Silenciamento de

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados ​​celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas "grandes" como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.

O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 ^1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em ^dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro ^3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de desenvolvimento de cancro, BRCA2 que suprimem ou reduzem a função BRCA2 pode tornar as células de cancro mais vulnerável a agentes quimioterapêuticos que provocam danos no DNA ^5-7. Cânceres esporádicos apresentam uma baixa taxa de mutações BRCA2 (<3%) que os níveis reduzidos de proteína BRCA2 foram detectados em alguns tipos de câncer, o que sugere que a proteína BRCA2podem ser perdidos durante a tumorigênese em cânceres esporádicos através de mecanismos não-mutacional-dependentes ^7,8. Assim, é importante compreender as funções BRCA2 no contexto da biologia do cancro, bem como em outras configurações biológicos.

Uma poderosa ferramenta utilizada para identificar novos funções de um gene em células de mamífero é silenciar a sua expressão. Como um exemplo, o silenciamento BRCA2 expressão numa variedade de células epiteliais normais levou recentemente à identificação de uma nova função de BRCA2 como regulador de resistência anoikis, um passo importante durante a aquisição de célula de cancro invasivo e metastático capacidade ^9. Gene silenciamento pode ser alcançado através da introdução nas células ou de interferência (Si) ou ARN pequeno gancho de cabelo curto (sh) moléculas de RNA alvo do gene específico. A alta potência de siRNA e sua facilidade de uso tornam a ferramenta preferencial para silenciar experiências destinadas a ganhar novos insights sobre processos biológicos críticos umnd para identificar novos alvos terapêuticos. No entanto, knockdown eficiente da expressão do gene pode não ser facilmente possível para todos os genes e pode ser altamente variável dependendo do tipo de célula. Porque a diminuição dos níveis de proteína intracelular é o fenótipo mais relevante sob investigação, que é fundamental para quantificar o silenciamento do gene por análise de imunotransf erência do produto do gene. Com este respeito, a proteína BRCA2 apresenta um desafio adicional: sendo uma proteína grande (cerca de 390 kDa), dificuldades técnicas existem para análise bioquímica convencional, incluindo a imunotransferência.

Nós relatamos aqui um protocolo otimizado para silenciamento eficiente do BRCA2 em linhas de células epiteliais humanas e para a detecção rápida e bem sucedida de proteína BRCA2 knockdown por immunoblotting análise.

1. Prepare soluções siRNA

1. Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul.
2. Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
   NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes.

2. Sementeira de linhas celulares epiteliais humanas

1. Remover o meio de crescimento de linhas celulares epiteliais humanas que crescem como monocamadas celulares em placas de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. Lavam-se as células na placa uma vez com PBS temperatura ambiente (10 ml de PBS para uma placa de 100 mm).
3. Para retirar as células a partir da placa,adicionar 2 ml de tripsina a 0,25% / solução de 0,53 mM de EDTA e incubar 3-5 minutos, dependendo do tipo de célula.
4. Antes de recolher as células destacadas, neutralizar a tripsina por adição de 2 ml de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino.
5. Transferir as células para um tubo de 15 ml.
6. Centrifugar as células a 320-330 x g durante 3 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante.
7. Ressuspender as peletes de células em 5 ml de meio livre de antibióticos.
8. Contar as células ao microscópio numa câmara de Burker, quer utilizando um sistema automatizado de contagem de acordo com as instruções do fabricante.
9. Semente as células em placas de 6 poços para ser cerca de 80% confluente após 24 horas (0,5-1 x 10 ⁶ células em 2 ml de meio para cada poço). O número de células óptimas a serem semeadas podem variar dependendo das linhas de células específicas e a taxa de crescimento.
   NOTA: Não adicionar antibióticos a médio neste momento porque os antibióticos irá interferir negativamente com a eficiência de transfection. É muito importante que as células estão na cultura de passagens baixas (<10) para atingir uma elevada eficiência de transfecção siRNA BRCA2.

3. Células de transfecção com siRNA

1. Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células, prosseguir com a primeira rodada de transfecção.
   1. Dilui-se 6 ul de ¹⁰ siRNA reagente de transfecção à base de lípidos específicos, em 130 ul de meio de soro reduzido.
   2. Dilui-se 3 ul de siRNA 10 uM (30 pmol) em 130 ul de meio de soro reduzido.
   3. Combinar o siARN diluiu-se com o reagente de transfecção diluído e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
   4. Durante a incubação, remover o meio das células e adicionar 2 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 ° C (sem antibióticos).
   5. Adicionar 250 ul de complexos de siRNA-reagentes de transfecção para as células (este valor é para um único poço de uma placa de 6 poços).
   6. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 3776; C com 5% de CO _2.
2. Após 24 horas, prosseguir com a segunda rodada de transfecção por passos 3.1.1-3.1.5 repetindo com a seguinte modificação para a etapa 3.1.2: diluir 5 ul de 10 mM siRNA (50 pmol) em 130 mL de meio de soro reduzido.
   1. Incubam-se as células durante 1-2 dias a 37 ° C antes da análise.
      NOTA: Duas rodadas de transfecções e uso de uma relação de reagente alta siRNA / transfecção na segunda rodada são essenciais para obter alta eficiência do BRCA2 silenciamento.

