Method Article
* These authors contributed equally
هنا ، نقدم بروتوكولا للحث على إنتاج الجذور العرضية (ARs) من خلال مسار تلقيح مسببات الأمراض الفطرية لحاء أو حزام البشرة ، وهو مناسب لدراسة بيولوجيا الجذر والعمليات الفسيولوجية المرتبطة بالاستجابة للضوء في الحور.
Valsa sordida و Botryosphaeria dothidea هما مسببان للأمراض الفطرية الميتة التي تلحق الضرر بالعديد من المضيفين النباتيين ، وخاصة الأنواع في جنس Populus. يحدث هذان المسببان الفطريان بشكل رئيسي في أغصان الحور والسيقان والأغصان ، مما يسبب أعراضا كلاسيكية مثل آفات الفم وموت المظلة والذبول. تلقيح مسببات الأمراض هو المسار الأكثر فعالية لدراسة آلية أمراض النبات. إلى جانب آفات التقرح حول مواقع التلقيح على السيقان ، لوحظت ظاهرة تنموية جديدة ، وهي جذور عرضية غزيرة (ARs) ذات لون أحمر فاتح ، في أنواع الحور بعد تلقيح مسببات الأمراض الجذعية. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة إحداث ARs باستخدام مسببات الأمراض الفطرية في أشجار الحور. الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي تلقيح مسببات الأمراض بعد التلاعب (اللحاء أو البشرة). الخطوة الثانية الحاسمة هي تطبيق مادة الترطيب. بالمقارنة مع التلاعب بالترطيب باستخدام Parafilm ، فإن تغليف المواقع الملقحة بغلاف بلاستيكي من البولي إيثيلين المنزلي (PE) يمكن أن ينتج عنه ARs ملونة وعديدة وقوية في غضون 20 يوما بعد التلقيح والحقائق. أخيرا ، نبتت ARs البيضاء من الحلقات الملقحة في سيقان الحور بعد معالجة التظليل (لف السيقان بورق الألمنيوم). تقدم هذه الطريقة نظاما تجريبيا جديدا لدراسة تطور الجذور وتكوين الجذور ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم بيولوجيا تطور الجذور والتشكل والاستجابة تحت إجهاد المرض. علاوة على ذلك ، عند دمجها مع معالجة التظليل ، يمكن أن توفر هذه الدراسة نظاما تجريبيا مناسبا للتحقيق في العمليات المتعلقة بالاستجابة للضوء ، على سبيل المثال ، التخليق الحيوي لمركبات الفلافونويد أو الأنثوسيانين أو المستقلبات الأخرى ذات الصلة والجينات أو عوامل النسخ المشاركة في هذه العمليات.
أمراض قرحة جذع الحور التي تسببها مسببات الأمراض الفطرية الميترة ، Valsa sordida و Botryosphaeria dothidea ، هما مرضان حاسمان للأشجار في شمال الصين ألحقا أضرارا بالغة بتطور المزارع البيئية والاقتصادية لأنواع الحور. تحدث أمراض قرحة الحور دائما على لحاء الجذوع والفروع ، في حين أن آفات الفم هي أعراضها النموذجية. بعد ظهور الأمراض ، تسببت آفات الفم المتوسعة في إتلاف اللحاء والكامبيوم ونسيج الخشب تدريجيا للمضيفين. علاوة على ذلك ، أثرت على نقل المنتجات الممتصة والمياه عبر نظام الأوعية الدموية. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف تعيق مسببات الأمراض الآفة نقل اللحاء والخشب الداخلي.
للكشف عن آليات نقل الكربوهيدرات والماء في أشجار الحور المصابة بمسببات الأمراض ، اقترحنا طرق تلقيح اللحاء أو البشرة1،2 ، والتي جمعت بين التلاعب الكلاسيكي بحزام الحديقة وطريقة تلقيح مسببات الأمراض (تلقيح جرح كتلة الفطريات). يمكن لهذه الطرق محاكاة عملية الإصابة وانسداد الماء والكربوهيدرات التي تسببها مسببات الأمراض القرحة.
