Raíces adventicias de álamo inducidas por patógenos del cancro del tallo: un sistema experimental para estudiar la biología de las raíces y los procesos relacionados con la respuesta a la luz

Aquí, presentamos un protocolo para inducir la producción de raíces adventicias (AR) a través de la vía de inoculación de patógenos fúngicos en el floema o la cintura de la epidermis, que es adecuado para el estudio de la biología de las raíces y los procesos fisiológicos relacionados con la respuesta a la luz en el álamo.

Valsa sordida y Botryosphaeria dothidea son dos patógenos fúngicos necrótrofos cruciales que dañan a muchos huéspedes de plantas, particularmente a las especies del género Populus. Estos dos patógenos fúngicos se encuentran principalmente en las ramas, tallos y ramitas del álamo, causando síntomas clásicos como lesiones de cancro, muerte regresiva del dosel y marchitamiento. La inoculación de patógenos es la vía más eficiente para estudiar el mecanismo de las enfermedades de las plantas. Además de las lesiones de cancro alrededor de los sitios de inoculación en los tallos, se observó un nuevo fenómeno de desarrollo, abundantes raíces adventicias (AR) de color rojo brillante, en especies de álamo después de las inoculaciones del patógeno del cancro del tallo. En este estudio, describimos el método para inducir ARs utilizando patógenos fúngicos en álamos. El paso crucial de este método es la inoculación del patógeno después de la manipulación del anillado (floema o epidermis). El segundo paso crucial es la aplicación del material hidratante. En comparación con la manipulación de la humectación con Parafilm, envolver los sitios inoculados con una envoltura de plástico de polietileno (PE) puede producir AR coloridos, numerosos y robustos en 20 días después de la inoculación del anillado. Finalmente, los AR blancos brotaron de los anillos inoculados en los tallos de álamo después del tratamiento de sombreado (envolviendo los tallos con papel de aluminio). Este método introduce un nuevo sistema experimental para estudiar el desarrollo y la morfogénesis de las raíces, que es crucial para comprender la biología del desarrollo de las raíces, la morfogénesis y la respuesta bajo el estrés de las enfermedades. Además, cuando se combina con el tratamiento de sombreado, este estudio puede proporcionar un sistema experimental conveniente para investigar los procesos relacionados con la respuesta a la luz, por ejemplo, la biosíntesis de flavonoides, antocianinas u otros metabolitos relacionados, y genes o factores de transcripción involucrados en estos procesos.

Las enfermedades del cancro del tallo del álamo causadas por patógenos fúngicos necrótrofos, Valsa sordida y Botryosphaeria dothidea, son las dos enfermedades cruciales de los árboles en el norte de China que dañaron gravemente el desarrollo de las plantaciones ecológicas y económicas de las especies de álamo. Las enfermedades del cancro del álamo siempre ocurren en la corteza de los troncos y ramas, mientras que las lesiones del cancro son sus síntomas típicos. Después de la aparición de enfermedades, las lesiones de cancro en expansión dañaron progresivamente el floema, el cambium y el xilema de los huéspedes. Además, afectaban al transporte de productos asimilados y agua a través del sistema vascular. Sin embargo, aún no está claro cómo los patógenos del cancro impiden el transporte del floema y el xilema.

Para revelar los mecanismos de transporte de carbohidratos y agua en álamos infectados por patógenos del cancro, propusimos los métodos de inoculación de anillamiento de floema o epidermis ^1,2, que combinaron la manipulación clásica de la faja de jardín y el método de inoculación de patógenos (inoculación de heridas en bloque de micelios). Estos métodos pueden simular el proceso de infestación y el bloqueo de agua y carbohidratos inducido por patógenos del cancro.

Nuestra investigación ilustró que los patógenos fúngicos causaron la muerte regresiva del dosel del álamo al inducir inicialmente la inanición de carbono, no la falla hidráulica 1,3,4,5. Sorprendentemente, hemos observado una rizogénesis especial en los tallos de álamo que se asoció con la inoculación de patógenos del cancro del tallo: copiosas raíces adventicias rojas (AR) crecen desde el extremo inferior de los tallos superiores (opuesto al borde superior del floema o los anillos de anillamiento de la epidermis). Además, nuestros experimentos demostraron que la producción de ARs es universal en la interacción entre el álamo y el patógeno del cancro. Pueden producirse a partir de especies de álamos o clones a diferentes edades (1, 2 o incluso 6 años) y pueden ser inducidos por diferentes patógenos del cancro (V. sordida y B. dothidea) o sus aislados. Además, hemos estudiado los mecanismos de color de los ARs de álamo, y los resultados mostraron que está asociado con la biosíntesis de flavonoides y antocianinas, así como con la regulación de la expresión génica de genes relacionados con la luz (o módulos de genes) en condiciones de iluminación⁶. Por lo tanto, estos ARs de álamo inducidos por patógenos pueden utilizarse como un sistema experimental estable e ideal para el estudio de la interacción planta-patógeno, la biología de las raíces y la función y expresión de genes relacionados con la luz.

