茎溃疡病菌诱导的杨树不定根：研究根生物学和光反应相关过程的实验系统

在这里，我们提出了一种通过韧皮部或表皮带真菌病原体接种途径诱导不定根 （ARs） 产生的方案，适用于研究杨树的根生物学和光响应相关的生理过程。

Valsa sordida 和 Botryosphaeria dothidea 是两种重要的坏死营养真菌病原体，它们会损害许多植物宿主，尤其是 杨属物种。这两种真菌病原体主要发生在杨树的枝条、茎和小枝中，引起口腔溃疡病变、树冠枯萎和枯萎等典型症状。病原体接种是研究植物病害机制的最有效途径。除了茎上接种部位周围的溃疡病灶外，在接种茎溃疡病原菌后，在杨树物种中观察到一种新的发育现象，即大量鲜红色的不定根 （ARs）。在这项研究中，我们描述了在杨树中使用真菌病原体诱导 ARs 的方法。该方法的关键步骤是（韧皮部或表皮）束带作后的病原体接种。第二个关键步骤是保湿材料的应用。与使用 Parafilm 的保湿作相比，用家用聚乙烯 （PE） 保鲜膜包裹接种部位可以在环带接种后 20 天内产生色彩缤纷、数量众多且坚固的 AR。最后，经过遮光处理（用铝箔包裹茎）后，白色 ARs 从杨树茎的接种环中发芽。该方法引入了一种新的实验系统来研究根的发育和形态发生，这对于理解根系发育、形态发生和疾病胁迫下反应的生物学至关重要。此外，当与遮光处理相结合时，本研究可以为研究光响应相关过程提供一个方便的实验系统，例如，类黄酮、花青素或其他相关代谢物的生物合成，以及参与这些过程的基因或转录因子。

由坏死性真菌病原体 Valsa sordida 和 Botryosphaeria dothidea 引起的杨树茎溃疡病是华北地区严重破坏杨树物种生态和经济人工林发展的两种重要树木病害。杨树溃疡病常发生在树干和树枝的树皮上，而溃疡病病变是其典型症状。发病后，扩大的口腔病灶逐渐损害宿主的韧皮部、形成层和木质部。此外，它们还影响了同化产物和水通过血管系统的运输。然而，溃疡病病原体如何阻碍韧皮部和木质部的运输仍不清楚。

为了揭示溃疡病菌感染的杨树中碳水化合物和水的运输机制，我们提出了韧皮部或表皮环接种方法 ^1,2，它结合了经典的花园束带作和病原体接种方法（菌丝体块伤接种）。这些方法可以模拟溃疡病病原体诱导的侵染过程以及水和碳水化合物的阻塞。

我们的研究表明，真菌病原体最初通过诱导碳饥饿而不是水力故障来导致杨树冠层枯死 1,3,4,5。令人惊讶的是，我们在杨树茎上观察到一种特殊的根际发生，这与茎溃疡病病原体的接种有关：大量的红色不定根 （ARs） 从上茎的低端长出（与韧皮部或表皮环的上边缘相对）。此外，我们的实验表明，ARs 的产生在杨树-溃疡病菌相互作用中是普遍的。它们可以由不同年龄（1 岁、2 岁甚至 6 岁）的杨树物种或克隆产生，并且可以由不同的溃疡病病原体（V. sordida 和 B. dothidea）或其分离株诱导。此外，我们还研究了杨树 ARs 的颜色机制，结果表明它与光照条件下类黄酮和花青素的生物合成以及光相关基因（或基因模块）的基因表达调控有关⁶。因此，这些由病原体诱导的杨树 ARs 可以作为研究植物-病原体相互作用、根系生物学以及光相关基因的功能和表达的稳定和理想的实验系统。

在本研究中，我们将介绍并提供通过环状接种途径建立杨树 ARs 实验系统的方案;此外，我们指出了影响 ARs 形成的关键因素，并阐述了环状接种在杨树根生物学和其他光响应相关生理过程研究中的潜在应用。

