Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a produção de raízes adventícias (ARs) através da via de inoculação de patógenos floemáticos ou epiderme-cintura, que é adequado para o estudo da biologia radicular e dos processos fisiológicos relacionados à resposta à luz em choupo.

Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea são dois patógenos fúngicos necrotróficos cruciais que danificam muitas plantas hospedeiras, particularmente espécies do gênero Populus. Esses dois patógenos fúngicos ocorrem principalmente em galhos, caules e galhos de choupo, causando sintomas clássicos, como lesões de cancro, morte do dossel e murcha. A inoculação de patógenos é o caminho mais eficiente para estudar o mecanismo da doença das plantas. Além das lesões de cancro ao redor dos locais de inoculação nos caules, um novo fenômeno de desenvolvimento, raízes adventícias abundantes (ARs) com cor vermelha brilhante, foi observado em espécies de choupo após inoculações do patógeno do cancro do caule. Neste estudo, descrevemos o método para induzir ARs usando patógenos fúngicos em choupos. A etapa crucial deste método é a inoculação do patógeno após a manipulação do anelamento (floema ou epiderme). O segundo passo crucial é a aplicação do material hidratante. Em comparação com a manipulação hidratante com Parafilm, o envolvimento dos locais inoculados com filme plástico doméstico de polietileno (PE) pode produzir ARs coloridos, numerosos e robustos em 20 dias após a inoculação do anelamento. Finalmente, ARs brancos brotaram dos anéis inoculados nas hastes de choupo após o tratamento de sombreamento (envolvendo as hastes com papel alumínio). Este método introduz um novo sistema experimental para estudar o desenvolvimento e a morfogênese radicular, que é crucial para a compreensão da biologia do desenvolvimento radicular, morfogênese e resposta sob estresse da doença. Além disso, quando combinado com o tratamento de sombreamento, este estudo pode fornecer um sistema experimental conveniente para investigar processos relacionados à resposta à luz, por exemplo, a biossíntese de flavonóides, antocianinas ou outros metabólitos relacionados e genes ou fatores de transcrição envolvidos nesses processos.

As doenças do cancro do caule do choupo causadas por patógenos fúngicos necrotróficos, Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea, são as duas doenças cruciais das árvores no norte da China que prejudicaram severamente o desenvolvimento de plantações ecológicas e econômicas de espécies de choupo. As doenças do cancro do choupo sempre ocorrem na casca dos troncos e galhos, enquanto as lesões do cancro são seus sintomas típicos. Após o início das doenças, as lesões de cancro em expansão danificaram progressivamente o floema, o câmbio e o xilema dos hospedeiros. Além disso, eles afetaram o transporte de produtos assimilados e água através do sistema vascular. No entanto, como os patógenos do cancro impedem o transporte do floema e do xilema ainda não está claro.

Para revelar os mecanismos de transporte de carboidratos e água em choupos infectados por patógenos do cancro, propusemos os métodos de inoculação do floema ou da epiderme ^1,2, que combinaram a manipulação clássica da cintura de jardim e o método de inoculação do patógeno (inoculação do bloqueio do micélio). Esses métodos podem simular o processo de infestação e o bloqueio de água e carboidratos induzido por patógenos do cancro.

Nossa pesquisa ilustrou que os patógenos fúngicos causaram a morte do dossel do choupo, induzindo inicialmente a falta de carbono, não a falha hidráulica 1,3,4,5. Surpreendentemente, observamos uma rizogênese especial em caules de choupo que foram associados à inoculação de patógenos do cancro do caule: raízes adventícias vermelhas abundantes (ARs) crescem a partir da extremidade inferior dos caules superiores (oposta à borda superior do floema ou anéis de anelamento da epiderme). Além disso, nossos experimentos ilustraram que a produção de ARs é universal na interação patógeno choupo-cancro. Eles podem ser produzidos a partir de tipos de espécies de choupo ou clones em diferentes idades (1, 2 ou até 6 anos de idade) e podem ser induzidos por diferentes patógenos do cancro (V. sordida e B. dothidea) ou seus isolados. Além disso, estudamos os mecanismos de cor dos ARs de choupo, e os resultados mostraram que ela está associada à biossíntese de flavonóides e antocianinas, bem como à regulação da expressão gênica de genes relacionados à luz (ou módulos gênicos) sob condições de iluminação⁶. Portanto, esses ARs de choupo induzidos por patógenos podem ser usados como um sistema experimental estável e ideal para o estudo da interação planta-patógeno, biologia radicular e a função e expressão de genes relacionados à luz.

