Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la produzione di radici avventizie (AR) attraverso la via di inoculazione dei patogeni fungini del floema o della cintura dell'epidermide, che è adatto per lo studio della biologia delle radici e dei processi fisiologici correlati alla risposta alla luce nel pioppo.

Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea sono due patogeni fungini necrotrofi cruciali che danneggiano molte piante ospiti, in particolare le specie del genere Populus. Questi due patogeni fungini si verificano principalmente nei rami, negli steli e nei ramoscelli di pioppo, causando sintomi classici come lesioni del cancro, deperimento della chioma e appassimento. L'inoculazione di agenti patogeni è il percorso più efficiente per studiare il meccanismo delle malattie delle piante. Oltre alle lesioni del cancro intorno ai siti di inoculazione sugli steli, un nuovo fenomeno dello sviluppo, abbondanti radici avventizie (AR) di colore rosso vivo, sono state osservate nelle specie di pioppo dopo inoculazioni di agenti patogeni del cancro dello stelo. In questo studio, abbiamo descritto il metodo per indurre AR utilizzando patogeni fungini nei pioppi. Il passaggio cruciale di questo metodo è l'inoculazione del patogeno dopo la manipolazione del cingolo (floema o epidermide). Il secondo passaggio cruciale è l'applicazione del materiale idratante. Rispetto alla manipolazione idratante con Parafilm, avvolgere i siti inoculati con un involucro di plastica in polietilene (PE) per uso domestico può produrre AR colorati, numerosi e robusti in 20 giorni dopo l'inoculazione della cintura. Infine, gli AR bianchi sono spuntati dagli anelli inoculati negli steli di pioppo dopo il trattamento di ombreggiatura (avvolgendo gli steli con un foglio di alluminio). Questo metodo introduce un nuovo sistema sperimentale per lo studio dello sviluppo e della morfogenesi delle radici, che è fondamentale per comprendere la biologia dello sviluppo delle radici, della morfogenesi e della risposta allo stress della malattia. Inoltre, se combinato con il trattamento di ombreggiamento, questo studio può fornire un comodo sistema sperimentale per studiare i processi correlati alla risposta alla luce, ad esempio la biosintesi di flavonoidi, antociani o altri metaboliti correlati e geni o fattori di trascrizione coinvolti in questi processi.

Le malattie del cancro del fusto di pioppo causate da patogeni fungini necrotrofi, Valsa sordida e Botryosphaeria dothidea, sono le due malattie arboree cruciali nel nord della Cina che hanno gravemente danneggiato lo sviluppo ecologico ed economico delle piantagioni di specie di pioppo. Le afte del pioppo si manifestano sempre sulla corteccia dei tronchi e dei rami, mentre le lesioni del cancro sono i loro sintomi tipici. Dopo l'insorgenza delle malattie, le lesioni del cancro in espansione hanno progressivamente danneggiato il floema, il cambio e lo xilema degli ospiti. Inoltre, hanno influenzato il trasporto dei prodotti assimilati e dell'acqua attraverso il sistema vascolare. Tuttavia, il modo in cui i patogeni del cancro ostacolano il trasporto del floema e dello xilema rimane poco chiaro.

Per rivelare i meccanismi di trasporto dei carboidrati e dell'acqua nei pioppi infettati da agenti patogeni del cancro, abbiamo proposto i metodi di inoculazione del floema o della cintura dell'epidermide ^1,2, che combinavano la classica manipolazione della cintura da giardino e il metodo di inoculazione dei patogeni (inoculazione del blocco dei miceli). Questi metodi possono simulare il processo di infestazione e il blocco di acqua e carboidrati indotto da agenti patogeni del cancro.

La nostra ricerca ha dimostrato che i patogeni fungini hanno causato il deperimento della chioma dei pioppi inducendo inizialmente la carenza di carbonio, non il cedimento idraulico 1,3,4,5. Sorprendentemente, abbiamo osservato una particolare rizogenesi sugli steli di pioppo che è stata associata all'inoculazione di patogeni del cancro dello stelo: abbondanti radici avventizie rosse (AR) crescono dall'estremità inferiore degli steli superiori (opposta al bordo superiore del floema o degli anelli di cintura dell'epidermide). Inoltre, i nostri esperimenti hanno dimostrato che la produzione di AR è universale nell'interazione tra pioppo e cancro patogeno. Possono essere prodotti da specie di pioppo o cloni di età diverse (1, 2 o anche 6 anni) e possono essere indotti da diversi agenti patogeni del cancro (V. sordida e B. dothidea) o dai loro isolati. Inoltre, abbiamo studiato i meccanismi del colore degli AR di pioppo e i risultati hanno mostrato che è associato alla biosintesi di flavonoidi e antociani, nonché alla regolazione dell'espressione genica di geni correlati alla luce (o moduli genici) in condizioni di illuminazione⁶. Pertanto, questi AR di pioppo indotti da patogeni possono essere utilizzati come sistema sperimentale stabile e ideale per lo studio dell'interazione pianta-patogeno, della biologia delle radici e della funzione e dell'espressione di geni correlati alla luce.