En este estudio, presentaremos y proporcionaremos el protocolo para establecer un sistema experimental de ARs de álamo a través de la vía de inoculación de anillado; además, señalamos los factores cruciales que afectan la formación de ARs y exponemos la posible aplicación de la inoculación de anillado en el estudio de la biología de la raíz de álamo y otros procesos fisiológicos relacionados con la respuesta a la luz.

1. Inducción de ARs de álamo mediante inoculación con anillado

1. Cultivo del patógeno del cancro fúngico
   1. Disuelva 6 g de extracto de papa, 20 g de dextrosa y 20 g de agar en 1000 ml de agua para preparar el medio de agar papa dextrosa (PDA). Esterilizar el medio a 121,1 °C durante 30 min y verter el medio en placas de Petri (9 cm de diámetro), conteniendo cada placa unos 20 mL de medio PDA.
   2. Inocular el cubo de micelio fúngico activado (~0,5 cm) en el centro de la placa de Petri PDA.
   3. Incubar las placas de PDA inoculadas en la oscuridad a 28 °C durante 7-10 días.
   4. Corte el medio PDA incubado con micelio fúngico en tiras (1,2 cm de ancho; aproximadamente 3-6 cm de largo).
2. Preparación de materiales de álamo
   1. Seleccione árboles jóvenes de álamo de 1 a 2 años de edad y crecimiento vigoroso.
   2. Seleccione tallos/ramas maduros de árboles jóvenes de álamo (1-2 cm de diámetro, libres de enfermedades e infestaciones de plagas).
   3. Lave las regiones de inoculación (a unos 30 cm de altura sobre el suelo o la base de las ramas) de los tallos/ramas de álamo; Esterilizar los tallos/ramas con una solución de alcohol al 75%.
3. Inducción de ARs mediante inoculación de anillado del floema
   1. Ciñir cuidadosamente la epidermis y el floema de los tallos/ramas de álamo esterilizados, retirar los anillos de floema ceñidos (1 cm de ancho, incluido el cambium parcial) y exponer los tejidos blancos del cambium/xilema interno.
      NOTA: Los pasos 1.3.2-1.3.4 detallan métodos alternativos de inoculación.
   2. Cubrir completamente la región de anillado con correas de micelio (1,2 cm de ancho) como tratamiento de inoculación de anillado de floema (GP). Las hifas fúngicas se enfrentan al xilema expuesto.
   3. Raspe y dañe el tejido de cambium interno expuesto con cuchillos esterilizados y, a continuación, inocule las correas de PDA (1,2 cm de ancho) en las regiones de anillado como tratamiento de eliminación de cambium (GR).
   4. Inocular las regiones de anillado directamente con las correas medianas PDA no cultivadas (1,2 cm de ancho) como control de anillado (GC).
   5. Envuelva los tallos/ramas inoculados con cinta de injerto elástica, incolora y transparente (o película de plástico PE). Envuelve 4 capas para mantener la humedad.
   6. Ate los tallos/ramas inoculados con palos (de metal, plástico o madera) (de más de 50 cm) para protegerlos del viento.
   7. Cultive los materiales de álamo anillado con riego regular durante el experimento.
   8. Observe desde el exterior y registre la formación de álamos ARs 14-30 días después de la inoculación.
4. Inducción de ARs a través de la inoculación de la epidermis
   1. Seleccione y prepare los materiales inoculados como se describe en el paso 1.2.
   2. Ciña con cuidado la epidermis de los tallos/ramas de álamo.
   3. Retire los anillos de la epidermis (1,0 cm de ancho) y exponga el tejido verde del floema.
   4. Raspe ligera y verticalmente el tejido del floema cuatro veces y exponga la estructura interna del floema.
   5. Inocular la región de la epidermis ceñida con el micelio fúngico (eGP) y las correas de PDA (eGC). Realice manipulaciones de inoculación similares a los pasos 1.3.2-1.3.4.
   6. Envuelva los tallos inoculados con cinta de injerto (o película de plástico PE) como se describe en el paso 1.3.5.
   7. Maneje los álamos y observe los AR, como se describe en los pasos 1.3.6 a 1.3.8.