أوضح بحثنا أن مسببات الأمراض الفطرية تسببت في موت مظلة الحور عن طريق إحداث تجويع الكربون في البداية ، وليس الفشل الهيدروليكي1،3،4،5. والمثير للدهشة أننا لاحظنا وجود جذور خاص على سيقان الحور التي ارتبطت بتلقيح مسببات الأمراض اللاحقة الجذعية: تنمو الجذور العرضية الحمراء الغزيرة (ARs) من الطرف السفلي للسيقان العلوية (مقابل الحافة العلوية لللحاء أو حلقات حزام البشرة). علاوة على ذلك ، أوضحت تجاربنا أن إنتاج ARs عالمي في تفاعل مسببات الأمراض بين الحور والتقرح. يمكن إنتاجها من أنواع الحور أو المستنسخة في أعمار مختلفة (1 أو 2 أو حتى 6 سنوات) ويمكن أن تسببها مسببات الأمراض المختلفة (V. sordida و B. dothidea) أو عزلتها. بالإضافة إلى ذلك ، درسنا آليات ألوان الحور ARs ، وأظهرت النتائج أنها مرتبطة بالتخليق الحيوي للفلافونويد والأنثوسيانين ، بالإضافة إلى تنظيم التعبير الجيني للجينات المرتبطة بالضوء (أو وحدات الجينات) في ظل ظروف الإضاءة6. لذلك ، يمكن استخدام هذه الحور ARs التي تسببها مسببات الأمراض كنظام تجريبي مستقر ومثالي لدراسة التفاعل بين مسببات الأمراض النباتية ، وبيولوجيا الجذر ، ووظيفة الجينات المرتبطة بالضوء والتعبير عنها.
في هذه الدراسة ، سنقدم ونوفر البروتوكول لإنشاء نظام تجريبي للحور ARs من خلال مسار التلقيح الحزاد. علاوة على ذلك ، نشير إلى العوامل الحاسمة التي تؤثر على تكوين ARs ونشرح التطبيق المحتمل للتلقيح الحزامي في دراسة بيولوجيا جذر الحور والعمليات الفسيولوجية الأخرى المتعلقة بالاستجابة للضوء.
1. تحريض الحور ARs من خلال التلقيح
2. إنشاء نظام تجريبي لأبحاث الجينات المرتبطة بالضوء من خلال طريقة التلقيح الحزامي
يظهر في الشكل 1 سير عمل مسببات الأمراض الجذعية التي تحفز الجذور العرضية من خلال التلقيح الحزامي. أظهرت التجارب التي أجريت هنا أن كلا من مسببات الأمراض الجذعية ، V. sordida ، B. dothidea ، وعزلاتها (من مضيفين أو مناطق أو إمراضية مختلفة) يمكن أن تحفز تكوين ARs في أنواع الحور. في هذا البروتوكول ، استخدمنا V. sordida عزل CZC ، CFCC86775 ، و B. dothidea يعزل SD50 و SD81 لإنتاج ARs في P. alba var. الهرماليس. V سوديدا CZC هو عامل ممرض نموذجي يستخدم ، وقد تم ترسيبه في مركز تجميع الثقافة الميكروبيولوجية العامة في الصين (CGMCC 40575) ؛ V. سورديدا عزل تم شراء CFCC86775 من مركز تجميع ثقافة الغابات الصيني ، بينما تم جمع عزلتين من SD من أشجار الحور بمرض التقرح في مقاطعة شاندونغ ، وتم إيداعهما في مختبرنا. كما هو موضح في الشكل 2 ، تشكل الكالس في منطقة الحزم (الشكل 2 أ ، اللوحة 1) ، وتشكل عدد قليل من ARs على التذهيب ومعالجة إزالة الكامبيوم (الشكل 2 أ ، اللوحة 2) ، بينما تم إنتاج الكثير من الجذور الليفية الحمراء بعد علاج التلقيح بحزام اللحاء (الشكل 2 أ ، الألواح 3-6). لاحظنا أيضا أن ARs تم إحداثها في أنواع مختلفة من الحور أو المستنسخة ، مثل P. alba var. pyramidalis ، Populus × beijingensis ، P. alba × P. tremula var. استنساخ glandulosa 84K ، P. euramericana cv. "Bofeng 3" ، أو أشجار الحور الهجينة الأخرى). ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم إنتاج ARs فقط على سيقان P. alba var. الهرماليس. أخيرا ، كما هو موضح في الشكل 2 لوحة 7 ، تم تحفيز هياكل ARs أيضا في جذوع P. alba var. pyramidalis البالغة من العمر 6 سنوات بعد تلقيح اللحاء بواسطة العامل الممرض V. sordida. يبلغ طول جذع الحور حوالي 6-7 سم وطول أطول جذور ليفية أطول من 7.0 سم.