Neste estudo, apresentaremos e forneceremos o protocolo para estabelecer um sistema experimental de ARs de álamo por meio da via de inoculação de anel; além disso, apontamos os fatores cruciais que afetam a formação de ARs e expomos a aplicação potencial da inoculação de anelamento no estudo da biologia da raiz do choupo e outros processos fisiológicos relacionados à resposta à luz.

1. Indução de ARs de choupo por meio de inoculação de anelamento

1. Cultura do patógeno do cancro fúngico
   1. Dissolva 6 g de extrato de batata, 20 g de dextrose e 20 g de ágar em 1000 mL de água para preparar o meio de ágar dextrose de batata (PDA). Esterilizar o meio a 121,1 °C durante 30 min e deitar o meio em placas de Petri (9 cm de diâmetro), cada placa contendo cerca de 20 ml de meio PDA.
   2. Inocular o cubo de micélio fúngico ativado (~0,5 cm) no centro da placa de Petri PDA.
   3. Incubar as placas de PDA inoculadas no escuro a 28 °C durante 7-10 dias.
   4. Corte o meio PDA incubado com micélio fúngico em tiras (1,2 cm de largura; cerca de 3-6 cm de comprimento).
2. Preparação de materiais de choupo
   1. Selecione mudas de choupo de crescimento vigoroso de 1-2 anos.
   2. Selecione caules/ramos maduros de mudas de choupo (1-2 cm de diâmetro, livres de doenças e infestação de pragas).
   3. Lave as regiões de inoculação (cerca de 30 cm de altura acima do solo ou da base dos ramos) dos caules/ramos do choupo; Esterilize os caules/galhos com solução alcoólica a 75%.
3. Indução de ARs por meio de inoculação de anelamento de floema
   1. Circundifique cuidadosamente a epiderme e o floema dos caules/ramos esterilizados do choupo, remova os anéis do floema cingidos (1 cm de largura, incluindo o câmbio parcial) e exponha os tecidos brancos internos do câmbio/xilema.
      NOTA: As etapas 1.3.2-1.3.4 detalham métodos alternativos de inoculação.
   2. Cubra completamente a região do anelamento com tiras de micélio (1,2 cm de largura) como tratamento de inoculação do anelamento do floema (GP). As hifas fúngicas estão voltadas para o xilema exposto.
   3. Raspe e danifique o tecido interno exposto do câmbio com facas esterilizadas e, em seguida, inocule as tiras de PDA (1,2 cm de largura) nas regiões de anelamento como tratamento de remoção de câmbio (GR).
   4. Inocular as regiões de anelamento directamente com as tiras médias de BDA não cultivadas (1,2 cm de largura) como controlo de anelamento (GC).
   5. Enrole os caules/galhos inoculados com fita adesiva elástica, incolor e transparente (ou filme plástico PE). Enrole 4 camadas para manter a umidade.
   6. Amarre os caules/galhos inoculados com palitos (de metal, plástico ou lenhosos) (mais de 50 cm) para evitar quebra-vento.
   7. Cultive os materiais de choupo cingidos com irrigação regular durante o experimento.
   8. Observe de fora e registre a formação de ARs de choupo 14-30 dias após a inoculação.
4. Indução de ARs por meio de anelamento-inoculação de epiderme
   1. Selecionar e preparar os materiais inoculados conforme descrito na etapa 1.2.
   2. Circundilite cuidadosamente a epiderme dos caules/ramos do choupo.
   3. Remova os anéis da epiderme (1,0 cm de largura) e exponha o tecido verde do floema.
   4. Raspe leve e verticalmente o tecido do floema quatro vezes e exponha a estrutura interna do floema.
   5. Inocular a região da epiderme circuncidada com o micélio fúngico (eGP) e tiras de PDA (eGC). Execute manipulações de inoculação semelhantes às etapas 1.3.2-1.3.4.
   6. Envolva as hastes inoculadas com fita adesiva (ou filme plástico PE) conforme descrito na etapa 1.3.5.
   7. Gerencie choupos e observe ARs conforme descrito nas etapas 1.3.6-1.3.8.