In questo studio, introdurremo e forniremo il protocollo per stabilire un sistema sperimentale ARs di pioppo attraverso la via di inoculazione del cingolo; inoltre, sottolineiamo i fattori cruciali che influenzano la formazione di AR ed esponiamo la potenziale applicazione dell'inoculazione del cingolo nello studio della biologia delle radici di pioppo e di altri processi fisiologici correlati alla risposta alla luce.

1. Induzione di AR di pioppo mediante inoculazione di cintura

1. Coltura del patogeno del cancro fungino
   1. Sciogliere 6 g di estratto di patate, 20 g di destrosio e 20 g di agar agar in 1000 ml di acqua per preparare il terreno di agar destrosio di patate (PDA). Sterilizzare il terreno a 121,1 °C per 30 minuti e versare il terreno in piastre di Petri (9 cm di diametro), ciascuna contenente circa 20 ml di terreno PDA.
   2. Inoculare il cubo di micelio fungino attivato (~0,5 cm) al centro della capsula di Petri PDA.
   3. Incubare le piastre PDA inoculate al buio a 28 °C per 7-10 giorni.
   4. Tagliare il terreno PDA incubato con micelio fungino in cinghie (1,2 cm di larghezza; circa 3-6 cm di lunghezza).
2. Preparazione di materiali di pioppo
   1. Seleziona alberelli di pioppo di 1-2 anni, a crescita vigorosa.
   2. Seleziona steli/rami maturi da alberelli di pioppo (1-2 cm di diametro, privi di malattie e infestazioni di parassiti).
   3. Lavare le regioni di inoculazione (a circa 30 cm di altezza dal suolo o dalla base dei rami) dei fusti/rami di pioppo; Sterilizzare gli steli/rami con una soluzione alcolica al 75%.
3. Induzione di AR attraverso la cintura-inoculazione del floema
   1. Cingere con cura l'epidermide e il floema degli steli/rami di pioppo sterilizzati, rimuovere gli anelli floematici cinti (1 cm di larghezza, compreso il cambio parziale) ed esporre i tessuti bianchi interni del cambio/xilema.
      NOTA: I passaggi 1.3.2-1.3.4 descrivono in dettaglio i metodi alternativi di inoculazione.
   2. Coprire completamente la regione del cingolo con cinghie per miceli (1,2 cm di larghezza) come trattamento di inoculazione del cingolo floematico (GP). Le ife fungine sono rivolte verso lo xilema esposto.
   3. Raschiare e danneggiare il tessuto interno del cambio esposto con coltelli sterilizzati, quindi inoculare le cinghie PDA (1,2 cm di larghezza) sulle regioni di cintura come trattamento di rimozione del cambio di cintura (GR).
   4. Inoculare le regioni di cintura direttamente con le cinghie medie PDA non coltivate (1,2 cm di larghezza) come controllo della cintura (GC).
   5. Avvolgere gli steli/rami inoculati con nastro da innesto estensibile, incolore e trasparente (o pellicola di plastica PE). Avvolgi 4 strati per trattenere l'umidità.
   6. Lega gli steli/rami inoculati con bastoncini (di metallo, plastica o legnosi) (oltre 50 cm) per evitare che si rompano il vento.
   7. Coltivare i materiali di pioppo ciinto con irrigazione regolare durante l'esperimento.
   8. Osservare dall'esterno e registrare la formazione di AR di pioppo 14-30 giorni dopo l'inoculazione.
4. Induzione di AR attraverso la cintura-inoculazione dell'epidermide
   1. Selezionare e preparare i materiali inoculati come descritto al punto 1.2.
   2. Cingere con cura l'epidermide degli steli/rami di pioppo.
   3. Rimuovere gli anelli dell'epidermide (1,0 cm di larghezza) ed esporre il tessuto floematico verde.
   4. Raschiare leggermente e verticalmente il tessuto floematico quattro volte ed esporre la struttura interna del floema.
   5. Inoculare la regione dell'epidermide cinta con il micelio fungino (eGP) e le cinghie PDA (eGC). Eseguire manipolazioni di inoculazione simili ai passaggi 1.3.2-1.3.4.
   6. Avvolgere gli steli inoculati con nastro da innesto (o pellicola di plastica in PE) come descritto al punto 1.3.5.
   7. Gestisci i pioppi e osserva gli AR come descritto nei passaggi 1.3.6-1.3.8.

