のサイレンシング

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

従来の生化学的分析による腫瘍抑制タンパク質BRCA2とその検出のサイレンシングは、ヒトのBRCA2タンパク質（約390キロダルトン）のサイズが大きいために大きな技術的課題を表します。我々は、ヒト上皮細胞株において、それぞれ、ヒトのBRCA2を沈黙し、内因性BRCA2タンパク質を検出するための標準的なsiRNAトランスフェクションおよびイムノブロッティングのプロトコルの変更を報告しています。重要なステップは、トランスフェクション試薬の比が高いsiRNAを、同じ実験内のsiRNAトランスフェクションの2その後のラウンドがあります。抗BRCA2抗体を用いたイムノブロット分析によって判断されるように、我々は一貫して人間のBRCA2遺伝子の70％以上のサイレンシングを達成するための標準プロトコルへのこれらおよびその他の変更を使用しました。また、代わりに、従来の70〜100°Cおよび免疫ブロット法の他の技術的な最適化の55℃での細胞溶解物の変性は、無傷のBRCA2タンパク質の検出が可能であってもWH出発物質が非常に少量エン入手可能であるか、またはBRCA2タンパク質の発現レベルが非常に低い場合。ヒト細胞におけるBRCA2の効率的なサイレンシングは、腫瘍中の病原性BRCA2変異によって影響を受ける可能性がある新たな分子経路および細胞機能を調べるために、腫瘍細胞を含む、無傷のBRCA2と細胞内でBRCA2の機能を破壊するための貴重な戦略を提供しています。効率的なサイレンシングおよびBRCA2のような他の「大規模な」タンパク質の分析のためにこのプロトコルの適応が容易に達成する必要があります。

BRCA2（乳癌感受性遺伝子-2）遺伝子は、リコンビナーゼ酵素のRad51 ¹の機能を調節することにより、DNA二本鎖切断の修復に重要な役割を演じる腫瘍抑制タンパク質をコードします。 BRCA2はまた、転写の調節および細胞周期の制御²に関係しています。 BRCA2遺伝子に生殖細胞変異は、男性に女性と前立腺癌における乳癌および卵巣癌に常染色体優性の感受性を誘導するだけでなく、他の癌タイプ^3,4の素因。しかし、抑制またはDNA損傷^5-7を引き起こす化学療法剤に対する癌細胞の脆弱レンダリングしてもよいBRCA2の機能を低下させる癌、BRCA2変異を開発するリスクの増加にもかかわらず。 BRCA2タンパク質レベルの低下は、そのBRCA2タンパク質を示唆し、いくつかの癌の種類で検出されているものの、散発性の癌はBRCA2変異 （<3％）の低速度を示します非突然変異依存機構^7,8を介して散発性の癌において腫瘍形成の間に失われることがあります。したがって、完全に癌生物学の文脈において、ならびに他の生物学的環境においてBRCA2の機能を理解することが重要です。

哺乳動物細胞における遺伝子の新規な機能を識別するために使用される強力なツールは、その発現を抑制することです。一例として、正常上皮細胞の様々なBRCA2の発現を抑制することは、最近アノイキス耐性の調節、癌細胞浸潤性および転移能⁹の取得中に重要なステップとして、BRCA2の新規機能の同定につながりました。遺伝子サイレンシングは、細胞小干渉（SI）RNAまたは特定の遺伝子を標的とする短いヘアピン（SH）RNA分子のいずれかで導入することによって達成することができます。高いsiRNAの効力とその使いやすさは重要な生物学的プロセスに新たな洞察を得ることを目的とした実験をサイレンシングするため、それを優先ツールを作ります新たな治療標的を同定するためにND。しかし、遺伝子発現の効率的なノックダウンは、すべての遺伝子のために容易に達成できないことがあり、細胞の種類に応じて非常に変化してもよいです。細胞内タンパク質のレベルの減少は、調査中の最も関連性の表現型であるため、遺伝子産物の解析をイムノブロッティングにより遺伝子サイレンシングを定量化することが重要です。これに関しては、BRCA2タンパク質は、さらに課題を提示：大きなタンパク質（約390キロダルトン）をされ、技術的な困難が免疫ブロット法を含む、従来の生化学的解析のために存在します。

