуется метод опоясывания флоэмой.

Рисунок 1: Схематический процесс образования придаточных корней (АР), индуцированных возбудителем стеблевого рака с помощью методов опоясывающей инокуляции тополей. Сначала возбудитель стеблевого рака (культивировавшийся при температуре 28 °C в темноте в течение 7-10 дней) разрезали на полоски мицелия (шириной 1,2 см). Однолетние саженцы тополя или однолетние ветви опоясывались на стеблях (на высоте ~30 см над землей или основанием ветвей, обозначенных синими стрелками) двумя методами: опоясыванием флоэм (опоясывание и отбрасывание опоясанных колец, которые включали эпидермис, флоэму и частичные ткани камбия на стеблях) или опоясыванием эпидермиса (опоясывание и отбрасывание опоясанных колец, которые включают только эпидермис стеблей). Ширина опоясанных флоэм или флоэмных колец составляет 1,0 см. Затем опоясанные участки были полностью покрыты ремнями мицелия и немедленно обмотаны полиэтиленовой пластиковой лентой; Мицелиевые стороны ремня были обращены к опоясанному участку. Для исследования биологии корней, таких как ризогенез и развитие корней, привитые саженцы/ветви тополя культивировались в течение 14-30 дней под обычным управлением (путь I, выделен желтыми стрелками). Для исследования биосинтеза сегментов, фотоморфогенеза или регуляции экспрессии генов, связанных со светом, была применена дополнительная упаковка из алюминиевой фольги, затем инокулированные саженцы/ветки культивировались ~20 дней для получения ARs. Когда AR были изготовлены, алюминиевая фольга была удалена со стеблей/ветвей, а AR тополя подвергались воздействию солнечного света или других условий освещения (различающихся по спектру света, интенсивности, периоду или их сочетанию) (Путь II, выделен красными стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Патогены стеблевого рака индуцировали образование придаточных корней (АР) и биосинтез сегментов в световых условиях АР у тополя. (A) Различные патогены стеблевого рака индуцируют образование АР в стеблях тополя. A1: контроль опоясывания; А2: опоясывание и удаление камбия (GR); А3-6: Различные патогены ракообразного стоматита (V. sordida и B. dothidea) вызывают образование AR у 1-летних саженцев P. alba var. pyramidalis ; О7: ARs получены на ветке 6-летнего P. alba var. pyramidalis. (В) Воздействие света индуцирует биосинтез сегментов на тополиных АР. B1-B4 представляют тополиные AR, подвергшиеся воздействию в световых условиях через 0, 1, 2 и 3 дня после воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Виды тополей склонны производить AR или боковые корни (LR) из стеблевых черенков, что способствует их размножению и является моделью для изучения биологии корней у древесных растений ^7,8. Более того, исследования показали, что инокуляция конкретных микроорганизмов, таких как полезные бактерии (Agrobacterium rhizogenes ^9,10; Ризобактерии, способствующие росту растений [PGPR]¹¹), эндофиты, бактерии^12,13, арбускулярные микоризные грибы (AMF)^14,15 или эктомикоризные грибы (EMF)^16,17 могут способствовать росту или развитию корней растений. Тем не менее, не сообщалось о патогенах (ни бактериях, ни грибковых патогенах), которые индуцируют или способствуют развитию структуры ARs на растениях-хозяевах.

Проведенные здесь эксперименты показали, что различные патогены рака тополя (такие как V. sordida, B. dothidea) могут вызывать образование AR в стеблях/ветвях тополя (рис. 2A, панели 3-6). Кроме того, эксперименты показали, что AR могут быть индуцированы на различных видах/клонах тополей, например, на 1-2-летних саженцах P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3' и даже на 6-летних ветвях тополя (рис. 2A, панель 7). Тем не менее, структура ARs не была получена на 1-летних саженцах/ветвях Malus spp., Prunus spp., Cedrus deodara и Pinus massoniana. Затем этот протокол обеспечил новый путь производства АР тополя: индуцирование АР путем опоясывающей инокуляции возбудителей грибкового рака деревьев (V. sordida и B. dothidea) на стеблях/ветвях тополя.

Эксперименты также показали, что оба метода опоясывания флоэмой и эпидермиса могут вызывать образование АР на стеблях тополя после инокуляции патогена; Тем не менее, стебли тополя после опоясывающей флоэмы прививки легко поддаются ветровой обработке в местах опоясывания, что приводит к значительному снижению ударной вязкости, вызванному манипуляциями с опоясыванием и удалением коры (флоэмы), а также инвазии патогенных микроорганизмов. Поэтому для индукции АР стебли/ветви тополя должны быть хорошо привязаны к палкам, чтобы предотвратить их поломку, особенно при использовании метода опоясывания флоэмой.

Сами растения в основном определяют образование АР. Однако на него также влияют некоторые факторы окружающей среды. Например, АР могут индуцироваться в условиях заболачивания или затопления у некоторых видов двудольных^18,19. Сохранение влаги было решающим этапом индукции АР на надземных стеблях/ветвях. В этом протоколе для сохранения влаги использовались как парапленка, так и бытовая полиэтиленовая пленка. Тем не менее, обертка парапленки может быть пронизана вновь образовавшимися АР, что приводит к потере воды, задержке роста, потемнению и одревеснению АР тополя. Напротив, в стеблях тополя, обернутых полиэтиленом, были собраны обильные, нежные и богатые водой АР. Поэтому в данном протоколе была рекомендована бытовая полиэтиленовая пленка, а не пленка Parafilm.

Корни являются важнейшими органами растений, играющими важную роль в размножении, росте, питательных веществах и поглощении воды растениями. Затем эти методы должны быть использованы при изучении ризогенеза20, морфологии и развития, а также архитектуры корневой системы (RSA)²¹ у видов тополя. Кроме того, исследования показали, что связь между корневой системой и ризосферными бактериями может повысить устойчивость растений-хозяев к болезням²²; Затем инокуляция патогенов опоясывающего рака должна вызвать некоторые молекулярные и эпигенетические изменения в АР тополя, которые могут найти применение при выращивании устойчивых к болезням саженцев.

Свет является важнейшим фактором окружающей среды, влияющим на рост, развитие и размножение растений. Эксперимент по затенению-воздействию (рис. 2В) показал, что индуцированные патогенами тополя ARs являются идеальной экспериментальной системой для биосинтеза сегментов растений (флавоноидов, антоцианов²³ и т.д.). Предыдущие исследования также показали, что условия освещения (интенсивность, качество, продолжительность и количество, подвергаемое родительскому растению) влияют на формирование корней или ризогенез и развитие как придаточных, так и боковых корней 24,25,26. Таким образом, благодаря тонкой настройке условий освещения, патогенно-индуцированная система ARs тополя в этом протоколе может быть использована в исследовании биологии корней и других процессов, связанных со светореакцией растений тополя.

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование было совместно профинансировано Центральным общественным научным учреждением «Фонд базальных исследований» Государственной ключевой лаборатории генетики и селекции деревьев (грант No CAFYBB2020ZY001-2) и Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32171776) для Цзяпин Чжао.