2. Establecimiento de un sistema experimental para la investigación de genes relacionados con la luz mediante el método de inoculación con anillado

1. Inducir ARs de álamo utilizando el método de inoculación de anillado por floema (pasos 1.3.2-1.3.4).
2. Alternativamente, inducir ARs de álamo utilizando el método de inoculación de anillado de la epidermis como se describe en el paso 1.4.5.
3. Envuelva las regiones inoculadas por patógenos de los tallos/ramas de álamo (15 cm de altura) con papel de aluminio (tratamiento de sombreado, S) o sin envoltura de papel de aluminio (tratamiento de iluminación, L).
4. Ate los tallos/ramas a palos de >50 cm de largo para evitar que se rompan con el viento. Cultive y maneje los álamos con regularidad y manténgalos bien regados durante el experimento como se describe en los pasos 1.3.6-1.3.7.
5. Retire el papel de aluminio de los tallos a ~ 20 días después de la inoculación.
6. Observe y fotografíe inmediatamente los ARs de álamo sombreados (S) y sin sombrear (L) de papel de aluminio.
7. Cultive los álamos sombreados a la luz del sol u otras fuentes/condiciones de luz artificial.
8. Retire las cintas de injerto (o películas de plástico PE) y coseche los AR de álamo entre 1 y 5 días después de la exposición a la luz.
9. Envuelva todas las muestras de RA con papel de aluminio. En el caso de los álamos que se sometieron a un tratamiento de sombreado, coseche las muestras en la oscuridad.
10. Remoje las muestras de AR en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C para su posterior investigación.
11. Coseche los ARs de álamo expuestos a la luz o no expuestos (realizados en la oscuridad) después de envolverlos con papel de aluminio, y almacenarlos a 4 °C para ensayos morfológicos y otros ensayos in situ .

En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo de los patógenos del cancro del tallo que inducen raíces adventicias a través de la inoculación de anillado. Los experimentos realizados aquí mostraron que tanto los patógenos del cancro del tallo, V. sordida, B. dothidea, como sus aislados (de diferentes huéspedes, regiones o patogenicidad) pueden inducir la formación de AR en especies de álamo. En este protocolo, utilizamos los aislados de V. sordida CZC, CFCC86775, y los aislados de B. dothidea SD50 y SD81 para producir ARs en P. alba var. pyramidalis. V sodida El CZC es un patógeno típico utilizado, y se ha depositado en el Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China (CGMCC 40575); Aislado de V. sordida CFCC86775 se compró en el Centro de Recolección de Cultivos Forestales de China, mientras que dos aislados SD se recolectaron de los álamos de la enfermedad del cancro en la provincia de Shandong y se depositaron en nuestro laboratorio. Como se muestra en la Figura 2, se formaron callos en la región de anillado (Figura 2A, panel 1), y se formaron pocos AR en el tratamiento de dorado y eliminación de cambium (Figura 2A, panel 2), mientras que se produjeron raíces rojas y fibrosas después del tratamiento de inoculación con flecinto (Figura 2A, paneles 3-6). También observamos que los ARs fueron inducidos en diferentes especies o clones de álamos, como P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clon 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', u otros álamos híbridos). Sin embargo, en este protocolo, los AR se producen solo en los tallos de P. alba var. pyramidalis de 1 año de edad. Finalmente, como se muestra en el panel 7 de la Figura 2 , también se indujeron estructuras de AR en los troncos de P. alba var. pyramidalis de 6 años de edad después de la inoculación del floema por el patógeno V. sordida. Los diámetros del tronco del álamo son de alrededor de 6-7 cm y la longitud de las raíces fibrosas más largas era superior a 7,0 cm.