2. Estabelecimento de um sistema experimental para a pesquisa de genes relacionados à luz através do método de inoculação de anelamento

1. Induza ARs de choupo usando o método de inoculação de anelamento de floema (etapas 1.3.2-1.3.4).
2. Em alternativa, induzir ARs de choupo utilizando o método de inoculação do anelamento da epiderme, conforme descrito no passo 1.4.5.
3. Envolva as regiões inoculadas com patógenos de caules/galhos de choupo (15 cm de altura) com papel alumínio (tratamento de sombreamento, S) ou sem papel alumínio (tratamento de iluminação, L).
4. Amarre os caules/galhos em palitos de >50 cm de comprimento para mantê-los longe do quebra-vento. Cultive e gerencie os choupos regularmente e mantenha-os bem irrigados durante o experimento, conforme descrito nas etapas 1.3.6 a 1.3.7.
5. Remova a folha de alumínio das hastes ~ 20 dias após a inoculação.
6. Observe e fotografe os ARs de folha de alumínio sombreados (S) e não sombreados (L) imediatamente.
7. Cultive os ARs de choupo sombreados à luz do sol ou outras fontes/condições de luz artificial.
8. Remova as fitas de enxerto (ou filmes plásticos de PE) e colha os ARs de choupo em 1-5 dias após a exposição à luz.
9. Embrulhe todas as amostras de AR com papel alumínio. Para os ARs de choupo submetidos ao tratamento de sombreamento, colha as amostras no escuro.
10. Mergulhe as amostras de AR em nitrogênio líquido e armazene-as a -80 ° C para investigação posterior.
11. Colha os ARs de choupo expostos ou não expostos à luz (conduzidos no escuro) depois de envolvê-los com papel alumínio e armazene-os a 4 ° C para ensaios morfológicos e outros ensaios in situ .

O fluxo de trabalho dos patógenos do cancro do caule que induzem raízes adventícias por meio da inoculação do anelamento é mostrado na Figura 1. Os experimentos aqui conduzidos mostraram que ambos os patógenos do cancro do caule, V. sordida, B. dothidea, e seus isolados (de diferentes hospedeiros, regiões ou patogenicidade) podem induzir a formação de ARs em espécies de choupo. Neste protocolo, usamos isolados de V. sordida CZC, CFCC86775 e B. dothidea SD50 e SD81 para produzir ARs em P. alba var. V sodida O CZC é um patógeno típico usado e foi depositado no Centro Geral de Coleta de Culturas Microbiológicas da China (CGMCC 40575); Isolado de V. sordida CFCC86775 foi comprado do Centro de Coleta de Cultura Florestal da China, enquanto dois isolados de SD foram coletados do choupo da doença do cancro na província de Shandong e depositados em nosso laboratório. Conforme mostrado na Figura 2, calos formados na região de anelamento (Figura 2A, painel 1) e poucos ARs formados no tratamento de douramento e remoção do câmbio (Figura 2A, painel 2), enquanto raízes fibrosas vermelhas e abundantes foram produzidas após o tratamento de inoculação do floema (Figura 2A, painéis 3-6). Observamos também que os ARs foram induzidos em diferentes espécies ou clones de choupo, como P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', ou outros choupos híbridos). No entanto, neste protocolo, os ARs são produzidos apenas nos caules de P. alba var. pyramidalis de 1 ano de idade. Finalmente, como mostrado na Figura 2 , painel 7, estruturas de ARs também foram induzidas nos troncos de P. alba var. pyramidalis de 6 anos de idade após inoculação do floema pelo patógeno V. sordida. Os diâmetros do tronco do choupo são de cerca de 6-7 cm e o comprimento das raízes fibrosas mais longas foi superior a 7,0 cm.