2. Messa a punto di un sistema sperimentale per la ricerca di geni correlati alla luce attraverso il metodo di inoculazione del cingolo

1. Indurre AR di pioppo utilizzando il metodo di inoculazione del cingolo floematico (passaggi 1.3.2-1.3.4).
2. In alternativa, indurre AR di pioppo utilizzando il metodo di inoculazione del cingimento epidermico come descritto nel passaggio 1.4.5.
3. Avvolgere le regioni inoculate da agenti patogeni di steli/rami di pioppo (15 cm di altezza) con un foglio di alluminio (trattamento ombreggiante, S) o senza pellicola di alluminio (trattamento di illuminazione, L).
4. Lega gli steli/rami a bastoncini lunghi >50 cm per evitare che si rompano il vento. Coltivare e gestire regolarmente i pioppi e mantenerli ben irrigati durante l'esperimento come descritto nei passaggi 1.3.6-1.3.7.
5. Rimuovere il foglio di alluminio dai gambi a ~20 giorni dopo l'inoculazione.
6. Osservare e fotografare immediatamente gli AR di pioppo sfumato (S) e non ombreggiato (L).
7. Coltiva gli AR di pioppo ombreggiato alla luce del sole o in altre fonti/condizioni di luce artificiale.
8. Rimuovere i nastri da innesto (o pellicole plastiche in PE) e raccogliere gli AR di pioppo a 1-5 giorni dopo l'esposizione alla luce.
9. Avvolgi tutti i campioni AR con un foglio di alluminio. Per gli AR di pioppo che hanno subito un trattamento di ombreggiamento, raccogliere i campioni al buio.
10. Immergere i campioni AR in azoto liquido e conservarli a -80 °C per ulteriori indagini.
11. Raccogliere gli AR di pioppo esposti alla luce o non esposti (condotti al buio) dopo averli avvolti con un foglio di alluminio e conservarli a 4 °C per saggi morfologici e altri saggi in situ .

Il flusso di lavoro dei patogeni del cancro del fusto che inducono radici avventizie attraverso l'inoculazione del cingolo è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti condotti qui hanno dimostrato che sia i patogeni del cancro del fusto, V. sordida, B. dothidea, sia i loro isolati (provenienti da diversi ospiti, regioni o patogenicità) possono indurre la formazione di AR nelle specie di pioppo. In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'isolato di V. sordida CZC, CFCC86775 e gli isolati di B. dothidea SD50 e SD81 per produrre AR in P. alba var. V sodida Il CZC è un tipico agente patogeno utilizzato ed è stato depositato nel China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC 40575); V. sordida isolato CFCC86775 è stato acquistato dal China Forestry Culture Collection Center, mentre due isolati SD sono stati raccolti dai pioppi della malattia del cancro nella provincia di Shandong e depositati nel nostro laboratorio. Come mostrato nella Figura 2, il callo si è formato sulla regione del cingolo (Figura 2A, pannello 1) e pochi AR si sono formati durante la doratura e il trattamento di rimozione del cambio (Figura 2A, pannello 2), mentre il rosso, molte radici fibrose sono state prodotte dopo il trattamento di inoculazione del floema (Figura 2A, pannelli 3-6). Abbiamo anche osservato che gli AR sono stati indotti in diverse specie o cloni di pioppo, come P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', o altri pioppi ibridi). Tuttavia, in questo protocollo, gli AR sono prodotti solo sugli steli di P. alba var. pyramidalis di 1 anno. Infine, come mostrato nella Figura 2 pannello 7, le strutture ARs sono state indotte anche nei tronchi di P . alba var. pyramidalis di 6 anni dopo l'inoculazione floematica da parte del patogeno V. sordida. I diametri del tronco di pioppo si aggirano intorno ai 6-7 cm e la lunghezza delle radici fibrose più lunghe era superiore a 7,0 cm.

Come mostrato nella Figura 2, i segmenti rossi sono stati prodotti negli AR di pioppo ombreggiante dopo essere stati esposti alla luce solare, dagli AR bianchi lattiginosi o rosso chiaro prodotti sui pioppi avvolti in fogli di alluminio (Figura 2B, pannello 1) agli AR rossi 3 giorni dopo (Figura 2B, pannello 4). Inoltre, abbiamo anche notato che i pigmenti rossi sono stati prodotti in un breve periodo dopo l'esposizione alla luce, e l'analisi dell'espressione genica ha dimostrato che la biosintesi dei pigmenti (principalmente cianidina-3-O-glucoside) è stata trasformata direttamente dai loro substrati di antocianidine, non la nuova biosintesi dall'inizio della via metabolica del fenilpropano⁶.