Como se muestra en la Figura 2, los segmentos rojos se produjeron en los AR de álamo sombreado después de ser expuestos a la condición de luz solar, desde los AR blancos lechosos o rojos claros producidos en los álamos envueltos en papel de aluminio (Figura 2B, panel 1) hasta los AR rojos 3 días después (Figura 2B, panel 4). Además, también observamos que los pigmentos rojos se producían en un corto período después de la exposición a la luz, y el análisis de la expresión génica ilustró que la biosíntesis de pigmentos (principalmente cianidina-3-O-glucósido) se transformó directamente a partir de sus sustratos de antocianidina, no la nueva biosíntesis desde el comienzo de la ruta metabólica del fenilpropano⁶.

En este protocolo, los dos métodos de anillado (anillado del floema y de la epidermis) pueden inducir la formación de ARs en los tallos del álamo después de la inoculación del patógeno. Se produjeron menos cortavientos y menos influencia en la fisiología (como el transporte de agua y carbohidratos) en los álamos inoculados con el cinturón de la epidermis; sin embargo, parece que la producción de AR es un poco rápida y eficiente en el anillado del floema. Por lo tanto, se recomienda el método de inoculación de anillado del floema en la investigación de los AR del álamo.

Figura 1: El flujo de trabajo esquemático de la formación de raíces adventicias (ARs) inducida por el patógeno del cancro del tallo a través de métodos de inoculación de anillado en álamos. En primer lugar, el patógeno del cancro del tallo (cultivado a 28 °C en oscuridad durante 7-10 días) se cortó en tiras de micelio (1,2 cm de ancho). Los árboles jóvenes de álamo de un año o las ramas de un año se ceñieron en los tallos (a ~ 30 cm por encima del suelo o la base de las ramas, indicado por las flechas azules) mediante dos métodos: anillado del floema (anillado y descarte de los anillos anillados que incluyen epidermis, floema y tejidos parciales del cambium en los tallos) o anillado de la epidermis (anillado y descarte los anillos anillados que solo incluyen la epidermis de los tallos). El ancho del floema ceñido o de los anillos del floema es de 1,0 cm. Luego, las regiones ceñidas se cubrieron por completo con correas de micelio y se envolvieron con cinta de plástico PE de inmediato; Los lados de micelio de la correa miraban hacia la región ceñida. Para la investigación de la biología de las raíces, como la rizogénesis y el desarrollo de las raíces, los retoños/ramas de álamo inoculados se cultivaron durante 14-30 días bajo manejo regular (Vía I, resaltada en flechas amarillas). Para la investigación de la biosíntesis de segmentos, la fotomorfogénesis o la regulación de la expresión de los genes relacionados con la luz, se adoptó una envoltura adicional de papel de aluminio, luego los árboles jóvenes / ramas inoculados se cultivaron ~ 20 días para producir los AR. Cuando se produjeron los AR, se retiró el papel de aluminio de los tallos/ramas, y los ARs de álamo se expusieron a la luz solar u otras condiciones de luz (variadas en el espectro de luz, la intensidad, el período o sus combinaciones) (Vía II, resaltada con flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Los patógenos del cancro del tallo indujeron la formación de raíces adventicias (AR) y la biosíntesis de segmentos en las condiciones de luz de los AR en el álamo. (A) Diferentes patógenos del cancro del tallo inducen la formación de AR en los tallos del álamo. A1: control de anillado; A2: anillado y eliminación de cambium (GR); A3-6: Diferentes patógenos del cancro del tallo (V. sordida y B. dothidea) inducen la formación de RA en plantones de P. alba var. pyramidalis de 1 año de edad; A7: ARs producidos en la rama de P. alba var. pyramidalis, de 6 años. (B) La exposición a la luz induce la biosíntesis de segmentos en los ARs de álamo. B1-B4 representan los AR de álamo expuestos en condiciones de luz a los 0, 1, 2 y 3 días después de la exposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las especies de álamo son aptas para producir ARs o raíces laterales (LRs) a partir de esquejes de tallo, lo que contribuye a su reproducción y como modelo para el estudio de la biología de las raíces en plantas madereras ^7,8. Además, las investigaciones indicaron que la inoculación de microorganismos específicos, como bacterias beneficiosas (Agrobacterium rhizogenes ^9,10; Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal [PGPR]¹¹), las bacterias endófitas^12,13, los hongos micorrízicos arbusculares (HMA)^14,15 o los hongos ectomicorrícicos (EMF)^16,17 podrían promover el crecimiento o desarrollo de las raíces de las plantas. Sin embargo, no se reportó ningún reporte sobre patógenos (ni bacterias ni patógenos fúngicos) que induzcan o promuevan la estructura de los AR en las plantas hospederas.

