Подавление

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Подавление в BRCA2 белка-супрессора опухоли и ее детектирования обычными биохимических анализов представляют собой большую техническую проблему из-за большого размера человеческого белка BRCA2 (приблизительно 390 кДа). Мы сообщаем модификации стандартных киРНК трансфекции и иммуноблоттинга протоколов, чтобы заставить замолчать человека BRCA2 и выявления эндогенной BRCA2 белок, соответственно, в клеточных линиях человека эпителиальных. Основные шаги включают в себя высокую миРНК соотношение реагентов трансфекции и два последующих раундов миРНК трансфекции в пределах того же эксперимента. Используя эти и другие модификации стандартного протокола мы последовательно достичь более 70% молчание гена BRCA2 человека, о чем судили с помощью иммуноблоттинга анализ с анти-антителами BRCA2. Кроме того, денатурации клеточных лизатов при 55 ° С вместо обычных 70-100 ° С и других технических оптимизации процедуры иммуноблоттинга позволяют обнаружение интактного белка BRCA2 даже WHан очень низких количеств исходного материала доступны, или когда уровни экспрессии белка BRCA2 очень низки. Эффективное глушение BRCA2 в клетках человека предлагает ценную стратегию, чтобы разрушить функцию BRCA2 в клетках с интактным BRCA2, в том числе опухолевых клеток, для изучения новых молекулярных путей и клеточные функции, которые могут быть затронуты патогенных мутаций BRCA2 в опухоли. Адаптация этого протокола для эффективного молчания и анализа других «больших» белков, таких как BRCA2 должны быть легко достижимы.

BRCA2 (рак молочной железы ген восприимчивости-2) ген кодирует белок-супрессор опухоли, который играет решающую роль в восстановлении ДНК двухцепочечной разрывы путем регулирования функцию рекомбиназы фермента Rad51 ^1. BRCA2 также вовлечен в модулирование транскрипции и в контроле клеточного цикла ^2. Зародышевой линии мутации в гене BRCA2 вызывают аутосомно-доминантный восприимчивость к рака груди и яичников у женщин и рака простаты у мужчин, а также предрасположенность к другим типам рака ^3,4. Тем не менее, несмотря на повышенный риск развития рака в BRCA2 мутации, которые подавляют или уменьшить функцию BRCA2 может оказать раковые клетки более уязвимыми для химиотерапевтических агентов, которые вызывают повреждение ДНК ^5-7. Отдельные виды рака обладают низкой скорости BRCA2 мутации (<3%), хотя более низкие уровни белка BRCA2 были обнаружены в некоторых видах рака, предполагая, что BRCA2 белокмогут быть потеряны во время онкогенеза в спорадических рака через не-мутационный-зависимых механизмов ^7,8. Таким образом, важно, чтобы полностью понять функции BRCA2 в контексте биологии рака, а также в других биологических параметрах.

Мощный инструмент, используемый для идентификации новых функций гена в клетках млекопитающих является, чтобы заглушить ее экспрессию. В качестве примера, глушителей BRCA2 выражение в различных нормальных эпителиальных клеток недавно привели к идентификации нового функцией BRCA2 как регулятора сопротивления anoikis, важный шаг в процессе приобретения раковых клеток инвазивного и метастатического способности ^9. Молчание генов может быть достигнуто путем введения в клетки либо мала вмешательства (SI) РНК или короткое шпильки (SH) молекулы РНК, нацеленные на конкретный ген. Высокая активность миРНК и простота в использовании делают его преимущественное инструмент для глушителей эксперименты, направленные на получение новых идей в критических биологических процессовго по идентификации новых терапевтических мишеней. Тем не менее, эффективность нокдаун экспрессии генов может быть легко достижимо для всех генов и может быть сильно варьирует в зависимости от типа клеток. Потому что снижение внутриклеточного уровня белка является наиболее актуальны фенотип под следствием, он имеет решающее значение для количественной оценки гена молчание иммуноблоттингом анализ генного продукта. С этой связи, белок BRCA2 представляет собой еще одну проблему: быть большой белок (примерно 390 кДа), технические трудности существуют для обычного биохимического анализа, в том числе иммуноблоттинга.

Мы сообщаем здесь протокол, оптимизированный для эффективного глушителей BRCA2 в клеточных линиях человека эпителиальных и для быстрого и успешного обнаружения BRCA2 белка нокдаун иммуноблоттингом анализ.