1. 通过环状接种诱导杨树 ARs

1. 真菌性溃疡病病原体的培养
   1. 将 6 g 马铃薯提取物、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂溶于 1000 mL 水中，制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基。将培养基在 121.1 °C 下消毒 30 分钟，然后将培养基倒入培养皿（直径 9 厘米）中，每个培养皿含有约 20 mL PDA 培养基。
   2. 将活化的真菌菌丝体立方体 （~0.5 cm） 接种在 PDA 培养皿的中心。
   3. 将接种的 PDA 板在 28 °C 的黑暗中孵育 7-10 天。
   4. 将带有真菌菌丝体的孵育的 PDA 培养基切成条状（宽 1.2 cm;长约 3-6 cm）。
2. 杨木材料的制备
   1. 选择 1-2 年树龄、生长旺盛的杨树树苗。
   2. 从杨树苗中选择成熟的茎/枝（直径 1-2 厘米，无病虫害）。
   3. 清洗杨树茎/枝条的接种区（离地面或树枝基部约 30 厘米高）;用 75% 酒精溶液对茎/枝消毒。
3. 通过韧皮部环接种诱导 AR
   1. 小心地将消毒的杨树茎/枝的表皮和韧皮部束带，去除系带的韧皮部环（宽 1 厘米，包括部分形成层），并露出白色的内形成层/木质部组织。
      注意：步骤 1.3.2-1.3.4 详细说明了接种的替代方法。
   2. 用菌丝带（1.2 cm 宽）完全覆盖环状区域，作为韧皮部环状接种处理 （GP）。真菌菌丝面向暴露的木质部。
   3. 用消毒刀刮擦并损坏暴露的内形成层组织，然后将 PDA 带（1.2 厘米宽）接种在带状区域，作为带状形成层去除处理 （GR）。
   4. 作为带状对照 （GC），直接用未培养的 PDA 中型带（1.2 cm 宽）接种环带区域。
   5. 用可拉伸、无色和透明的嫁接胶带（或 PE 塑料薄膜）包裹接种的茎/枝。包裹 4 层以保持水分。
   6. 用（金属、塑料或木质）棍（超过 50 厘米）绑住接种的茎/树枝，以防止它们被风吹走。
   7. 在实验过程中，通过定期灌溉培育带状杨树材料。
   8. 从外部观察并记录接种后 14-30 天杨树 ARs 的形成。
4. 通过表皮环扎接种诱导 ARs
   1. 如步骤 1.2 中所述选择并准备接种材料。
   2. 小心地束缚杨树茎/枝的表皮。
   3. 去除表皮环（1.0 cm 宽）并露出绿色韧皮部组织。
   4. 轻轻垂直刮擦韧皮部组织四次，露出韧皮部的内部结构。
   5. 用真菌菌丝体 （eGP） 和 PDA 带 （eGC） 接种带状表皮区域。执行类似于步骤 1.3.2-1.3.4 的接种作。
   6. 如步骤 1.3.5 所述，用嫁接带（或 PE 塑料薄膜）包裹接种的茎。
   7. 如步骤 1.3.6-1.3.8 中所述管理杨树并观察 AR。

2. 建立通过环接种法研究光相关基因的实验系统

1. 使用韧皮部环接种方法诱导杨树 AR（步骤 1.3.2-1.3.4）。
2. 或者，如步骤 1.4.5 中所述，使用表皮环状接种方法诱导杨树 AR。
3. 用铝箔（遮光处理，S）或无铝箔包裹（光照处理，L）包裹杨树茎/枝条（15 厘米高）的病原体接种区域。
4. 将茎/枝系在 >50 厘米长的棍子上，以防止它们被风吹走。定期种植和管理杨树，并在实验期间保持它们的良好灌溉，如步骤 1.3.6-1.3.7 所述。
5. 接种后 ~20 天从茎上去除铝箔。
6. 立即观察并拍摄有阴影 （S） 和无阴影的杨树 AR （L）。
7. 在阳光或其他人造光源/条件下培养阴凉的杨树 ARs。
8. 去除嫁接带（或 PE 塑料薄膜），并在光照后 1-5 天收获杨树 ARs。
9. 用铝箔包裹所有 AR 样品。对于经过遮蔽处理的杨树 AR，在黑暗中收获样品。
10. 将 AR 样品浸泡在液氮中并储存在 -80 °C 以备进一步研究。
11. 用铝箔包裹后收获光暴露或未暴露的杨树 ARs（在黑暗中进行），并将其储存在 4 °C 用于形态学和其他 原位 测定。