Los experimentos aquí han demostrado que diferentes patógenos del cancro del álamo (como V. sordida, B. dothidea) podrían inducir la formación de AR en tallos/ramas de álamo (Figura 2A, paneles 3-6). Además, los experimentos mostraron que se podían inducir ARs en diferentes especies/clones de álamo, por ejemplo, árboles jóvenes de 1-2 años de edad de P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clon 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', e incluso ramas de álamo de 6 años (Figura 2A, panel 7). Sin embargo, no se produjo ninguna estructura de ARs en los retoños/ramas de 1 año de edad de Malus spp., Prunus spp., Cedrus deodara y Pinus massoniana. Luego, este protocolo proporcionó una nueva vía de producción de ARs de álamo: la inducción de ARs a través de la inoculación con anillamiento de patógenos fúngicos del cancro de los árboles (V. sordida y B. dothidea) en tallos/ramas de álamo.

Los experimentos también indicaron que tanto el método de anillado del floema como el de la epidermis podrían inducir la formación de AR en los tallos de álamo después de la inoculación del patógeno; Sin embargo, los tallos de álamo después de la inoculación del floema se rompen fácilmente por el viento en los sitios de anillado debido a la disminución significativa de la dureza causada por el anillado y la eliminación de la corteza (floema), la manipulación y la invasión de patógenos. Por lo tanto, para la inducción de los AR, los tallos/ramas de álamo deben estar bien atados a palos para evitar que se rompan, especialmente cuando se utilizó el método de anillado del floema.

Las propias plantas determinan principalmente la formación de AR. Sin embargo, también se ve afectado por algunos factores ambientales. Por ejemplo, los AR pueden ser inducidos en condiciones de anegamiento o inundación en algunas especies de dicotiledóneas^18,19. El mantenimiento de la humedad fue el paso crucial de la inducción de los AR en los tallos/ramas aéreos. En este protocolo, se utilizaron tanto el Parafilm como la película de PE doméstica para la conservación de la humedad. Sin embargo, la envoltura de Parafilm puede ser penetrada por los AR recién formados, causando entonces pérdida de agua, retraso del crecimiento, pardeamiento y lignificaciones de los AR de álamo. Por el contrario, se cosecharon ARs abundantes, tiernos y ricos en agua en los tallos de álamo envueltos en PE. Por lo tanto, se recomendó en este protocolo la película de PE doméstica, no la película Parafilm.

Las raíces son órganos cruciales de las plantas, que desempeñan un papel importante en la reproducción, el crecimiento, los nutrientes y la absorción de agua de las plantas. Luego, los métodos deben utilizarse en el estudio de la rizogénesis²⁰, la morfología y el desarrollo, y la arquitectura del sistema radicular (RSA)²¹ en especies de álamo. Además, las investigaciones indicaron que las asociaciones entre el sistema radicular y las bacterias de la rizosfera podrían mejorar la resistencia a las enfermedades de las plantas hospederas²²; luego, la inoculación de patógenos del cancro anillado debería inducir algunos cambios moleculares y epigenéticos en los ARs del álamo, que tienen una aplicación potencial en el cultivo de plántulas resistentes a enfermedades.

La luz es un factor ambiental crítico que afecta el crecimiento, el desarrollo y la reproducción de las plantas. El experimento de sombreado-exposición (Figura 2B) indicó que los AR de álamo inducidos por patógenos son un sistema experimental ideal para la biosíntesis de segmentos de plantas (flavonoides, antocianinas²³, etc.). Investigaciones previas también demostraron que las condiciones de luz (intensidad, calidad, duración y cantidad expuesta a la planta madre) afectan la formación de raíces o rizogénesis y el desarrollo de raíces adventicias y laterales 24,25,26. Por lo tanto, a través del ajuste fino de las condiciones de iluminación, el sistema de ARs de álamo inducido por patógenos en este protocolo se puede utilizar en la investigación de la biología de las raíces y otros procesos relacionados con la respuesta a la luz de las plantas de álamo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta investigación fue financiada conjuntamente por el Fondo de Investigación Basal de la Institución Científica Central de Interés Público del Laboratorio Estatal Clave de Genética y Mejoramiento de Árboles (subvención número CAFYBB2020ZY001-2) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 32171776) a Jiaping Zhao.