Conforme mostrado na Figura 2, os segmentos vermelhos foram produzidos nos ARs de choupo de sombreamento após serem expostos à condição de luz solar, de ARs brancos leitosos ou vermelhos claros produzidos nos choupos embrulhados em papel alumínio (Figura 2B, painel 1) para os ARs vermelhos 3 dias depois (Figura 2B, painel 4). Além disso, também notamos que os pigmentos vermelhos foram produzidos em um curto período após a exposição à luz, e a análise da expressão gênica ilustrou que a biossíntese de pigmentos (principalmente cianidina-3-O-glicosídeo) foi transformada diretamente de seus substratos antocianidina, não a biossíntese inovadora desde o início da via metabólica do fenilpropano⁶.

Neste protocolo, ambos os dois métodos de anelamento (anelamento do floema e da epiderme) podem induzir a formação de ARs nos caules do choupo após a inoculação do patógeno. Ocorreram menos quebra-ventos e menor influência na fisiologia (como transporte de água e carboidratos) em choupos inoculados com anelamento de epiderme; no entanto, parece que a produção de ARs é um pouco rápida e eficiente no anelamento do floema. Portanto, o método de inoculação de anelamento de floema é recomendado na pesquisa de ARs de choupo.

Figura 1: O fluxo de trabalho esquemático da formação de raízes adventícias (ARs) induzida pelo patógeno do cancro do caule por meio de métodos de inoculação de anelamento em choupos. Em primeiro lugar, o patógeno do cancro do caule (cultivado a 28 ° C no escuro por 7 a 10 dias) foi cortado em tiras de micélio (1,2 cm de largura). Mudas de choupo de um ano de idade ou ramos de um ano de idade foram cingidos nas hastes (a ~ 30 cm acima do solo ou da base dos ramos, indicado pelas setas azuis) por meio de dois métodos: anelamento do floema (anelamento e descarte dos anéis cingidos que incluem epiderme, floema e tecidos parciais do câmbio nas hastes) ou anelamento da epiderme (anelamento e descarte dos anéis cingidos que incluem apenas a epiderme das hastes). A largura do floema circunçado ou anéis do floema é de 1,0 cm. Em seguida, as regiões cingidas foram cobertas inteiramente com tiras de micélio e envoltas com fita plástica PE imediatamente; os lados do micélio da cinta estavam voltados para a região cingida. Para a pesquisa da biologia radicular, como rizogênese e desenvolvimento radicular, as mudas/ramos de choupo inoculados foram cultivadas por 14-30 dias sob manejo regular (Via I, destacada em setas amarelas). Para a pesquisa de biossíntese de segmentos, fotomorfogênese ou regulação da expressão dos genes relacionados à luz, foi adotado um invólucro adicional de papel alumínio e, em seguida, as mudas/galhos inoculados foram cultivados ~ 20 dias para produzir os ARs. Quando os ARs foram produzidos, a folha de alumínio foi removida dos caules/galhos e os ARs de choupo foram expostos à luz solar ou outra condição de luz (variada no espectro de luz, intensidade, período ou suas combinações) (Caminho II, destacado em setas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Os patógenos do cancro do caule induziram a formação de raízes adventícias (ARs) e a biossíntese de segmentos nas condições de luz dos ARs em choupo. (A) Diferentes patógenos do cancro do caule induzem a formação de AR em caules de choupo. A1: controle de anel; A2: anelamento e remoção do câmbio (GR); A3-6: Diferentes patógenos do cancro do caule (V. sordida e B. dothidea) induzem a formação de AR em mudas de P. alba var. pyramidalis de 1 ano de idade; A7: ARs produzidos no ramo de P. alba var. pyramidalis de 6 anos. (B) A exposição à luz induz a biossíntese de segmentos em ARs de choupo. B1-B4 representam ARs de choupo expostos em condições de luz em 0, 1, 2 e 3 dias após a exposição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As espécies de choupo são aptas a produzir ARs ou raízes laterais (LRs) a partir de estacas caulinares, o que contribui para sua reprodução e como modelo para o estudo da biologia radicular em plantas madeireiras ^7,8. Além disso, pesquisas indicaram que a inoculação de microrganismos específicos, como bactérias benéficas (Agrobacterium rhizogenes ^9,10; Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas [PGPR]¹¹), bactérias endófitas^12,13, fungos micorrízicos arbusculares (FMA)^14,15 ou fungos ectomicorrízicos (EMF)^16,17 podem promover o crescimento ou desenvolvimento das raízes das plantas. No entanto, nenhum relato sobre patógenos (nem bactérias nem patógenos fúngicos) que induzem ou promovem a estrutura dos ARs nas plantas hospedeiras foi relatado.