茎溃疡病病原体通过环带接种诱导不定根的工作流程如图 1 所示。这里进行的实验表明，茎溃疡病菌 V. sordida、B. dothidea 及其分离株（来自不同的宿主、区域或致病性）都可以在杨树物种中诱导 ARs 的形成。在该方案中，我们使用 V. sordida 分离株 CZC、CFCC86775 和 B. dothidea 分离株 SD50 和 SD81 在 P. alba var. pyramidalis 中产生 AR。V sodidaCZC 是典型的病原菌，已在中国微生物通用培养物保藏中心（CGMCC 40575）保藏;V. sordida 分离株CFCC86775 是从中国林业文化保藏中心购买的，而 2 株 SD 分离株是从山东省的溃疡病杨树上收集的，并存放在我们的实验室中。如图 2 所示，愈伤组织在环状区域形成（图 2A，第 1 组），在镀金和形成层去除处理中形成少量 AR（图 2A，第 2 组），而在韧皮部环状接种处理后产生红色、大量的须根（图 2A，第 3-6 组）。我们还观察到 ARs 在不同树种或无性系中被诱导，例如 P. alba var. pyramidalis、Populus × beijingensis、P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K、P. euramericana cv. 'Bofeng 3' 或其他杂交杨树）。然而，在该方案中，AR 仅在 1 年生的 P. alba var. pyramidalis 的茎上产生。最后，如图 2 图 7 所示，在病原体 V. sordida 韧皮部环接种后，6 年龄 P. alba var. pyramidalis 的躯干中也诱导了 ARs 结构。杨树干的直径约为 6-7 厘米，最长的须根长度超过 7.0 厘米。

如图 2 所示，在阳光下照射后，遮光杨树 AR 中产生了红色片段，从铝箔包裹的杨树上产生的白色乳白色或浅红色 AR（图 2B，第 1 组）到 3 天后产生的红色 AR（图 2B，第 4 组）。此外，我们还注意到红色素是在光照后短时间内产生的，基因表达分析表明色素（主要是花青素-3-O-葡萄糖苷）的生物合成是直接从其花青素底物转化而来的，而不是从苯丙烷代谢途径开始的 de 新型生物合成⁶。

在该方案中，两种环状方法（韧皮部和表皮环状）都可以在病原体接种后诱导杨树茎上 ARs 的形成。表皮环状接种的杨树发生较少，对生理学 （如水和碳水化合物的运输） 的影响较小;然而，在韧皮部环扎中，ARs 的产生似乎有点快速和有效。因此，在杨树 ARs 的研究中推荐韧皮部环接种法。

图 1：茎溃疡病菌通过环状接种方法在杨树中诱导的不定根 （ARs） 形成的示意图。 首先，将茎溃疡病原菌（在 28 °C 黑暗中培养 7-10 天）切成菌丝带（宽 1.2 cm）。通过两种方法将一年生的杨树苗或一年生的树枝束带在茎上（在地面或枝条基部上方 ~30 厘米处，由蓝色箭头表示）：韧皮部环（环带并丢弃环，包括茎上的表皮、韧皮部和部分形成层组织）或表皮环（环并丢弃环环，仅包括茎的表皮）。环状韧皮部或韧皮部环的宽度为 1.0 厘米。然后，用菌丝体带完全覆盖束带区域，并立即用 PE 塑料胶带包裹;带子的菌丝体侧面面向腰带区域。对于根系生物学的研究，如根际发生和根系发育，接种的杨树苗/枝在常规管理下培养 14-30 天（途径 I，以黄色箭头突出显示）。为了研究片段的生物合成、光形态发生或光相关基因的表达调控，采用了额外的铝箔包裹，然后将接种的树苗/树枝培养 ~20 天以产生 ARs。当产生 ARs 时，从茎/枝上去除铝箔，并将杨树 ARs 暴露在阳光或其他光照条件下（光谱、强度、周期或其组合不同）（途径 II，以红色箭头突出显示）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：茎溃疡病病原体在杨树 ARs 的光照条件下诱导不定根 （ARs） 和节段生物合成的形成。 （A） 不同的茎溃疡病原菌诱导杨树茎中 AR 的形成。A1： 环带控制;A2： 环带和形成层去除 （GR）;A3-6： 不同的茎溃疡病原菌 （V. sordida 和 B. dothidea） 诱导 1 年生白 杨 var. pyramidalis 幼苗形成 AR;A7： 在 6 年生的 P. alba var. pyramidalis 的分支上产生的 ARs。（B） 光照诱导杨树 ARs 上节段的生物合成。B1-B4 表示暴露后 0 、 1 、 2 和 3 天在光照条件下暴露的杨树 ARs。 请单击此处查看此图的较大版本。