كما هو موضح في الشكل 2 ، تم إنتاج الأجزاء الحمراء في تظليل الحور ARs بعد تعرضها لظروف أشعة الشمس ، من ARs البيضاء اللبنية أو الحمراء الفاتحة المنتجة على أشجار الحور الملفوفة بورق الألمنيوم (الشكل 2 ب ، اللوحة 1) إلى ARs الحمراء بعد 3 أيام (الشكل 2 ب ، اللوحة 4). علاوة على ذلك ، لاحظنا أيضا أن الأصباغ الحمراء تم إنتاجها في فترة قصيرة بعد التعرض للضوء ، وأوضح تحليل التعبير الجيني أن التخليق الحيوي للأصباغ (بشكل أساسي السيانيدين -3-O-glucoside) قد تحول مباشرة من ركائز الأنثوسيانيدين ، وليس التخليق الحيوي الجديد من بداية مسار التمثيل الغذائي فينيل بروبان6.
في هذا البروتوكول ، يمكن أن تؤدي كلتا طريقتي الحزام (اللحاء وحزام البشرة) إلى تكوين ARs على سيقان الحور بعد تلقيح مسببات الأمراض. حدثت مصدات رياح أقل وتأثير أقل على علم وظائف الأعضاء (مثل نقل الماء والكربوهيدرات) في أشجار الحور الملقحة بالبشرة. ومع ذلك ، يبدو أن إنتاج ARs سريع وفعال بعض الشيء في حزام اللحاء. لذلك ، يوصى باستخدام طريقة تلقيح حزام اللحاء في أبحاث الحور ARs.
الشكل 1: سير العمل التخطيطي لتكوين الجذور العرضية (ARs) الناجم عن مسببات الأمراض القرحة الجذعية من خلال طرق التلقيح في أشجار الحور. أولا ، تم تقطيع مسببات الأمراض القرحة الجذعية (المزروعة عند 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 7-10 أيام) إلى أحزمة فطرية (بعرض 1.2 سم). تم ربط شتلات الحور البالغة من العمر عاما واحدا أو الأغصان البالغة من العمر عاما واحدا على السيقان (على ارتفاع ~ 30 سم فوق الأرض أو قاعدة الفروع ، المشار إليها بالسهام الزرقاء) من خلال طريقتين: حزام اللحاء (ربط والتخلص من الحلقات المزخرفة التي تشمل البشرة واللحاء وأنسجة الكامبيوم الجزئية على السيقان) أو حزام البشرة (ربط الحلقات المزبدة والتخلص منها والتي تشمل فقط بشرة السيقان). عرض حلقات اللحاء أو اللحاء 1.0 سم. بعد ذلك ، تمت تغطية المناطق المغطاة بالكامل بأشرطة الفطريات ولفها بشريط بلاستيكي PE على الفور ؛ واجهت جوانب الفطريات من الشريط المنطقة المحزنة. لأبحاث بيولوجيا الجذر ، مثل تكوين الجذور وتطور الجذور ، تمت زراعة شتلات / فروع الحور الملقحة لمدة 14-30 يوما تحت الإدارة المنتظمة (المسار الأول ، مظلل بالأسهم الصفراء). لبحث التخليق الحيوي للأجزاء ، أو التكوين الضوئي ، أو تنظيم التعبير عن الجينات المرتبطة بالضوء ، تم اعتماد غلاف إضافي لورق الألمنيوم ، ثم تمت زراعة الشتلات / الفروع الملقحة ~ 20 يوما لإنتاج ARs. عندما تم إنتاج ARs ، تمت إزالة رقائق الألومنيوم من السيقان / الفروع ، وتعرضت ARs الحور تحت أشعة الشمس أو ظروف الإضاءة الأخرى (تختلف في طيف الضوء أو شدتها أو الفترة أو مجموعاتها) (المسار الثاني ، المميز في الأسهم الحمراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تسببت مسببات الأمراض في آفة الساق في تكوين جذور عرضية (ARs) وأجزاء