4. Lisar as células para análise de imunotransferência

1. Preparar tampão de lise fresco com PBS (pH 7,4) contendo 1% do não iónico, não-detergente desnaturante octilfenoxipolietoxietanol, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 ug / ml de leupeptina, 10 ug / ml de aprotinina. Mantê-lo em gelo.
2. Remover o meio das células e wash-los uma vez com PBS frio (2 ml / poço) na placa. Para evitar qualquer transição PBS, removê-la completamente a partir da placa.
3. Adicionar 200 ul de tampão de lise a cada poço.
   NOTA: Se as células têm de ser usado também para outros ensaios, trypsinize as células tal como descrito no passo 2,1-2,6 e ressuspender as células em tampão / meio apropriado de acordo com a aplicação a ser utilizada.
4. Rodar suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incubar durante 15 min a 4 ° C num rotor.
5. Recolhe-se o lisado celular num tubo de microcentrífuga em gelo usando um raspador de células.
6. Centrifugar a 17.900 xg durante 25 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num novo tubo.
7. Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

Análise immunoblotting 5. BRCA2

1. Preparar o tampão de corrida, diluindo 50 ml de 20x de Tris-Acetato de SDS execução bpode ser prejudicado (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% de SDS, pH 8,24) com 950 ml de água destilada.
2. Preparar a amostra como se segue: adicionar 15? G de lisado celular total, 5 uL de tampão de amostra 4x contendo sulfato de dodecilo de lítio, a pH 8,4, 2 mL de amostra de 10x agente redutor (DTT 0,5 M) e tampão de lise para um volume final de 20 ul.
   NOTA: Este protocolo permite a detecção de BRCA2 em linhas de células normais, também quando se utiliza uma menor quantidade de proteínas totais (inferior a 5 ug).
3. Desnaturar amostras a 55 ° C durante 10 min.
   NOTA: É fundamental usar 55 ° C. Desde que a proteína BRCA2 é termossensível ^11, as temperaturas de desnaturação mais elevadas resultam em perda consistente dos intacto de comprimento completo (390 kDa) da proteína BRCA2.
4. Defina-se a câmara de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
5. Coloque as amostras e 10 ul de alto peso molecular pré-corados padrão de proteína em um gel precasted (Tris-Acetato de 3-8%) e executado em 120 V para aba 2 horas ^12. Parar a corrida eletroforética antes do 55 kDa marcador azul deixa o gel precasted.
6. Preparar o tampão de transferência com 50 ml de tampão de transferência 20x, 100 ml de metanol a 100% e 850 ml de água.
7. Activar a membrana de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) por imersão em 100% de metanol durante 5 minutos, enxaguar com água destilada e equilibrar em tampão de transferência, pelo menos, durante 5 min. Soak as esponjas do aparelho de transferência com tampão de transferência a 4 ° C até à sua utilização.
8. Quando a corrida eletroforética é longo, montar o sanduíche na pilha de transferência na seguinte ordem (bottom-up): três esponjas saturadas em tampão de transferência, uma folha de papel 3MM grau saturado em tampão de transferência, o gel, membrana PVDF ativado, um 3MM folha de papel grau saturado em tampão de transferência, três esponjas saturado em tampão de transferência ^13,14. Colocar a pilha no aparelho e as proteínas de transferência em 350 mA durante 4 horas a 4 ° C ou a 180 mA durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: Ser BRCA2 uma proteína muito grande, é crucial para estender o tempo de transferência de 1 hora (tal como sugerido pelo fabricante, e a maioria dos protocolos de transferência) a 4 horas ou durante a noite para assegurar a transferência completa de proteínas de alto peso molecular. Além disso, devido ao longo tempo de transferência, que é essencial para realizar o blotting numa sala fria a 4 ° C para minimizar o sobreaquecimento e facilitar a desmontagem sanduíche. Sistemas de transferência semi-secas não são bons para a transferência de grandes proteínas.
9. Após a transferência, lavar a membrana com TBS, bloqueá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente em TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contendo 5% de leite seco sem gordura e a sonda durante a noite a 4 ° C com 30 ul de anti-anticorpo policlonal de coelho BRCA2 ( 200 ug / ml), diluído em 9 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro [1: 300 (v / v)] de diluição.
10. Lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T, em seguida, o filtro incubar durante 1 hora com 1 ml de peroxidase de rábano conjugado com anti-anticorpo secundário de coelho diluído em 10 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro. Em seguida, lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T.
11. Realizar imunodetecção por ECL para revelar proteína BRCA2 usando quimioluminescência aumentada (ECL) de Reagente de Detecção de Western Blotting, seguindo as instruções do fabricante. Visualize bandas imunoquimioluminométricos sobre filmes de alta resolução ECL.
12. Realizar imunodetecção com um anticorpo para um gene de manutenção, como β-tubulina (55 kDa), no mesmo filtro como controlo de carga, utilizando um anticorpo monoclonal para β-tubulina diluído a 1: 1000 (10 ul de anticorpo anti-tubulina em 10 ml de TBS-T + 5% de leite seco não gordo) durante 1 h à TA. Lavar e incubar o anticorpo secundário como descrito para BRCA2 (5,10-5,11), excepto na utilização de peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho.
13. Adquirir uma imagem digital dos filmes impressionados com bandas imunoquimioluminométricos e analisar a intensidade da banda por imagem dedicada software de análise (por exemplo,., ImageJ).

Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização de apenas uma rodada de siRNA transfecção ou usando uma siRNA inferior à relação de transfecção na segunda rodada (25 pmol de siRNA e 6 ul de reagente de transfecção) resultaria em menor eficiência knockdown (Figura 1B). O segundo passo é avaliar o tempo mínimo óptimo para conseguir o mais alto nível de silenciamento do gene. Dependendo do tipo de célula, esta pode variar entre 24 e 48 horas após a segunda ronda de siRNA transfecção. Por exemplo, 24 horas são suficientes para células da tireóide Nthy mas até 48h são necessários para knockdown eficiente BRCA2 em células da próstata PNT1A (Figura 2A). BRCA2 silenciamento é bastante estável até ao dia 7 após o segundo ciclo de transfecção (Figura 2B). De nota, desnaturar os lisados ​​de células a uma temperatura acima de 55 ° C (100 ° C durante 5 min), os resultados em até 50% de perda de proteína BRCA2 (Figura 2C), devido à termossensibilidade BRCA2 ^11.

Uma vez que esteja estabelecido o tempo silenciamento óptima, os efeitos da perda de proteína BRCA2 pode ser explorado em diversos ensaios. Uma vez que mutações in vivo que causam a perda de função de BRCA2 promover o aumento de sensibilidade a inibidores de PARP, bem como para outros fármacos quimioterapêuticos que provocam danos no DNA ^15-18, um ensaio comum para determinar se a sensibilidade das células -silenced BRCA2 para o inibidor de PARP rucaparib ou oloparib. Na experiência relatada na Figura 3, as células PNT1A esgotado of proteína BRCA2 através de siRNA foram tratadas com 10? M rucaparib durante 24 horas, após o que a proliferação celular foi avaliada por um ensaio de proliferação celular baseado em MTT. Depleção de proteína resulta em BRCA2 uma diminuição dependente do tempo na proliferação de células após o tratamento rucaparib (Figura 3).