ここでは、ヒト上皮細胞株におけるBRCA2の効率的なサイレンシングのためと分析をイムノブロッティングによりノックダウンBRCA2タンパク質の迅速かつ成功した検出のために最適化されたプロトコルを報告しています。

1.のsiRNA溶液を調製します

1. 再懸 ​​濁5スクランブルのナノモル（Ctrlキー）とRNaseフリー水（最終siRNA濃度：50μM）の100μl中BRCA2 siRNAを乾燥したペレットの5ナノモル。これは、siRNAの株式であり、10μlのアリコートで-20℃で保存する必要があります。
2. siRNAのストックから10μLのアリコートを取り、10μMのsiRNA作業溶液を得るために、RNaseフリー水40μlを添加します。この希釈は、使用するまで-20℃で保存する必要があります。
   注：siRNAの作業溶液を3回以上解凍/凍結受けるべきではありません。

ヒト上皮細胞株の2播種

1. 37℃、5％CO ₂の加湿インキュベーター中で組織培養プレート中の細胞単層として増殖するヒト上皮細胞株から増殖培地を取り除き。
2. RT PBS（100ミリメートルプレートのための10mlのPBS）で1回プレートに細胞を洗浄します。
3. プレートから細胞を剥離するためには、0.25％トリプシン/ 0.53 mMのEDTA溶液2mlを添加し、細胞型に応じて3~5分間インキュベートします。
4. 剥離した細胞を回収する前に、10％ウシ胎児血清を含む完全増殖培地2mlを添加することによりトリプシンを中和します。
5. 15mlチューブに細胞を移します。
6. スイングバケットローターで4℃で3分間、320〜330×gで細胞を遠心します。
7. 抗生物質を含まない培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
8. Burkerチャンバー中または製造者の指示に従って、自動計数装置を用いて顕微鏡下で細胞を数えます。
9. 6ウェルプレート中で細胞を24時間（0.5〜1×10ウェルそれぞれについて、培地2mlで^6個の細胞）の後に約80％コンフルエントになるように種子。播種する細胞の最適数は、特定の細胞株および成長速度に応じて変化し得ます。
   注：抗生物質が負transfeの効率を妨害するので、この時点では、培地中の抗生物質を追加しないでくださいction。これは、BRCA2のsiRNAトランスフェクションの高い効率を達成するために、低培養継代（<10）の細胞であることが非常に重要です。

siRNAで3トランスフェクト細胞

1. 二十四時間細胞をプレーティングした後、トランスフェクションの最初のラウンドに進みます。
   1. 低血清培地130μlの脂質ベースの¹⁰特異的なsiRNAトランスフェクション試薬の6μLを希釈します。
   2. 低血清培地130μlの10μMのsiRNA（30ピコモル）の3μLを希釈します。
   3. 希釈されたトランスフェクション試薬で希釈したsiRNAを組み合わせて、室温で5〜10分間インキュベートします。
   4. インキュベーションの間、細胞から培地を除去し、37°C​​（抗生物質を含まない）に予め温めておいた新鮮な培地2mlを加えます。
   5. （この量は6ウェルプレートの1ウェルのためのものである）を細胞にsiRNAをトランスフェクション試薬複合体の250μlを添加します。
   6. 37の加湿インキュベーター中で細胞をインキュベート76; C、5％CO _2。
2. 24時間後、ステップ3.1.2には、次の変更で3.1.1-3.1.5の手順を繰り返すことにより、トランスフェクションの第二ラウンドを続行：低血清培地130μlの10μMのsiRNA（50ピコモル）の5μLを希釈します。
   1. 分析の前に、37℃で1〜2日間細胞をインキュベートします。
      注：トランスフェクションし、第二ラウンドで高いのsiRNA /トランスフェクション試薬比の使用の2ラウンドは、BRCA2サイレンシングの高効率を得るために不可欠です。