In questo protocollo, entrambi i due metodi di cingimento (floema e cingimento dell'epidermide) possono indurre la formazione di AR sugli steli di pioppo dopo l'inoculazione del patogeno. Si sono verificati meno frangivento e meno influenza sulla fisiologia (come il trasporto di acqua e carboidrati) nei pioppi inoculati con cinture di epidermide; tuttavia, sembra che la produzione di AR sia un po' veloce ed efficiente nella cintura del floema. Pertanto, il metodo di inoculazione del cingolo floematico è raccomandato nella ricerca di AR di pioppo.

Figura 1: Il flusso di lavoro schematico della formazione di radici avventizie (AR) indotta dal patogeno del cancro dello stelo attraverso metodi di inoculazione della cintura nei pioppi. In primo luogo, l'agente patogeno del cancro dello stelo (coltivato a 28 °C al buio per 7-10 giorni) è stato tagliato in cinghie di micelio (1,2 cm di larghezza). Gli alberelli di pioppo di un anno o i rami di un anno venivano cinti sugli steli (a ~30 cm sopra il suolo o la base dei rami, indicati dalle frecce blu) attraverso due metodi: cingimento floematico (cingere e scartare gli anelli cinti che includono epidermide, floema e tessuti di cambio parziale sugli steli) o cingimento epidermico (cingere e scartare gli anelli cinti che includono solo l'epidermide degli steli). La larghezza del floema cinto o degli anelli floematici è di 1,0 cm. Quindi, le regioni cinte sono state ricoperte interamente con cinghie di micelio e avvolte immediatamente con nastro di plastica PE; I lati del micelio della cinghia erano rivolti verso la regione cinturata. Per la ricerca sulla biologia delle radici, come la rizogenesi e lo sviluppo delle radici, gli alberelli/rami di pioppo inoculati sono stati coltivati per 14-30 giorni in regime di gestione regolare (Pathway I, evidenziato nelle frecce gialle). Per la ricerca sulla biosintesi dei segmenti, la fotomorfogenesi o la regolazione dell'espressione dei geni legati alla luce, è stato adottato un ulteriore avvolgimento di fogli di alluminio, quindi gli alberelli/rami inoculati sono stati coltivati ~20 giorni per produrre gli AR. Quando gli AR sono stati prodotti, il foglio di alluminio è stato rimosso dagli steli/rami e gli AR di pioppo sono stati esposti alla luce del sole o ad altre condizioni di luce (variate nello spettro luminoso, nell'intensità, nel periodo o nelle loro combinazioni) (Pathway II, evidenziato nelle frecce rosse). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: I patogeni del cancro del fusto hanno indotto la formazione di radici avventizie (AR) e la biosintesi dei segmenti in condizioni di luce di AR nel pioppo. (A) Diversi patogeni del cancro del fusto inducono la formazione di AR nei fusti di pioppo. A1: controllo della cintura; A2: cingimento e rimozione del cambio (GR); A3-6: Diversi agenti patogeni del cancro dello stelo (V. sordida e B. dothidea) inducono la formazione di AR in alberelli di P. alba var. pyramidalis di 1 anno; A7: AR prodotti sul ramo di P. alba var. pyramidalis di 6 anni. (B) L'esposizione alla luce induce la biosintesi di segmenti su AR di pioppo. B1-B4 rappresentano AR di pioppo esposti in condizioni di luce a 0, 1, 2 e 3 giorni dopo l'esposizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le specie di pioppo sono in grado di produrre AR o radici laterali (LR) da talee di fusto, il che contribuisce alla loro riproduzione e come modello per lo studio della biologia delle radici nelle piante legnose ^7,8. Inoltre, la ricerca ha indicato che l'inoculazione di microrganismi specifici, come i batteri benefici (Agrobacterium rhizogenes ^9,10; I rizobatteri che promuovono la crescita delle piante [PGPR]¹¹), i batteri endofiti^12,13, i funghi micorrizici arbuscolari (AMF)^14,15 o i funghi ectomicorrizici (EMF)^16,17 potrebbero promuovere la crescita o lo sviluppo delle radici delle piante. Tuttavia, non è stata segnalata alcuna segnalazione di agenti patogeni (né batteri né patogeni fungini) che inducono o promuovono la struttura degli AR sulle piante ospiti.