杨树物种容易从茎插条中产生 AR 或侧根 （LR），这有助于它们的繁殖，并作为木质植物根生物学研究的模型 ^7,8。此外，研究表明，接种特定微生物，例如有益细菌（根瘤农杆菌 ^9,10;植物促生长根际细菌 [PGPR]¹¹）、内生菌^12,13、丛枝菌根真菌 （AMF）^14,15 或外生菌根真菌 （EMF）^16,17 可以促进植物根系的生长或发育。然而，没有关于在寄主植物上诱导或促进 ARs 结构的病原体 （既不是细菌也不是真菌病原体） 的报道。

这里的实验表明，不同的杨树溃疡病病原体（如 V. sordida、 B. dothidea）可以在杨树茎/枝中诱导 ARs 的形成（图 2A，第 3-6 组）。此外，实验表明，ARs 可以在不同的杨树物种/克隆上诱导，例如，1-2 年生的白 杨树苗、 ×北京杨树、 白杨× P. tremula var. glandulosa 克隆 84K、 P. euramericana cv. 'Bofeng 3'，甚至 6 年生 的杨树 枝条（图 2A，图 7）。然而，在 Malus spp.、 Prunus spp.、 Cedrus deodara 和 Pinus massoniana 的 1 年生树苗/树枝上未产生 ARs 结构。然后，该方案提供了杨树 ARs 生产的新途径：通过在杨树茎/枝上环带接种树木真菌溃疡病菌 （V. sordida 和 B. dothidea） 来诱导 ARs。

实验还表明，韧皮部和表皮环扎法均可诱导病原菌接种后杨树茎上ARs的形成;然而，韧皮部接种后的杨树茎在环状部很容易在环状部位发生风力断裂，导致环状和去除树皮（韧皮部）作和病原体入侵引起的韧性显著降低。因此，对于 ARs 诱导，杨树茎/枝应与棍子绑好，以防止它们折断，尤其是使用韧皮部环扎法时。

植物本身主要决定 ARs 的形成。但是，它也受到一些环境因素的影响。例如，在某些双子叶植物物种的内涝或洪水条件下可以诱导 AR^18,19。保持水分是在地上茎/枝上诱导 ARs 的关键步骤。在该协议中，石蜡膜和家用 PE 薄膜都用于保持水分。然而，新形成的 AR 可以穿透封口膜包裹，然后导致杨树 AR 的水分流失、生长迟缓、褐变和木质化。相反，在 PE 包裹的杨树茎中收获了丰富、柔软和富含水分的 AR。因此，本协议推荐使用家用 PE 薄膜，而不是 Parafilm 薄膜。

根是植物的重要器官，在植物的繁殖、生长、养分和水分吸收中起着重要作用。然后，这些方法应用于杨树物种根茎发生²⁰、形态和发育以及根系结构 （RSA）²¹ 的研究。此外，研究表明，根系与根际细菌之间的关联可以提高寄主植物的抗病性²²;然后，环状溃疡病菌接种应诱导杨树 ARs 的一些分子和表观遗传变化，这在抗病幼苗的培养中具有潜在的应用价值。

光是影响植物生长、发育和繁殖的关键环境因素。遮荫暴露实验（图 2B）表明，病原体诱导的杨树 ARs 是植物节段（类黄酮、花青素²³ 等）生物合成的理想实验系统。以前的研究还表明，光照条件（暴露于母株的强度、质量、持续时间和数量）会影响根的形成或根际发生以及不定根和侧根的发育 24,25,26。因此，通过对照明条件的微调，该方案中病原体诱导的杨树 ARs 系统可用于杨树植物根系生物学和其他光响应相关过程的研究。

作者没有什么可披露的。

本研究由树木遗传育种国家重点实验室中央公益性科研机构基础研究基金（资助号 CAFYBB2020ZY001-2）和国家自然科学基金（资助号 32171776）联合资助给赵佳平。