1. Готовят растворы миРНК

1. Ресуспендируют 5 нмоль зашифрованным (Ctrl) и 5 нмоль BRCA2 миРНК высушенных гранул в 100 мкл РНКазы воды (конечная концентрация миРНК: 50 мкм). Это запас миРНК и должны храниться при -20 ° C в 10 мкл аликвоты.
2. Возьмем аликвоту 10 мкл из запаса миРНК и добавить 40 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить рабочий раствор 10 мкМ миРНК. Это разбавление необходимо хранить при температуре -20 ° С до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: рабочий раствор миРНК не должны подвергаться замораживанию / размораживания более чем в 3 раза.

2. Посев человека эпителиальных клеточных линиях

1. Удалить ростовой среды из эпителиальных клеточных линий человека растущих в клеточных монослоев в тканевых культуральных планшетах в увлажненном инкубаторе при 37 ° С, 5% СО _2.
2. Промыть клетки в тарелке с раз RT PBS (10 мл PBS для 100 мм пластины).
3. Для отделения клеток от пластины,добавляют 2 мл 0,25% трипсина / 0,53 мМ раствора ЭДТА и инкубировать 3-5 мин в зависимости от типа клеток.
4. Перед сбором отдельные клетки, нейтрализации трипсина добавлением 2 мл полной среды для роста, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.
5. Передача клеток в 15 мл пробирку.
6. Центрифуга клеток при 320-330 мкг в течение 3 мин при 4 ° С в роторе Бакет.
7. Ресуспендируют клеточный пеллет в 5 мл антибиотиков среде без.
8. Граф клеток под микроскопом в камере Бюркера или с помощью автоматизированной системы подсчета в соответствии с инструкциями изготовителя.
9. Семенной клеток в 6-луночных планшетах, что около 80% сплошности, после 24 часов (0,5-1 x10 ⁶ клеток в 2 мл среды для каждой лунки). Оптимальное количество клеток, чтобы быть посеяны может изменяться в зависимости от конкретных клеточных линий и скорости роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте антибиотики в среде в данный момент, потому что антибиотики негативно влиять на эффективность transfeие. Очень важно, что клетки при низких проходов культуры (<10) для достижения высокой эффективности трансфекции миРНК BRCA2.

3. трансфекции клеток с миРНК

1. Двадцать четыре часа после посева клеток, переходите с первого раунда трансфекции.
   1. Развести 6 мкл липидного основе ¹⁰ siРНК, специфичную реагента для трансфекции в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
   2. Развести 3 мкл 10 мкМ миРНК (30 пмоль) в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
   3. Смешайте разбавленный миРНК разбавленным трансфекции реагента и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
   4. Во время инкубации, удалить носитель из клеток и добавить 2 мл свежей среды, предварительно нагретой при 37 ° С (без антибиотиков).
   5. Добавить 250 мкл миРНК-реагента для трансфекции комплексов к клеткам (эта сумма для одной лунке 6-луночного планшета с).
   6. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 3776; С с 5% СО _2.
2. После 24 часов, приступить втором туре трансфекции, повторяя шаги 3.1.1-3.1.5 со следующей модификацией для шага 3.1.2: разбавить 5 мкл 10 мкМ миРНК (50 пмоль) в 130 мкл восстановленного среды в сыворотке крови.
   1. Инкубируйте клетки в течение 1-2 дней при 37 ° С перед анализом.
      Примечание: Два раунда трансфекции и использование соотношении реагентов высокой миРНК / трансфекции во втором туре необходимы, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания.

4. Lyse клетки для анализа иммуноблоттинга

1. Приготовьте свежий лизирующего буфера с PBS (рН 7,4), содержащего 1% неионных, неденатурирующем моющего октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 5 мМ пирофосфата натри, 1 мМ ортованадат натрия, 10 мМ фторид натрия, 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина. Держите его на льду.
2. Удалить среду из клеток и Wпепел их один раз холодным PBS (2 мл / лунку) в пластине. Для предотвращения уноса PBS, полностью удалить его из пластины.
3. Добавить 200 мкл буфера для лизиса в каждую лунку.
   Примечание: Если клетки должны быть использованы и для других анализов, Trypsinize клетки, как описано в шаге 2.1-2.6 и ресуспендирования клеток в соответствующем буфере / среде в соответствии с применением, которые будут использоваться.
4. Осторожно повернуть пластину, чтобы равномерно распределить лизирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С на ротатора.
5. Собирают клеточный лизат в микроцентрифужных трубки на льду с помощью мобильного скребок.
6. Центрифуга при 17900 х г в течение 25 мин при 4 ° С и собирают супернатант в новую пробирку.
7. Измерьте концентрацию белка, используя имеющийся в продаже анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. BRCA2 анализ иммуноблотинг

1. Подготовьте работает буфер разбавления 50 мл 20x Трис-ацетат SDS работает бuffer (50 мМ Трицин, 50 мМ Трис-основание, 0,1% SDS, рН 8,24) с 950 мл дистиллированной воды.
2. Подготовка образца следующим образом: добавить 15 мкг общего клеточного лизата, 5 мкл 4х буфера для образцов, содержащих сульфат лития додецил при рН 8,4, 2 мкл 10Х образца восстановителем (0,5 М DTT) и буфера для лизиса до конечного объема 20 мкл.
   Примечание: Этот протокол позволяет обнаруживать BRCA2 в нормальных клеточных линиях также при использовании меньшего количества суммарных белков (до 5 мкг).
3. Денатурации образцов при 55 ° С в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы использовать 55 ° C. Так BRCA2 белок термочувствительный ^11, выше денатурации температура приводит к последовательной потере неповрежденной полной длины (390 кДа) BRCA2 белка.
4. Установите камеру электрофоретическую в соответствии с инструкциями изготовителя.
5. Загрузите образцы и 10 мкл с высокой молекулярной массой предварительно окрашенных белкового стандарта на precasted геля (Трис-ацетат 3-8%) и работать на 120 В для ABиз 2 ч ^12. Остановите электрофоретическую пробег, прежде чем 55 кДа синий маркер оставляет precasted гель.
6. Подготовка буфера передачи 50 мл 20x буфера передачи, 100 мл 100% метанола и 850 мл воды.
7. Активация PVDF мембрану (размер пор 0,45 мкм) путем замачивания в 100% метаноле в течение 5 мин, промыть дистиллированной водой и уравновешивают в буфере передачи, по меньшей мере в течение 5 мин. Замачивание губки передачи аппарата в буфере передачи при 4 ° С до использования.
8. При электрофоретического запустить закончилась, собрать бутерброд в стеке передачи в следующем порядке (снизу вверх): три губки, насыщенные в передаче буфера, один сорт 3 мм лист бумаги насыщен передачи буфера, геля, активированного PVDF мембрану, один 3ММ оценка лист бумаги насыщен передачи буфера, три губки насыщен передачи буфера ^13,14. Поместите стопку в устройство и передача белков при 350 мА в течение 4 ч при 4 ° С или при 180 мА в течение ночи при 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существо BRCA2 очень большой белок, важно, чтобы продлить время передачи от 1 часа (как было предложено производителем и большинство протоколов передачи) до 4 часов или на ночь, чтобы обеспечить полную передачу белков высокой молекулярной массой. Кроме того, из-за длительного времени передачи, важно, чтобы выполнить блоттинга в холодной комнате при 4 ° С, чтобы свести к минимуму перегрев и облегчить сэндвич разборки. Полусухие системы передачи не хорошо для передачи больших белков.
9. После передачи, мыть мембрану с TBS, блокируют его в течение 1 часа при комнатной температуре в TBS-Tween 0,25% (TBS-T), содержащей 5% обезжиренное сухое молоко и зонд в течение ночи при 4 ° С с 30 мкл анти-BRCA2 поликлональное антитело кролика ( 200 мкг / мл), разводили в 9 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко [1: 300 (объем / объем) разбавления].
10. Промыть мембраны три раза (10 мин каждый) с TBS-T, затем инкубируют фильтр в течение 1 часа с 1 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена анти-кроличьего вторичного антитела разбавленных в 10 мл TBS-T + 5% обезжиренное сухое молоко. После этого промойте мембрану три раза (10 минут каждый) с TBS-T.
11. Выполните иммунологического по ECL выявить BRCA2 белок с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) Вестерн-блоттинга обнаружения реагента, следуя инструкциям изготовителя. Представьте immunochemiluminescent полосы на высокой разрешающей ECL фильмов.
12. Выполнение иммунологического с антителом для гена домашнего хозяйства, как β-тубулина (55 кДа), в тот же фильтр в качестве контроля загрузки с помощью моноклонального антитела к β-тубулина разбавленный в соотношении 1: 1000 (10 мкл анти-тубулина антителами в 10 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть и инкубируют вторичное антитело, как описано в BRCA2 (5.10-5.11), для использования конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши вместо анти-кроличьего вторичного антитела, за исключением.
13. Приобретите цифровое изображение фильмов впечатлен immunochemiluminescent полос и анализа интенсивности полосы программного обеспечения для анализа изображений выделенный (например,., ImageJ).

Прежде чем приступить к биологической / биохимической анализе для изучения влияния BRCA2 молчания на клеточных функций, первым шагом является подтверждение специфичности молчания, используя зашифрованный миРНК (ненацеливании миРНК) бок о бок с BRCA2 миРНК (рис 1A ). Важно выполнить второй раунд миРНК трансфекции с высокой степенью миРНК / трансфекции, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания. Действительно, выполняя только один раунд миРНК трансфекции или с использованием меньшего миРНК соотношение трансфекции во втором туре (25 пмоль миРНК и 6 мкл реагента для трансфекции) приведет к снижению эффективности нокдаун (рис 1B). Второй этап заключается в оценке оптимального минимальное время, чтобы получить самый высокий уровень сайленсинга. В зависимости от типа клеток, это может варьироваться между 24 и 48 ч после второго тура миРНК трансфекции. Например, 24 часа в сутки достаточно для клеток щитовидной железы Nthy но до 48ч необходимы для эффективного BRCA2 нокдаун в PNT1A клеток предстательной железы (рис 2А). BRCA2 молчание является довольно стабильным до 7 дня после второго цикла трансфекции (рис 2B). Следует отметить, денатурации клеточных лизатов при температуре выше 55 ° C (100 ° C в течение 5 мин), приводит к до 50% потери белка BRCA2 (рис 2С), в связи с термочувствительность BRCA2 ^11.

Как только установлено оптимальное время молчание, эффекты потери BRCA2 белка может быть использована в нескольких анализов. Так мутаций в естественных условиях, которые вызывают потерю функции BRCA2 способствуют повышенной чувствительности к ингибиторам PARP, а также с другими химиотерапевтическими препаратами, которые вызывают повреждение ДНК ^15-18, общий анализ, чтобы определить чувствительность BRCA2 -silenced клеток к ингибитора PARP rucaparib или oloparib. В эксперименте сообщается на рисунке 3, PNT1A клетки истощаются OF белок BRCA2 через миРНК были обработаны 10 мкм rucaparib в течение 24 ч, после чего пролиферация клеток было оценено МТТ на основе анализа клеточной пролиферации. Истощение результатов BRCA2 белка в зависимости от времени снижения пролиферации клеток после лечения rucaparib (рис 3).

Рисунок 1. Два раунда трансфекции и высокой миРНК в соотношении реагентов трансфекции улучшить BRCA2 молчание. () Специфика BRCA2 молчания было подтверждено в Nthy клеток иммуноблоттингом анализ 24 ч после второго тура трансфекции, используя зашифрованный миРНК (Ctrl) в качестве контроля для сравнения уровней BRCA2 белка. Маркеры молекулярной массы приведены с левой стороны. (B) PNT1A клетки подвергали 1 или 2 циклов BRCA2 сIRNA трансфекции, как описано в протоколе [циклов (#) 1 и 2] и BRCA2 Белок истощение количественно с помощью иммуноблоттинга. Были использованы два цикла трансфекции с яичницей миРНК в качестве контроля (Ctrl). В 2b, PNT1A клетки подвергали двум циклам BRCA2 миРНК трансфекции с использованием меньшего миРНК соотношение реагента для трансфекции во втором цикле как модификация (25 пмоль миРНК / 6 мкл реагента для трансфекции). Во всех случаях уровни BRCA2 белка были проанализированы 48 ч после второго цикла. В нижней части, количественное содержание белков BRCA2 сообщается как отношение BRCA2 / ТУБУЛИН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Оптимизация BRCA2 нокдаун. () Оптималь BRCA2 нокдаун может потребоваться от 24 до 48 ч после второго цикла миРНК трансфекции. Два различных клеточных линий (PNT1A и Nthy) были оценены на BRCA2 нокдаун 24 ч и 48 ч после второго цикла миРНК трансфекции иммуноблоттингом анализ. В нижней части, уровни белка BRCA2 сообщается в процентах от уровня в момент времени 0 ч, установленный на 100. Данные представляют собой среднее ± SE трех независимых экспериментов. (Б) BRCA2 нокдаун стабильна в течение 7 дней. PNT1A клетки не были оценены по BRCA2 нокдаун, пока 196 ч после второго миРНК трансфекции цикла иммуноблоттингом. Отношение BRCA2, чтобы тубулина сигнала сообщается в нижней части. (C) белок BRCA2 термочувствительного. Номера трансфицированные PNT1A клетки собирали через 24 ч после посева (около 70% слияния) и лизируют в соответствии с протоколом. Два аликвоты же лизата клеток (15 мкг общего белка) денатурируют либо при 55 ° С в течение 10 мин или при 100 & #176; С в течение 5 мин и BRCA2 белковых уровней были оценены с помощью иммуноблоттинга. В нижней части, отношение к BRCA2 тубулина сигнала сообщается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. BRCA2 молчание увеличивает чувствительность клеток к ингибитором PARP rucaparib. PNT1A клетки трансфицировали либо контролем (Ctrl), или BRCA2 миРНК были собраны через 48 часов после трансфекции и высевали в 96-луночный планшет (2000 клеток / лунку). Через 24 часа, 10 мкМ rucaparib был добавлен в клетках в течение 24 ч, после чего клетки были сохранены в отсутствии препарата до 96 ч. Пролиферации клеток оценивали в указанное время с помощью МТТ путем измерения оптической плотности при 550 - 690 нм. Для комфортач Время точка представляет среднее ± SD трех скважин из репрезентативного эксперимента. Ctrl миРНК, синяя линия; BRCA2 миРНК, красная линия. В верхней части, белковый профиль BRCA2 в BRCA2 миРНК-трансфицированных клеток сообщается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Потому что зародышевые мутации гена BRCA2 приводят к увеличению риска некоторых видов рака, в том числе женского и мужского рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, меланомы и ^3,4, ряд исследований были предприняты, чтобы понять биологическую функцию белка BRCA2. Большинство из этих исследований являются генетическими основе, главным образом, из-за технических трудностей в анализе гигантский белок BRCA2, как. Метод, описанный здесь для глушителей и анализа экспрессии гена BRCA2 белка обеспечивает эффективный инструмент для расследования функции гена супрессора опухолей BRCA2 в широком спектре биологических анализов. Протокол молчание основаны на стандартных процедур трансфекции миРНК еще содержит несколько важных изменений, а также советы для успешного и последовательного нокдаун BRCA2. Протокол трансфекции миРНК является безопасным, быстрым и эффективным, и, в отличие от shRNA, которые, как правило, делает использование Lentiviral векторы, не имеет специальных процедур биологической безопасности и может быть легко выполнена в любой лаборатории, оборудованной объекта культуры клеток. Точно так же, протокол иммуноблотинг был оптимизирован для эффективного обнаружения большого белка как BRCA2. Протокол иммуноблоттинга было также подтверждено для обнаружения рекомбинантного человеческого белка BRCA2 гетерологично выраженной в клетках дрожжей ^9.

Несколько важных факторов для эффективной доставки миРНК сообщается здесь. Они включают в себя два цикла трансфекции и высокую миРНК соотношение реагента для трансфекции, особенно во втором цикле. Отсутствие антибиотиков до и во время процедуры трансфекции является еще одним важным фактором. Тем не менее, эта процедура подвергает клеток в культуре с повышенным риском бактериального заражения; Таким образом, дополнительные меры предосторожности должны быть приняты, чтобы гарантировать высокий уровень стерильности на всех этапах. Следует отметить, что в зависимости от типа клеток, эффективно гена knockdoWn, как правило, требует 24-48 ч после второго цикла. Текущий метод имеет то преимущество, что ген глушителей достаточно стабильным, по крайней мере до 7 дней после второго цикла трансфекции. Это позволяет исследовать эффекты BRCA2 нокдауна в различных биологических анализов, в том числе клеточного ответа на различных химиотерапевтических препаратов. Однако ограничение настоящего техники представлен на то, что экзогенные молекулы миРНК не интегрированы в геном, таким образом, стабильны нокдаун экспрессии генов не может быть достигнута. Кроме того, чтобы получить стабильный нокдаун, shRNA лентивирусный инфекция может быть выполнена при условии, что лаборатория подготовлена ​​для дополнительных требований биобезопасности (стандартов BSL-2 в соответствии с руководящими принципами NIH). Кроме того, при трансфекции не применимо подход к изучению функции генов в конкретных типов клеток (например., Т-лимфоциты), использование мышей с нокаутом условное BRCA2 соты остается только чередующеесятельной ^19.

Этот метод также отчеты несколько советов для успешного обнаружения веса белка высокой молекулярной иммуноблоттингом и она подходит для высоких, так и низких белков изобилии. В частности, из-за термочувствительности белка BRCA2, ниже температуры денатурации является критическим для его оптимального обнаружения, в соответствии с предыдущего исследования ^11. Этот технический 'трик "также могут быть полезны для других белков, для которых обнаружение с помощью стандартных протоколов иммуноблоттинга был оказались безуспешными. Мы ожидаем, что этот метод содержит советы общего действия и, таким образом, может способствовать молчание и обнаружение многих других захватывающих белков.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.