Gli esperimenti qui hanno dimostrato che diversi patogeni del cancro del pioppo (come V. sordida, B. dothidea) potrebbero indurre la formazione di AR negli steli/rami di pioppo (Figura 2A, pannelli 3-6). Inoltre, gli esperimenti hanno dimostrato che gli AR potrebbero essere indotti su diverse specie/cloni di pioppo, ad esempio alberelli di 1-2 anni di P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3' e persino rami di pioppo di 6 anni (Figura 2A, pannello 7). Tuttavia, non è stata prodotta alcuna struttura ARs sugli alberelli/rami di 1 anno di Malus spp., Prunus spp., Cedrus deodara e Pinus massoniana. Quindi, questo protocollo ha fornito un nuovo percorso di produzione di AR di pioppo: l'induzione di AR attraverso l'inoculazione cingolata di patogeni del cancro fungino degli alberi (V. sordida e B. dothidea) su steli/rami di pioppo.

Gli esperimenti hanno anche indicato che entrambi i metodi di cingimento floematico e epidermico potrebbero indurre la formazione di AR sugli steli di pioppo dopo l'inoculazione di agenti patogeni; Tuttavia, gli steli di pioppo dopo l'inoculazione del floema si rompono facilmente dal vento nei siti di cintura per la significativa diminuzione della tenacità causata dalla cintura e dalla rimozione della corteccia (floema), dalla manipolazione e dall'invasione di agenti patogeni. Pertanto, per l'induzione degli AR, gli steli/rami di pioppo devono essere ben legati a bastoncini per evitare che si rompano, soprattutto quando è stato utilizzato il metodo della cintura floematica.

Le piante stesse determinano principalmente la formazione di AR. Tuttavia, è anche influenzato da alcuni fattori ambientali. Ad esempio, gli AR possono essere indotti in condizioni di ristagno idrico o di inondazione in alcune specie di dicotiledoni^18,19. Il mantenimento dell'umidità è stato il passaggio cruciale dell'induzione degli AR sugli steli/rami fuori terra. In questo protocollo, per la conservazione dell'umidità sono stati utilizzati sia il Parafilm che il film PE per uso domestico. Tuttavia, l'involucro del Parafilm può essere penetrato dagli AR di nuova formazione, causando quindi perdita d'acqua, ritardo della crescita, imbrunimento e lignificazioni degli AR di pioppo. Al contrario, negli steli di pioppo avvolti in PE sono stati raccolti AR abbondanti, teneri e ricchi d'acqua. Pertanto, in questo protocollo è stata raccomandata la pellicola PE per uso domestico, non la pellicola Parafilm.

Le radici sono organi cruciali delle piante e svolgono un ruolo importante nella riproduzione, nella crescita, nei nutrienti e nell'assorbimento dell'acqua delle piante. Quindi i metodi dovrebbero essere utilizzati nello studio della rizogenesi²⁰, della morfologia e dello sviluppo e dell'architettura dell'apparato radicale (RSA)²¹ nelle specie di pioppo. Inoltre, la ricerca ha indicato che le associazioni tra l'apparato radicale e i batteri della rizosfera potrebbero migliorare la resistenza alle malattie delle piante ospiti²²; quindi, l'inoculazione dei patogeni del cancro della cintura dovrebbe indurre alcuni cambiamenti molecolari ed epigenetici negli AR di pioppo, che hanno una potenziale applicazione nella coltivazione di piantine resistenti alle malattie.

La luce è un fattore ambientale critico che influisce sulla crescita, lo sviluppo e la riproduzione delle piante. L'esperimento di ombreggiatura-esposizione (Figura 2B) ha indicato che gli AR di pioppo indotti da agenti patogeni sono un sistema sperimentale ideale per la biosintesi di segmenti vegetali (flavonoidi, antociani²³, ecc.). Ricerche precedenti hanno anche dimostrato che le condizioni di luce (intensità, qualità, durata e quantità esposta alla pianta madre) influenzano la formazione delle radici o la rizogenesi e lo sviluppo delle radici avventizie e laterali 24,25,26. Pertanto, attraverso la messa a punto delle condizioni di illuminazione, il sistema ARs di pioppo indotto da patogeni in questo protocollo può essere utilizzato nella ricerca della biologia delle radici e di altri processi correlati alla risposta alla luce delle piante di pioppo.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questa ricerca è stata finanziata congiuntamente dall'Istituto Scientifico Centrale di Interesse Pubblico, dal Fondo di Ricerca Base dello Stato, dal Laboratorio Chiave di Genetica e Allevamento degli Alberi (numero di sovvenzione CAFYBB2020ZY001-2) e dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (numero di sovvenzione 32171776) a Jiaping Zhao.