Os experimentos aqui mostraram que diferentes patógenos do cancro do choupo (como V. sordida, B. dothidea) podem induzir a formação de ARs em caules / galhos de choupo (Figura 2A, painéis 3-6). Além disso, experimentos mostraram que ARs podem ser induzidos em diferentes espécies / clones de choupo, por exemplo, mudas de 1-2 anos de P . alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3' e até ramos de choupo de 6 anos (Figura 2A, painel 7). No entanto, nenhuma estrutura de ARs foi produzida nas mudas/ramos de Malus spp., Prunus spp., Cedrus deodara e Pinus massoniana com 1 ano de idade. Em seguida, este protocolo forneceu uma nova via de produção de ARs de choupo: induzir ARs por meio da inoculação de patógenos do cancro fúngico de árvores (V. sordida e B. dothidea) em caules/galhos de choupo.

Os experimentos também indicaram que os métodos de anelamento do floema e da epiderme poderiam induzir a formação de ARs nos caules dos choupos após a inoculação do patógeno; No entanto, os caules do choupo após a inoculação do floema são facilmente quebrados pelo vento nos locais de anelamento para a diminuição significativa da tenacidade causada pela manipulação do anelamento e remoção da casca (floema) e invasão de patógenos. Portanto, para a indução dos ARs, os caules/galhos do choupo devem ser bem amarrados a varas para evitar que se quebrem, especialmente quando o método de anelamento do floema foi usado.

As próprias plantas determinam principalmente a formação de ARs. No entanto, também é afetado por alguns fatores ambientais. Por exemplo, ARs podem ser induzidos em condições de alagamento ou inundação em algumas espécies de dicotiledôneas^18,19. A manutenção da umidade foi a etapa crucial da indução de ARs nos caules / galhos acima do solo. Neste protocolo, tanto o Parafilm quanto o filme de PE doméstico foram usados para preservação da umidade. No entanto, o envoltório do Parafilm pode ser penetrado pelos ARs recém-formados, causando perda de água, retardo de crescimento, escurecimento e lignificações de ARs de choupo. Pelo contrário, ARs abundantes, tenros e ricos em água foram colhidos nos caules de choupo envoltos em PE. Portanto, o filme PE doméstico, não o filme Parafilm, foi recomendado neste protocolo.

As raízes são órgãos cruciais das plantas, desempenhando papéis importantes na reprodução, crescimento, nutrientes e absorção de água das plantas. Em seguida, os métodos devem ser utilizados no estudo da rizogênese²⁰, morfologia e desenvolvimento e arquitetura do sistema radicular (RSA) ²¹ em espécies de choupo. Além disso, pesquisas indicaram que as associações entre o sistema radicular e as bactérias da rizosfera podem melhorar a resistência a doenças das plantas hospedeiras²²; então, a inoculação de patógenos do anelamento deve induzir algumas alterações moleculares e epigenéticas nos ARs de choupo, que têm uma aplicação potencial no cultivo de mudas resistentes a doenças.

A luz é um fator ambiental crítico que afeta o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução das plantas. O experimento de exposição ao sombreamento (Figura 2B) indicou que os ARs de álamo induzidos por patógenos são um sistema de experimento ideal para a biossíntese de segmentos de plantas (flavonóides, antocianinas²³, etc.). Pesquisas anteriores também ilustraram que as condições de luz (intensidade, qualidade, duração e quantidade exposta à planta-mãe) afetam a formação de raízes ou rizogênese e o desenvolvimento de raízes adventícias e laterais 24,25,26. Portanto, por meio do ajuste fino das condições de iluminação, o sistema ARs de choupo induzido por patógenos neste protocolo pode ser usado na pesquisa da biologia radicular e outros processos relacionados à resposta à luz de plantas de choupo.

Os autores não têm nada a divulgar.

Esta pesquisa foi financiada conjuntamente pela Instituição Científica Central de Interesse Público, Fundo de Pesquisa Basal do Laboratório Estadual de Genética e Melhoramento de Árvores (número de concessão CAFYBB2020ZY001-2) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de concessão 32171776) para Jiaping Zhao.