التخليق الحيوي في ظروف الإضاءة من ARs في الحور. (أ) تحفز مسببات الأمراض المختلفة من آفة الساق تكوين AR في سيقان الحور. A1: التحكم في الحزام. A2: إزالة الحيز والكامبيوم (GR); A3-6: مسببات الأمراض المختلفة من آفة الساق (V. sordida و B. dothidea) تحفز تكوين AR في P . alba var. الشتلات الهرمية. A7: ARs المنتجة على فرع P. alba var. الهرماليس. (ب) يؤدي التعرض للضوء إلى التخليق الحيوي للأجزاء الموجودة على الحور ARs. يمثل B1-B4 حور ARs المكشوفة في ظروف الإضاءة في 0 و 1 و 2 و 3 أيام بعد التعرض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أنواع الحور مناسبة لإنتاج ARs أو الجذور الجانبية (LRs) من قصاصات الساق ، مما يساهم في تكاثرها وكنموذج لدراسة بيولوجيا الجذر في نباتات الخشب7،8. علاوة على ذلك ، أشارت الأبحاث إلى أن تلقيح الكائنات الحية الدقيقة المحددة ، مثل البكتيريا المفيدة (Agrobacterium rhizogenes9،10; يمكن أن تعزز البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات [PGPR] 11) ، وبكتيريا النباتاتالداخلية 12،13 ، والفطريات الفطرية الشجرية (AMF) 14،15 أو الفطريات الفطرية الخارجية (EMF) 16،17 نمو أو تطور جذور النباتات. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي تقرير عن مسببات الأمراض (لا البكتيريا ولا مسببات الأمراض الفطرية) التي تحفز أو تعزز بنية ARs على النباتات المضيفة.
أظهرت التجارب هنا أن مسببات الأمراض المختلفة لتقرح الحور (مثل V. sordida ، B. dothidea) يمكن أن تحفز تكوين ARs في سيقان / فروع الحور (الشكل 2 أ ، الألواح 3-6). علاوة على ذلك ، أظهرت التجارب أنه يمكن إحداث ARs على أنواع / نسخ مختلفة من الحور ، على سبيل المثال ، شتلات عمرها 1-2 سنة من P. alba var. pyramidalis ، Populus × beijingensis ، P. alba × P. tremula var. استنساخ glandulosa 84K ، P. euramericana cv. "Bofeng 3" ، وحتى أغصان الحور البالغة من العمر 6 سنوات (الشكل 2 أ ، اللوحة 7). ومع ذلك ، لم يتم إنتاج أي هيكل ARs على الشتلات / الفروع البالغة من العمر عاما واحدا من Malus spp. و Prunus spp. و Cedrus deodara و Pinus massoniana. بعد ذلك ، قدم هذا البروتوكول مسارا جديدا لإنتاج الحور ARs: تحفيز ARs من خلال التلقيح الحزامي لمسببات الأمراض الفطرية للأشجار (V. sordida و B. dothidea) على سيقان / فروع الحور.
أشارت التجارب أيضا إلى أن كلا من طرق ربط اللحاء والبشرة يمكن أن تحفز تكوين ARs على سيقان الحور بعد تلقيح مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإن سيقان الحور بعد تلقيح اللحاء تنكسر بسهولة الرياح في مواقع الحزام من أجل الانخفاض الكبير في الصلابة التي تسببها التلاعب باللحاء (اللحاء) وإزالة اللحاء ، وغزو مسببات الأمراض. لذلك ، بالنسبة لتحريض ARs ، يجب ربط سيقان / فروع الحور جيدا بالعصي لمنعها من الانكسار ، خاصة عند استخدام طريقة حزام اللحاء.