Figura 1. Duas rondas de transfecção e alta siARN a proporção de reagente de transfecção melhorar BRCA2 silenciamento. (A) Especificidade do BRCA2 silenciamento foi confirmada em células Nthy análise por immunoblotting 24 horas após a segunda rodada de transfecção, usando siRNA mexidos (Ctrl) como controle para comparação dos níveis de proteína BRCA2. Marcadores de peso molecular são apresentados à esquerda. (B) células PNT1A foram submetidos a um ou dois ciclos de BRCA2 sRNAi transfecção como descrito no protocolo [Ciclos (#) 1 e 2], e a proteína BRCA2 depleção foi quantificada por imunoblotting. Dois ciclos de transfecção com siRNA mexidos foram utilizados como controle (Ctrl). Em 2b, células PNT1A foram sujeitos a dois ciclos de transf ecção usando um BRCA2 siRNA siRNA inferior à relação de reagente de transfecção, no segundo ciclo, de uma modificação (25 pmol siRNA / 6 ul de reagente de transfecção). Em todos os casos, os níveis de proteína BRCA2 foram analisadas 48 h após o segundo ciclo. No fundo, a quantificação dos níveis de proteína BRCA2 é relatado como proporção BRCA2 / Tubulin. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Otimização do BRCA2 knockdown. (A) Optimai BRCA2 knockdown pode levar entre 24 a 48 h após o segundo ciclo de siRNA transfecção. Duas linhas de células diferentes (PNT1A Nthy) e foram avaliados para BRCA2 knockdown 24 h e 48 h após o segundo ciclo de siRNA transfecção por análise de imunotransferência. Na parte inferior, os níveis de proteína BRCA2 são apresentados como percentagem dos níveis no tempo 0 h, fixado em 100. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. (B) knockdown BRCA2 é estável durante 7 dias. PNT1A células foram avaliadas para BRCA2 knockdown até 196 horas após o segundo ciclo de transfecção siRNA por imunotransferência. A proporção de sinal para BRCA2 tubulina é relatado na parte inferior. (C) proteína BRCA2 é termossensível. PNT1A células não transfectadas foram colhidas 24 h após o plaqueamento (cerca de 70% de confluência) e lisadas de acordo com o protocolo. Duas aliquotas do mesmo ligado de células (15 ^ g de proteínas totais) foram desnaturadas, quer a 55 ° C durante 10 minutos ou a 100 & #176; C durante 5 min e os níveis de proteína BRCA2 foram avaliadas por imunotransferência. Na parte inferior, a proporção de sinal para BRCA2 tubulina é relatado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. BRCA2 silenciamento aumenta a sensibilidade celular para a rucaparib inibidor de PARP. As células PNT1A ou transfectadas com controlo (Ctrl) ou BRCA2 siRNA foram colhidas 48 h após a transfecção e semeadas em placa de 96 poços (2000 células / poço). Após 24 h, 10 | iM rucaparib foi adicionado às células durante 24 horas, após o que as células foram mantidas na ausência da droga até 96 horas. A proliferação celular foi avaliada no momento indicado, utilizando o ensaio de MTT através da medição da absorvância a 550-690 nm. Eacalínea h tempo representa a média ± DP de três poços de uma experiência representativa. Ctrl siRNA, linha azul; BRCA2 siRNA, linha vermelha. No topo, perfil de proteínas em células BRCA2 BRCA2 siRNA transfectadas é relatado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma ^3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui para silenciar e analisando a expressão da proteína BRCA2 proporciona uma ferramenta eficiente para investigar as funções do gene supressor de tumor BRCA2 em um amplo espectro de ensaios biológicos. O protocolo de silenciamento é baseado em procedimentos de transfecção padrão siRNA ainda contém várias modificações cruciais, bem como dicas para knockdown bem sucedida e consistente de BRCA2. O protocolo de transfecção siRNA é seguro, rápido e eficiente e, ao contrário dos shRNA, que normalmente faz uso do lenvetores tiviral, não precisa de procedimentos de biossegurança específicas e pode ser facilmente realizado em qualquer laboratório equipado com uma instalação de cultura de células. Da mesma forma, o protocolo de imunotransferência foi optimizado para a detecção eficiente de uma grande proteína, como BRCA2. O protocolo de imunotransferência foi também validado para a detecção de proteína BRCA2 humano recombinante expresso de forma heteróloga em células de levedura ^9.

Vários fatores importantes para a prestação eficiente de siRNA são relatados aqui. Eles incluem dois ciclos de transf ecções e uma elevada proporção de siRNA para o reagente de transfecção, especialmente no segundo ciclo. Ausência de antibióticos antes e durante o procedimento de transfecção é outro fator crítico. No entanto, este processo expõe as células em cultura a um maior risco de contaminação bacteriana; portanto, devem ser tomadas precauções extras para garantir um alto padrão de esterilidade em todas as etapas. Deve notar-se que, dependendo do tipo de célula, knockdo gene eficientewn requererá tipicamente 24-48 horas após o segundo ciclo. O actual método tem a vantagem de manter silenciamento de genes completamente estável pelo menos até sete dias após o segundo ciclo de transfecção. Isto permite o estudo dos efeitos de BRCA2 knockdown em uma variedade de ensaios biológicos, incluindo a resposta celular a fármacos quimioterapêuticos diferentes. No entanto, uma limitação da presente técnica é representada pelo facto de que as moléculas de siRNA exógenos não se integram no genoma, knockdown assim estável de expressão do gene não pode ser alcançado. Alternativamente, para obter knockdown estável, infecção lentiviral shRNA pode ser realizada, desde que o laboratório está preparado para exigências de biosegurança adicionais (BSL-2 normas de acordo com as directrizes de NIH). Além disso, quando a transfecção não é uma abordagem aplicável para estudar a função de genes em células de um tipo específico (por exemplo., Linfócitos T), a utilização de ratinhos knockout condicional Brca2 específicos de células permanece a única alternAtive ^19.

Este método relatórios também várias dicas para detecção bem-sucedida de uma proteína de alto peso molecular por immunoblotting e é conveniente para ambas as proteínas de alta e baixa abundância. Em particular, devido à termossensibilidade a proteína BRCA2, uma temperatura mais baixa de desnaturação é crítico para a sua detecção óptima, de acordo com um estudo anterior ^11. Este "truque" técnico pode também ser útil para outras proteínas para as quais a detecção por protocolos padrão immunoblotting foi provado sem êxito. Prevemos que este método contém dicas de validade geral e, portanto, pode facilitar o silenciamento e detecção de muitas outras proteínas desafiadoras.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.