イムノブロット分析のための4を溶解細胞

1. 非イオン性、非変性洗剤オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、5mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、10mMのフッ化ナトリウム、2mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、を10μg/ mlのロイペプチン、10を1％含有PBS新鮮な溶解緩衝液（pH 7.4）を準備/ mlのアプロチニン。氷の上に保管してください。
2. 細胞およびWからメディアを削除しますプレート内の冷PBS（2ミリリットル/ウェル）で1回、それらを灰。任意のPBSのキャリーオーバーを防止するために、完全にプレートから取り外します。
3. 各ウェルに200μlの溶解緩衝液を追加します。
   注：細胞は、他のアッセイにも使用する必要がある場合、ステップ2.1〜2.6に記載し、使用する用途に応じて適切な緩衝液/培地中で細胞を再懸濁したように、細胞をトリプシン処理。
4. 静かに均一に溶解バッファーを配布し、回転子に4℃で15分間インキュベートする板を回転させます。
5. セルスクレーパーを用いて氷上でマイクロ遠心チューブ内の細胞溶解物を収集します。
6. 4℃で25分間、17,900×gで遠心分離し、新しいチューブに上清を収集します。
7. 製造業者の指示に従って市販のタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。

5. BRCA2のイムノブロット分析

1. Bを実行して20倍のトリス - 酢酸SDSの50ミリリットルを希釈することにより、ランニング緩衝液を調製します蒸留水950ミリリットルでuffer（50mMのトリシン、50mMのトリス塩基、0.1％SDS、pHは8.24）。
2. 次のように試料を調製：20の最終容量まで15全細胞溶解物のμgの、4×サンプルバッファー5μlのpHは8.4でドデシル硫酸リチウムを含む、10倍のサンプル還元剤（0.5 M DTT）を2μl、および溶解バッファーを追加μlの。
   注：（5μgのまで）全タンパク質のより少量を使用した場合、このプロトコルは、正常細胞株でBRCA2の検出を可能にします。
3. 10分間55℃でサンプルを変性。
   注：これは、55℃を使用することが重要です。 BRCA2タンパク質は感熱¹¹であるため、より高い変性温度は、無傷の完全長（390キロダルトン）BRCA2タンパク質の一貫した損失をもたらします。
4. 製造者の指示に従って電気泳動チャンバーを設定します。
5. サンプルおよびプレキャストゲル（トリス - 酢酸3から8パーセント）の高分子量プレ染色タンパク質標準の10μLをロードし、AB、120 Vで動作します2時間¹²アウト。 55kDaの青いマーカーがプレキャストゲルを離れる前に、電気泳動実行を停止します。
6. 20X転送バッファの50ミリリットル、100％メタノール850 mlの水100mlで転送バッファを準備します。
7. 蒸留水で洗浄し、少なくとも5分間、転写緩衝液中で平衡化し、5分間、100％メタノール中に浸漬することによりPVDF膜（0.45μmの孔径）をアクティブにします。使用するまで4℃で転送バッファ内の転送装置のスポンジを浸します。
8. 電気泳動の実行が終了すると、次の順序（ボトムアップ）での転送スタックのサンドイッチ組み立てる：転送バッファに飽和3スポンジを、1 3MMグレード紙は、転送バッファ、ゲル、活性化されたPVDF膜、1 3mmの飽和しますトランスファー緩衝液に飽和等級紙、転送バッファ^13,14飽和3スポンジ。装置内にスタックを配置し、4℃で一晩4℃で180 mAで4時間、350 mAでタンパク質を転送します。
   注：ビーイングBRCA2非常に大きなタンパク質は、高分子量のタンパク質の完全な移動を確実にするために、4時間または一晩に1時間（メーカー、最も転送プロトコルによって示唆されるように）からの転送時間を延長することが重要です。また、原因長い転送時間には、過熱を最小化し、サンドイッチ分解を容易にするために、4℃の冷室でブロッティングを行うことが必須です。セミドライトランスファーシステムは、大きなタンパク質を転送するための良いものではありません。
9. 転写後、TBSで膜を洗浄し、0.25％（TBS-T）を30μlの抗BRCA2ウサギポリクローナル抗体と共に4℃で一晩、5％脱脂粉乳およびプローブを含むTBS-Tween中で室温で1時間、それを阻止します（ [：300（v / v）の希釈液1] 9ミリリットルTBS-T + 5％脱脂粉乳中で希釈した200μg/ ml）を、。
10. その後TBS 10mlに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体の1μlの1時間、フィルターをインキュベートし、TBS-Tを用いて膜を3回（10分毎）で洗浄-T + 5％の脱脂粉乳。その後、TBS-Tで膜を3回（各10分）を洗浄します。
11. 製造業者の説明書に従って、増強化学発光（ECL）ウエスタンブロッティング検出試薬を用いて、BRCA2タンパク質を明らかにし、ECLによって免疫検出を実行します。高解像度ECLフィルム上immunochemiluminescentバンドを可視化。
12. 10 1,000抗チューブリン抗体（10μL：1に希釈したチューブリンをβに対するモノクローナル抗体を用いて、ローディングコントロールとして同じフィルタ上に、βチューブリン（55kDaの）のように、ハウスキーピング遺伝子に対する抗体を用いて免疫検出を行いますRTで1時間mlのTBS-T + 5％脱脂粉乳）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスの代わりに抗ウサギ二次抗体を使用したことを除き、洗浄し、BRCA2（5.10から5.11）について記載したように二次抗体をインキュベートします。
13. immunochemiluminescentバンドと感動フィルムのデジタル画像を取得し、専用の画像解析ソフトウェアによって、バンドの強度を分析する（ 例えば。、ImageJの）。

細胞の機能にサイレンシングBRCA2の影響を調べるために、生化学的/生物学的ア ​​ッセイに進む前に、最初のステップは、BRCA2のsiRNA（ 図1Aと並んでスクランブルsiRNA（非標的とするsiRNA）側を使用してサイレンシングの特異性を確認することです）。これは、BRCA2サイレンシングの高い効率を得るために高いのsiRNA /トランスフェクション比でsiRNAトランスフェクションの第二ラウンドを行うことが重要です。実際、siRNAトランスフェクションのいずれか一方のみのラウンドを行う以下ノックダウン効率（ 図1B）をもたらすであろう第二ラウンド（siRNAの25ピコモルおよびトランスフェクション試薬の6μL）でトランスフェクション率の低いsiRNAを用い。第二段階は、遺伝子サイレンシングの最高レベルを得るために最適な最小時間を評価することです。細胞型に依存し、これは、siRNAトランスフェクションの第二ラウンド後24及び48時間の間で変化してもよいです。例えば、24時間はNthyの甲状腺細胞には十分であるが、最大48時間はPNT1Aの前立腺細胞における効率的なBRCA2ノックダウン（ 図2A）のために必要とされている。BRCA2サイレンシングは、第二のトランスフェクションサイクル（ 図2B）7日後まで非常に安定です。注目すべきは、55℃（5分間、100℃）以上の温度で細胞溶解物を変性起因BRCA2 ¹¹の感熱性のBRCA2タンパク質（ 図2C）の最大50％の損失をもたらします。

最適な消音時間が確立されると、BRCA2タンパク質の損失の影響は、いくつかのアッセイにおいて利用することができます。 DNA損傷^15-18を引き起こす他の化学療法薬のと同様に、PARP阻害剤に対する感受性の増加を促進BRCA2の機能の喪失を引き起こし、インビボ変異ので、一般的なアッセイは、PARP阻害剤rucaparibにBRCA2 -silenced細胞の感受性を決定することですまたはoloparib。 図3に報告された実験では、PNT1A細胞はO枯渇しますsiRNAを介してFのBRCA2タンパク質は、細胞増殖をMTTベースの細胞増殖アッセイによって評価した後、24時間10μMのrucaparibで処理しました。 rucaparib処理後の細胞増殖の時間依存的減少BRCA2タンパク質の枯渇の結果（ 図3）。

トランスフェクション試薬の比は、図1のトランスフェクションと高siRNAの2ラウンドは、BRCA2のサイレンシングを改善します。 （A）BRCA2サイレンシングの特異性 BRCA2タンパク質レベルの比較対照として、スクランブルsiRNA（Ctrlキー）を使用して、トランスフェクションの第二ラウンドの後の分析の24時間を免疫ブロット法によりNthy細胞において確認されました。分子量マーカーを左側に報告されている。（B）PNT1A細胞はBRCA2秒の1または2サイクルに供しましたのiRNAのトランスフェクションプロトコル[サイクル（＃）1、2]で説明し、BRCA2タンパク質の枯渇は、免疫ブロット法により定量化したように。スクランブルsiRNAのトランスフェクションの2サイクルは、コントロール（Ctrlキー）として使用しました。図2bでは、PNT1A細胞は改変（25ピコモルのsiRNA /6μlのトランスフェクション試薬）として、第2サイクルでのトランスフェクション試薬の比が低いsiRNAを用いBRCA2 siRNAトランスフェクションの2サイクルに供しました。全ての場合において、BRCA2タンパク質レベルは、第二サイクルの後48時間で分析しました。下部には、BRCA2タンパク質レベルの定量化は、BRCA2 /チューブリン比として報告されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

BRCA2ノックダウンの 2の最適化を図。 （A）のOptimアルBRCA2ノックダウンは、第二のsiRNAトランスフェクションサイクル後に24〜48時間が必要な場合があります。 2つの異なる細胞株（PNT1AとNthy）が免疫ブロットにより、第2のsiRNAトランスフェクション後24時間サイクル、48時間のノックダウンBRCA2について評価しました。下部には、BRCA2タンパク質レベルは、一度に100のデータに設定0時間は、3つの独立した実験の平均±SEを表すレベルのパーセンテージとして報告されます。 （B）BRCA2ノックダウンは7日間安定です。 PNT1A細胞は、免疫ブロット法により第2のsiRNAトランスフェクションサイクル後196時間までBRCA2ノックダウンについて評価しました。チューブリン信号にBRCA2の割合は、底部に報告されている。（C）BRCA2タンパク質が感熱性です。非トランスフェクトPNT1A細胞（約70％コンフルエント）をプレーティング後24時間に採取し、プロトコールに従って溶解しました。同じ細胞溶解物（15μgの全タンパク質）の2つのアリコートを55℃で10分間または100＃のいずれかで変性し176; 5分およびBRCA2タンパク質レベルについてCがイムノブロッティングにより評価しました。底部には、チューブリン信号にBRCA2の比率が報告されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3 BRCA2サイレンシングは、PARP阻害剤rucaparibに対する細胞の感受性を増大させる。PNT1A細胞のいずれかの制御（CTRL）またはBRCA2 siRNAをトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後に回収し、96ウェルプレートに播種し（2000細胞/ウェル）。 24時間後、10μMのrucaparib、細胞を96時間までの薬剤の非存在下に維持した後、24時間細胞に添加しました。 690 nmの - 細胞増殖を、550での吸光度を測定することにより、MTTアッセイを用いて示された時間で評価しました。 EAC時間の時点では、代表的な実験からの3つのウェルの平均±SDを表します。 CtrlキーのsiRNA、青線; BRCA2 siRNAを、赤線。上部には、BRCA2 siRNAをトランスフェクトされた細胞におけるBRCA2タンパク質プロファイルが報告されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

女性と男性の乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、及びメラノーマ^3,4を含むいくつかの癌型のリスク増加にBRCA2遺伝子リードの生殖細胞変異は、多くの研究は、生物学的機能を理解するために行われているのでBRCA2タンパク質の。これらの研究のほとんどが原因BRCA2のような巨大なタンパク質の分析における技術的困難に遺伝ベースの主です。 BRCA2タンパク質の発現をサイレンシングし、分析するためのここに記載した方法は、生物学的ア ​​ッセイの広いスペクトルにBRCA2腫瘍抑制遺伝子の機能を研究するための効率的なツールを提供します。サイレンシングプロトコルは、標準的なsiRNAトランスフェクションの手順に基づいて、まだいくつかの重要な変更並びにBRCA2の成功と一貫性のノックダウンのためのヒントが含まれています。 siRNAトランスフェクションプロトコルは、安全で迅速かつ効率的で、異なる通常LENを利用したshRNAからですtiviralベクターは、特定の生物学的安全手順を必要とせず、容易に細胞培養設備を備えた任意の実験室で行うことができます。同様に、免疫ブロットプロトコルは、BRCA2のような大規模なタンパク質の効率的な検出のために最適化されています。免疫ブロットプロトコルはまた、異種酵母細胞⁹に発現された組換えヒトBRCA2タンパク質の検出のために検証されています。

siRNAの効率的な送達のためのいくつかの重要な要因は、ここで報告されています。これらは、特に第二サイクルにおける2つのトランスフェクションのサイクルおよびトランスフェクション試薬の比が高いのsiRNAを含みます。前とトランスフェクション手順中に抗生物質が存在しないことは、もう一つの重要な要因です。しかし、この手順は、細菌汚染のリスク増加に培養細胞を露出させます。このように余分な注意事項はすべてのステップで無菌性の高い標準を保証するために取られるべきです。なお、細胞の種類に応じて、効率的な遺伝子knockdoことWNは、典型的には、第2サイクル後に24〜48時間を必要とします。現在の方法は、少なくとも第二のトランスフェクションサイクル後7日目まで非常に安定した遺伝子サイレンシングを維持するという利点を有します。これは、異なる化学療法薬に対する細胞応答を含む生物学的ア ​​ッセイの様々なBRCA2ノックダウンの効果の研究を可能にします。しかし、本技術の制限は、外因性のsiRNA分子は、ゲノムに統合されていない、遺伝子発現の安定したノックダウンを達成することができないという事実によって示されます。あるいは、安定したノックダウンを取得するには、shRNAレンチウイルス感染症は、ラボを追加バイオセーフティ要件（NIHガイドラインに従ってBSL-2規格）のために準備されている場合に、実行することができます。トランスフェクションは、特定の細胞型（ 例えば 、Tリンパ球）における遺伝子機能を研究するために適用できる方法ではないときに加えて、セル固有の条件付きBRCA2ノックアウトマウスの使用は、alternままative ^19。

このメソッドは、レポートイムノブロット法による高分子量タンパク質の検出に成功するためのいくつかのヒントとは、高および低存在量タンパク質の両方に適しています。具体的には、原因BRCA2タンパク質の熱感受性に、より低い変性温度は、以前の研究¹¹と一致し、その最適な検出のために重要です。この技術的な「トリック」は、標準的なイムノブロットプロトコルによる検出が失敗証明されているために、他のタンパク質のために有用であり得ます。我々は、この方法は、一般的な妥当性のヒントが含まれているので、他の多くの挑戦のタンパク質のサイレンシングおよび検出を容易にすることができることを期待しています。

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.