تحدد النباتات نفسها بشكل أساسي تكوين ARs. ومع ذلك ، فإنه يتأثر أيضا ببعض العوامل البيئية. على سبيل المثال ، يمكن تحفيز ARs في ظروف التشبع بالمياه أو الفيضانات في بعض أنواع dicot18،19. كان الحفاظ على الرطوبة هو الخطوة الحاسمة لتحريض ARs على السيقان / الفروع الموجودة فوق سطح الأرض. في هذا البروتوكول ، تم استخدام كل من Parafilm وفيلم PE المنزلي للحفاظ على الرطوبة. ومع ذلك ، يمكن اختراق غلاف Parafilm بواسطة ARs المشكلة حديثا ، ثم يتسبب في فقدان الماء ، وتأخير النمو ، والتحول إلى اللون البني ، وتقشير الحور ARs. على العكس من ذلك ، تم حصاد ARs الوفيرة والعطاء والغنية بالمياه في سيقان الحور الملفوفة ب PE. لذلك ، تمت التوصية بفيلم PE المنزلي ، وليس فيلم Parafilm ، في هذا البروتوكول.
الجذور هي أعضاء مهمة للنباتات ، وتلعب أدوارا مهمة في التكاثر والنمو والمغذيات وامتصاص الماء للنباتات. ثم يجب استخدام الطرق في دراسة تكوين الجذور20 ، والتشكل والتطور ، وبنية نظام الجذر (RSA) 21 في أنواع الحور. علاوة على ذلك ، أشارت الأبحاث إلى أن الارتباطات بين نظام الجذر وبكتيريا الجذور يمكن أن تحسن مقاومة الأمراض للنباتات المضيفة22. بعد ذلك ، يجب أن يؤدي تلقيح مسببات الأمراض إلى بعض التغييرات الجزيئية والجينية في الحور ARs ، والتي لها تطبيق محتمل في زراعة الشتلات المقاومة للأمراض.
الضوء هو عامل بيئي حاسم يؤثر على نمو النبات وتطوره وتكاثره. أشارت تجربة التعرض للتظليل (الشكل 2 ب) إلى أن الحور ARs التي يسببها العامل الممرض هي نظام تجربة مثالي للتخليق الحيوي لأجزاء النبات (مركبات الفلافونويد ، الأنثوسيانين23 ، إلخ). أوضحت الأبحاث السابقة أيضا أن ظروف الضوء (الشدة والجودة والمدة والكمية المعرضة للنبات الأم) تؤثر على تكوين الجذور أو تكوين الجذور وتطور كل من الجذور العرضية والجانبية24،25،26. لذلك ، من خلال الضبط الدقيق لظروف الإضاءة ، يمكن استخدام نظام الحور ARs الناجم عن مسببات الأمراض في هذا البروتوكول في أبحاث بيولوجيا الجذر والعمليات الأخرى المتعلقة بالاستجابة للضوء لنباتات الحور.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا البحث بشكل مشترك من قبل المؤسسة العلمية المركزية للمصلحة العامة ، صندوق البحوث الأساسية التابع للمختبر الرئيسي الحكومي لعلم الوراثة والأشجار (المنحة رقم CAFYBB2020ZY001-2) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32171776) إلى Jiaping Zhao.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar | Solarbio | A8190 | Provide nutrition for fungal growth |
Aluminum foil | biosharp | BS-QT-027B | To provide shading for the infected area |
Girdling knife | MoGong Hardware tool firms | Girdle the epidermis of poplar stems/branches | |
Grafting tape | CAPI | 5cm | To fix fungi on the plants |
PD (Potato extraction, Dextrose) | Solarbio | P7360 | Provide nutrition for fungal growth |
PE plastic film | MiaoJie | 413703 | To fix fungi on the plants |
Petri dishes | Bkman biological Co.,Ltd | 90mm | Prepare the PDA medium |
Thermostatic incubator | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Provide an environment for fungal growth |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved